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제안 방법
- fortuitum (ATCC 6841)은 연세대학교 임상병리학과에서 제공된 균주를 이용하였으며, 배양한 균체에 lysozyme을 5 mg/ml로 가하여 37 °C 에서 1 시간, 1 mg/ml의 proteinase K 및 1% SDS를 가하여 55°C에서 24시간 반응시켰다. Cetyl Trime- thyl Ammonium Bromide (CUB)를 첨가하여 65 °C 에서 10 분간 반응시키고 페놀 처리 및 에탄올 침전하여 DNA를 얻었다.
- Two-tube nested PCR 반웅액으로는 총 20 u1 내에 Bioneer premix, 각각 10 pm이의 primer와 주형 DNA 5 u1를 첨가하였다. PCR 조건은 primer (Rl, R2, R3, R4)를 이용하여 pre-denaturation 을 94°C에서 5분간 1회 수행한 후에 94°C에서 30초 denaturation, 65 °C 에서 30초 annealing, 72 °C 에서 60초 extension으로 15회 실시한 후 다시 94 °C 30초, 52 °C 30 초, 72°C 60초로 35회 반복하고, 72°C에서 10분간 post- extension을 실시하였다.
- 증폭된 유전자 산물은 2% agarose gel 상에서 전기영동을 수행하여 관찰하였고, ethidium bromide (EtBr, Sigma, USA)로 DNA의 염색을 실시하였다. PCR 증폭 여부와 증폭산물의 크기는 Gel Doc EQ (Bio Rad, USA)을 이용하여 관찰하였고, DNA size marker로는 100 bp DNA ladder (Bioneer, Daejeon, Korea)를 사용하였다.
- 나균 DNA의 repetitive sequence (GenBank Accession No. AL583917) 중에서 National Center for Biotechnology infor mation (NCBI)에서 제공되는 Blast search를 통하여 유사염기 서열을 추출한 후 MultAlin program을 이용하여 분석하였다. 그 결과, 예상되는 증폭산물이 각각 272-bp, 230・bp의 크기가 되도록 R1 (5--CGGGGTAGGGGCGTT- TTAGT-3')과 R2 (5'-CTAGAAGGTTGCCGTATGTG-3') 그리고 R3 G'-GCGTTTTAGTGTGCATGTCAS')와 R4 (5'- GGATCATCGArGCACTGTTC-3') 2쌍의 primer를 제직.
- 나균 검줄을 위한 one-tube nested PCR법과 single PCR 법의 민감도를 비교 분석하기 위해 leprae strain 4264 DNA를 연속적으로 10배씩 희석한 후 PCR의 template DNA로 각각 사용하였다. 그 결과 single PCR에서는 1 pg 이상에서 증폭되었으나, one tube nested PCR에서는 1 fg 이상에서 RLEP 유전자가 증폭되는 것을 확인할 수 있었다 (Fig.
- 나균만을 특이적으로 진단하기 위하여 제작된 RLEP primer 쌍은 one-tube nested PCR 모두에서 M. leprae 에만 특이적으로 반응을 하였고, 대조군으로 사용한 M. tuber- culosis를 포함한 15종의 Mycobacterium과는 반응을 하지 않았다. 이러한 결과로 보아 RLEP primer 쌍을 이용한 PCR법은 나균에 대한 진단의 특이성이 높다는 점을 확인할 수 있었다.
- 나병 환자의 피부조직에서 추출된 DNA로부터 RLEP 의 특이 유전자 검출을 실시하였다. 일반적으로 one-tube nested PCR법으로 증폭한 DNA의 양이 single PCR 법으로 검출한 것보다 많아 전기영동상에서 증폭한 DNA보다 뚜렷하게 관찰할 수 있었다 (Fig.
- 따라서 본 연구에서는 2번의 PCR을 별도로 사용하는 two-tube nested PCR을 변형하여 1번의 PCR을 수행하되, 2쌍의 primer를 같은 tube 안에 넣어서 순차적으로 증폭시키는 방법인 one-tube nested PCR을 사용한 나균 검줄법의 민감도 및 특이도를 기존의 PCR법인 single PCR과 비교함으로써 one-tube nested PCR의 나병의 진단에서의 유용성을 평가하였다.
