RT-PCR과 nested PCR을 이용한 Nepovirus속 식물검역 바이러스 4종의 정밀진단 Development of RT-PCR and Nested PCR for Detecting Four Quarantine Plant Viruses Belonging to Nepovirus원문보기
본 연구에서는 식물검역바이러스 4종(TBRV, ArMV, CLRV 및 GFLV)을 RT-PCR과 nested PCR 방법으로 진단 할 수 있는 방법을 개발하였다. 본 연구에서 개발한 방법은 모두 같은 PCR 조건으로 검사자에게 편리성과 신속성을 높여줄 뿐 아니라, 돌연변이-양성대조구의 사용으로 실험 오염여부를 확인할 수 있어 더욱 정확하다. 개발한 방법으로 최근 3년 Nepovirus속 4종의 바이러스를 검사한 결과, 27건을 검출하여 검역처분 하였다. 본 연구 결과들은 앞으로도 수출입 식물에서 해당 바이러스들을 신속, 정밀하게 진단할 수 있는 방법으로 활용할 수 있을 것으로 기대된다.
본 연구에서는 식물검역바이러스 4종(TBRV, ArMV, CLRV 및 GFLV)을 RT-PCR과 nested PCR 방법으로 진단 할 수 있는 방법을 개발하였다. 본 연구에서 개발한 방법은 모두 같은 PCR 조건으로 검사자에게 편리성과 신속성을 높여줄 뿐 아니라, 돌연변이-양성대조구의 사용으로 실험 오염여부를 확인할 수 있어 더욱 정확하다. 개발한 방법으로 최근 3년 Nepovirus속 4종의 바이러스를 검사한 결과, 27건을 검출하여 검역처분 하였다. 본 연구 결과들은 앞으로도 수출입 식물에서 해당 바이러스들을 신속, 정밀하게 진단할 수 있는 방법으로 활용할 수 있을 것으로 기대된다.
For quarantine purpose, we developed the RT- and nested PCR module of Tomato black ring virus (TBRV), Arabis mosaic virus (ArMV), Cherry leafroll virus (CLRV) and Grapevine fanleaf virus (GFLV). The PCR modules, developed in this study make diagnosis more convenient and speedy because of same PCR co...
For quarantine purpose, we developed the RT- and nested PCR module of Tomato black ring virus (TBRV), Arabis mosaic virus (ArMV), Cherry leafroll virus (CLRV) and Grapevine fanleaf virus (GFLV). The PCR modules, developed in this study make diagnosis more convenient and speedy because of same PCR condition. And also, the methods are more accurate because it can check whether the result is contamination or not using the mutation-positive control. We discard or return the 27 cases of Nepovirus infection seed by employing the module past 3 years. This study provides a rapid and useful method for detection of four quarantine plant viruses.
For quarantine purpose, we developed the RT- and nested PCR module of Tomato black ring virus (TBRV), Arabis mosaic virus (ArMV), Cherry leafroll virus (CLRV) and Grapevine fanleaf virus (GFLV). The PCR modules, developed in this study make diagnosis more convenient and speedy because of same PCR condition. And also, the methods are more accurate because it can check whether the result is contamination or not using the mutation-positive control. We discard or return the 27 cases of Nepovirus infection seed by employing the module past 3 years. This study provides a rapid and useful method for detection of four quarantine plant viruses.
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문제 정의
그러나 검사과정에 소요되는 시간, 낮은 민감도 및 거짓양성반응 등의 문제점이 발견되었으며(Caruso 등, 2003; Priou 등, 2006) 최근에는 항혈청검사법이 핵산검사법으로 변화되고 있는 추세이다(Kim 등, 2000; Kim 등, 2005; Lee 등, 2011a, 2011b; Park 등, 2004). 따라서 본 연구에서는 식물검역 Nepovirus속 4종의 바이러스들을 RT-PCR과 nested PCR을 사용하여, 신속하고 정확하게 진단 할 수 있는 방법을 개발하였다.
본 연구에서는 식물검역바이러스 4종(TBRV, ArMV, CLRV 및 GFLV)을 RT-PCR과 nested PCR 방법으로 진단 할 수 있는 방법을 개발하였다. 본 연구에서 개발한 방법은 모두 같은 PCR 조건으로 검사자에게 편리성과 신속성을 높여줄 뿐 아니라, 돌연변이-양성대조구의 사용으로 실험 오염여부를 확인할 수 있어 더욱 정확하다.
제안 방법
RNA를 주형으로 cDNA 합성은 42℃에서 60분 후 60℃에서 10분 반응하였으며, PCR 조건은 RT-PCR의 역전사 반응을 제외한 나머지 반응과 같게 하였다. PCR 산물은 1X TAE buffer를 이용하여 1.2% agarose gel에서 80분 전기영동 후 ethidium bromide로 염색하여 UV 하에서 확인하였다. PCR 증폭산물에 대한 nested 프라이머 조합을 설계하였으며, 1차 PCR 산물을 1/100 희석하여 1 μl를 주형으로 사용하였고 나머지 조건은 위의 PCR 조건과 동일하게 반응하였다.
PCR 증폭산물에 대한 nested 프라이머 조합을 설계하였으며, 1차 PCR 산물을 1/100 희석하여 1 μl를 주형으로 사용하였고 나머지 조건은 위의 PCR 조건과 동일하게 반응하였다.
PCR은 위에서 추출한 기주의 genomic DNA 1 μl를 주형으로 정방향과 역방향 프라이머(25 pmol)를 각각 1 μl, DW 7 μl 및 nested-PCR kit(Plutos, Korea) 10 μl로 전체 20 μl로 실시하였다.
RT-PCR은 추출한 total RNA 1 μl를 주형으로, 설계된 정방향과 역방향 프라이머(25 pmol)를 각각 1 μl, DW(Sigma, USA) 7 μl 및 RT-PCR preMixture(Plutos, Korea) 10 μl로 전체 20 μl로 수행하였다.
각각의 바이러스에 대하여 두 세트씩 선발된 프라이머 조합들을 모두 포함하는 PCR 산물을 증폭하였으며, 증폭산물은 TBRV(2,999 bp), ArMV(1,443 bp), CLRV(1,497 bp) 및 GFLV(1,656 bp)였다. 증폭산물을 insert DNA로 pGEM®-T Easy Vector를 사용하여 클로닝 하였다(Promega, USA).
감염시료에서 total RNA의 추출과 기주의 genomic DNA 추출은 SolGent RNA mini prep kit(Solgent, Korea), RNA-spinTMIIp RNA extraction kit(iNtRON, Korea) 및 DNeasy® Plant mini kit(Qiagen, Netherlands)를 사용하였다(Lee 등, In press).
다운로드 한 염기서열들은 DNAMAN DNA analysis software package(DNAMAN version 6.0; Lynnon Biosoft, Canada)를 사용하여 sequence alignment 후 annealing temperature 51−59℃를 조건으로 종 특이적인 염기서열을 탐색하였다(Pan 등, 2000) (Table 2).
바이러스 별로 2 sets 씩의 RT-PCR을 선발하였으며, 이에 대한 nested 조합을 선발하였다. RT-PCR과 nested PCR 결과, TBRV(set 1, 510→313; set 2, 662→307 bp), ArMV(set 1, 773→385; set 2, 780→487 bp), CLRV(set 1, 673→313; set 2, 633→479 bp) 및 GFLV(set 1, 699→430; set 2, 582→289 bp)에 각각 특이적 밴드를 형성하였으며(Table 3, Fig.
식물검역 바이러스 4종의 진단용 프라이머를 설계하기 위하여, 미국 국립생물정보센터(National Center for Biotechnology Information)로부터 검사법 개발 대상 바이러스인 TBRV(AY157994), ArMV(NC_006056), CLRV(S84125) 및 GFLV(NC_003623)와 각각의 바이러스와 분류학적으로 유사한 바이러스들의 염기서열을 다운로드 하였다. 다운로드 한 염기서열들은 DNAMAN DNA analysis software package(DNAMAN version 6.