- leprae에만 특이적으로 반응하는지를 조사하기 위해 15개의 Mycobacterium spp.로부터 분리한 대조용 DNA를 대상으로 one-tube nested PCR을 각각 수행하였다. 그 결과나 균에서 만 특이적으로 RLEP 유전자 단편이 증폭되었으며, 대조군으로 사용한 DNA에서는 모두 증폭되지 않았다 (Fig.
- , 2003). 반웅조건으로는 먼저 pre-denaturation을 94°C 에서 5분간 1회 수행한 후에, 94°C에서 45초 denaturation, 64 °C 에서 58 °C 까지 1°C 씩 감소시키면서 7회 동안 반복 시행한 후에 다시 94°C에서 45초 denaturation, 58°C에서 45초 annealing, 72 °C 에서 90초 extension으로 35회 실시하였다. 유전자 증폭기는 GeneAmp 2700 (Applied Biosystems,USA)를 사용하였다.
- 비교실험을 위해 이용된 Single PCR은 Touch-Down (TD) PCR로, 예상되는 증폭산물은 129-bp 크기가 되도록 F (5, -TGCATGTCATGGCCTTGAGG-3)와 R (5'-CACCG- AIACCAGCGGCAGAAS)의 primer# 이용하였다 (Kang et al., 2003). 반웅조건으로는 먼저 pre-denaturation을 94°C 에서 5분간 1회 수행한 후에, 94°C에서 45초 denaturation, 64 °C 에서 58 °C 까지 1°C 씩 감소시키면서 7회 동안 반복 시행한 후에 다시 94°C에서 45초 denaturation, 58°C에서 45초 annealing, 72 °C 에서 90초 extension으로 35회 실시하였다.
- 유전자 증폭기는 GeneAmp 2700 (Applied Biosystems,USA)를 사용하였다. 증폭된 유전자 산물은 2% agarose gel 상에서 전기영동을 수행하여 관찰하였고, ethidium bromide (EtBr, Sigma, USA)로 DNA의 염색을 실시하였다. PCR 증폭 여부와 증폭산물의 크기는 Gel Doc EQ (Bio Rad, USA)을 이용하여 관찰하였고, DNA size marker로는 100 bp DNA ladder (Bioneer, Daejeon, Korea)를 사용하였다.
대상 데이터
- M. avium (ATCC 25291), M. kansasii (ATCC 12478), M. chelonae (ATCC 35749), M. intracellulare (ATCC 13950), M. terrae (ATCC 15755), M. triviale (ATCC 23292), M. scrojul- aceum (ATCC 19981), M. celatum (ATCC 51130), M. szulgai (ATCC 35799), M. africanum (ATCC 25420), M. marinum (ATCC 927), M. mucogenicum (ATCC 49650), M. abscessus (ATCC 19977), M. tuberculosis H37RV and M. fortuitum (ATCC 6841)은 연세대학교 임상병리학과에서 제공된 균주를 이용하였으며, 배양한 균체에 lysozyme을 5 mg/ml로 가하여 37 °C 에서 1 시간, 1 mg/ml의 proteinase K 및 1% SDS를 가하여 55°C에서 24시간 반응시켰다. Cetyl Trime- thyl Ammonium Bromide (CUB)를 첨가하여 65 °C 에서 10 분간 반응시키고 페놀 처리 및 에탄올 침전하여 DNA를 얻었다.
- 9X109 bacilli/ mg 포함)을 제 공받아 QIAamp DNA Mini Kit (Tissue pro tocol; Qiagen GmbH, Hilden, Germary) 를 이용하여 DNA를 분리하고, 최종농도를 50 ng/nl로 하여 사용하였다. 임상검체 평가에 이용된 DNA는 한센병연구원에서 나병 환자들로부터 채취한 피부생검조직을 QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen GmbH, Hilden, Germany)를 이용하여 주줄한 DNA를 제공받아 사용하였다.
- 표준균주로 사용된 M. leprae strain 4264는 Colorado State University에서 정제된 100 mg 평균 2.9X109 bacilli/ mg 포함)을 제 공받아 QIAamp DNA Mini Kit (Tissue pro tocol; Qiagen GmbH, Hilden, Germary) 를 이용하여 DNA를 분리하고, 최종농도를 50 ng/nl로 하여 사용하였다. 임상검체 평가에 이용된 DNA는 한센병연구원에서 나병 환자들로부터 채취한 피부생검조직을 QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen GmbH, Hilden, Germany)를 이용하여 주줄한 DNA를 제공받아 사용하였다.
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