증폭산물을 insert DNA로 pGEM®-T Easy Vector를 사용하여 클로닝 하였다(Promega, USA). 양성대조구로 선발된 클론을 대상으로, nested 프라이머 증폭부위 안쪽으로 제한효소인 Xho I이 반응할 수 있는 염기서열(CTCGAG, 6 bp)을 Site-Directed Mutagenesis Kit를 사용하여 삽입하였다(Nelson과 McClelland, 1992). 제작된 플라스미드는 염기서열 분석결과 프라이머 부착 부위가 확인되었으며(data not shown), 양성대조구로 사용할 돌연변이-양성대조구는, 제한 효소 Xho I을 처리하여 6개의 염기서열에 대한 삽입 여부를 확인하였다(Fig.
양성대조구로 선발된 클론을 대상으로, nested 프라이머 증폭부위 안쪽으로 제한효소인 Xho I이 반응할 수 있는 염기서열(CTCGAG, 6 bp)을 Site-Directed Mutagenesis Kit를 사용하여 삽입하였다(Nelson과 McClelland, 1992). 제작된 플라스미드는 염기서열 분석결과 프라이머 부착 부위가 확인되었으며(data not shown), 양성대조구로 사용할 돌연변이-양성대조구는, 제한 효소 Xho I을 처리하여 6개의 염기서열에 대한 삽입 여부를 확인하였다(Fig. 3).
증폭산물을 insert DNA로 pGEM®-T Easy Vector를 사용하여 클로닝 하였다(Promega, USA).
대상 데이터
검사법 개발대상 바이러스(TBRV, ArMV, CLRV 및 GFLV) 4종이 감염되어 있는 식물의 조직을 국립식물검역원(현 농림축산검역본부)의 금지품 수입허가를 통해 수입하였다(ADGEN, England). 실험에 사용된 Alfalfa mosaic virus(AMV) 외 34종의 cDNA는 국내 기업(PLUTOS, Korea)에서 구매하여 실험에 활용하였으며(Table 1), 모든 시료들은 −80℃ 초저온 냉동고에 보관하였다.
실험에 사용된 Alfalfa mosaic virus(AMV) 외 34종의 cDNA는 국내 기업(PLUTOS, Korea)에서 구매하여 실험에 활용하였으며(Table 1), 모든 시료들은 −80℃ 초저온 냉동고에 보관하였다.
우리는 이 중 Nepovirus속 4종의 식물검역 바이러스, Tomato black ring virus (TBRV), Arabis mosaic virus (ArMV), Cherry leafroll virus(CLRV) 및 Grapevine fanleaf virus (GFLV)를 선택하였다. TBRV는 약 28 nm의 지름을 가지는 구형의 바이러스로(Murant, 1970), 선충을 벡터로 산딸기, 딸기 및 복숭아 일부 품종에 감염된다.
데이터처리
본 연구에서 개발한 방법은 모두 같은 PCR 조건으로 검사자에게 편리성과 신속성을 높여줄 뿐 아니라, 돌연변이-양성대조구의 사용으로 실험 오염여부를 확인할 수 있어 더욱 정확하다. 개발한 방법으로 최근 3년 Nepovirus속 4종의 바이러스를 검사한 결과, 27건을 검출하여 검역처분 하였다. 본 연구 결과들은 앞으로도 수출입 식물에서 해당 바이러스들을 신속, 정밀하게 진단할 수 있는 방법으로 활용할 수 있을 것으로 기대된다.
성능/효과
RT-PCR과 nested PCR 결과, TBRV(set 1, 510→313; set 2, 662→307 bp), ArMV(set 1, 773→385; set 2, 780→487 bp), CLRV(set 1, 673→313; set 2, 633→479 bp) 및 GFLV(set 1, 699→430; set 2, 582→289 bp)에 각각 특이적 밴드를 형성하였으며(Table 3, Fig. 1), 염기서열 유사 바이러스, 공통 기주에 감염 될 수 있는 바이러스 및 기주의 genomic DNA에서 비특이 적인 반응이 나타나지 않았다(data not shown).
또한 RT-PCR 조합들은 TBRV(set 1, 10−3; set 2, 10−1), ArMV(set 1, 10−3; set 2, 10−4), CLRV(set 1, 10−5; set 2, 10−4) 및 GFLV(set 1, 10−2; set 2, 10−3)의 민감도를 보였다(Fig. 2).
본 연구에서는 식물검역바이러스 4종(TBRV, ArMV, CLRV 및 GFLV)을 RT-PCR과 nested PCR 방법으로 진단 할 수 있는 방법을 개발하였다. 본 연구에서 개발한 방법은 모두 같은 PCR 조건으로 검사자에게 편리성과 신속성을 높여줄 뿐 아니라, 돌연변이-양성대조구의 사용으로 실험 오염여부를 확인할 수 있어 더욱 정확하다. 개발한 방법으로 최근 3년 Nepovirus속 4종의 바이러스를 검사한 결과, 27건을 검출하여 검역처분 하였다.
본 연구에서 검사한 방법으로, 최근 3년(2010−2012년), 화물, 우편 및 휴대로 국내 유입된 식물에 대하여 검사를 진행 한 결과, TBRV(7건), ArMV(19건) 및 CLRV(1건) 검출되어 폐기 또는 반송되었으며, 최근 GFLV는 검출되지 않았으나 2007년 수입 콩 종자에서 2건이 검역된 사례가 있었다.
후속연구
개발한 방법으로 최근 3년 Nepovirus속 4종의 바이러스를 검사한 결과, 27건을 검출하여 검역처분 하였다. 본 연구 결과들은 앞으로도 수출입 식물에서 해당 바이러스들을 신속, 정밀하게 진단할 수 있는 방법으로 활용할 수 있을 것으로 기대된다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
Arabis mosaic virus의 지름은?
TBRV는 약 28 nm의 지름을 가지는 구형의 바이러스로(Murant, 1970), 선충을 벡터로 산딸기, 딸기 및 복숭아 일부 품종에 감염된다. ArMV는 약 30 nm의 지름을 가지고 있고(Francki 등, 1985), 자연 상태에서 기주 범위가 매우 넓어 채소 및 과수 등 다양한 작물에 발생하며, 국내에서는 딸기 바이러스병 진단을 위한 프라이머가 개발되어 있다(Choi 등, 2009). CLRV는 약 28 nm의 지름을 가지고 있고, 주로 즙액, 접목, 종자 및 선충에 의해 전염된다.
GFLV의 기주는?
자연 상태에서 대부분의 기주는 체리 등의 목본식물과 완두 등의 콩과 작물과 관련이 있으며, 실험적 기주 범위는 36개 과(family) 이상의 넓은 기주를 가지고 있다. GFLV는 약 30 nm의 지름을 가지는 구형바이러스로 자연상태에서 주요 기주는 포도속 식물과 관련이 있으나, 콩과를 비롯한 등 다양한 기주를 가지는 것으로 알려져 있다.
Enzyme-linked immunosorbent assay의 문제점은 무엇인가?
Enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA)는 항원 또는 항체를 색의 변화로 측정, 진단하는 방법으로 1977년 식물바이러스 검정에 처음 사용되었으며(Clark과 Adams, 1977), 검사의 정확성과 간편성으로 식물검역 바이러스 검사법으로 오랫동안 사용되었다. 그러나 검사과정에 소요되는 시간, 낮은 민감도 및 거짓양성반응 등의 문제점이 발견되었으며(Caruso 등, 2003; Priou 등, 2006) 최근에는 항혈청검사법이 핵산검사법으로 변화되고 있는 추세이다(Kim 등, 2000; Kim 등, 2005; Lee 등, 2011a, 2011b; Park 등, 2004). 따라서 본 연구에서는 식물검역 Nepovirus속 4종의 바이러스들을 RT-PCR과 nested PCR을 사용하여, 신속하고 정확하게 진단 할 수 있는 방법을 개발하였다.
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