선택한 단어 수는 입니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
선택한 단어 수는 30입니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 예비연구를 통해 항염 활성이 좋은 것으로 나타난 클로로포름(chloroform) 추출물이 LPS 자극에 의해 활성화된' 뇌 신경 소교세포로부터 생성되는 염증매개물질인 NO 및 염증사이토카인들의 생성을 억제시킬 수 있는지 조사하고, 이를 통해 퇴행성 뇌질환 치료의 적용 가능성을 검토하고자 수행하였다.
- 항암효과가 보고되면서 각 종 염증성 질환의 치료제 개발에 관심을 모으고 있다'5". 이에 저자는 이전 연구에서쯔) 황련의 분획에 따른 퇴행성 뇌질환의 항염증효과를 검증하였으며 본 연구에서는 그 중에서 황련의 chloroform 분획물(CR-C)의 항염효과를 확인하고자 신경교세포인 BV2 세포로부터 분비되는 염증매개물질들에 대한 억제효과를 조사하였다.
- 본 연구에서는 퇴행성 뇌질환 치료를 위한 한약재 추출물 및 분획물을 발굴하기 위해 신경 소교세포인 BV2 세포를 이용하여 항염증 효과를 조사하였다. 황련의 chloroform 분획물은 200uM/ml 농도까지 세포독성이 나타나지 않았으며, LPS에 의해 유도된 염증 물질인 NO와 염증사이토카인인 TNF-a, IL-1P 의 생성을 유의적으로 감소시켰다.
제안 방법
- 것을 본 실험에 사용하였다. 황련시료는 1kg을 분쇄하여 80% methanol로 5시간 동안 추출하였으며, 이 추출물을 다시 chloroform 으로 분획 추출한 다음 여액을 감압 농축 시킨 후, 동결건조하여 황련 chlorofonu 시료(CR-C)를 제조하였다. 동결건조 된 CR-C는 냉동 보관하였으며, 실험 직전 DMSO를 이용하여 녹인 후 최종 DMEM 배지로 희석하여 사용하였다.
- 이를 microplate reader(Molecular Devices)를 이용하여 550 600nm에서 흡광도를 측정하였다. 세포독성은 무처리구의 세포생존도(cell viability) 100%를 기준으로 약물처리구의 상대적인 세포생존도를 계산하였다.
- 세포로부터 생성되는 NO의 양은 세포 배양액 중 존재하는 NO2-의 형태를 Griess 시약반응을 이용하여 측정하였다. 즉, BV2 세포(1x105 cells/ni)를 24-well plate에 하룻밤 배양한 후 CR-C를 여러 농도로 처리하여 다음 30분간 배양하고 다시 LPS(1 昭 /ml; E.
- 세포 활성화를 유도하였다. 세포로부터 배양액을 수거한 후 Ready-Set-Go mouse TNF-a /IL-IP Cyto-SetsTM Biosource ELISA kits를 이용하여 측정하였다. 생성된 TNF-a와 IL-:田의 양은 각 recombinant cytokine 표준단백질의 홉광도를 기준으로 농도(pg)를 계산하였다.
- 세포로부터 배양액을 수거한 후 Ready-Set-Go mouse TNF-a /IL-IP Cyto-SetsTM Biosource ELISA kits를 이용하여 측정하였다. 생성된 TNF-a와 IL-:田의 양은 각 recombinant cytokine 표준단백질의 홉광도를 기준으로 농도(pg)를 계산하였다.
- iNOS 및 염증사이토카인들의 유전자 발현을 조사하기 위해 세포를 6-well plate에 배양하고 CR-C 을 농도별로 30분간 전처리한 후 LPS(1 呢/ml)를 처리하여 6시간 동안 배양한 후 세포를 수거하였다. 세포로부터 TRIzol 용액 (Invitrogen) 을 이용하여 total RNA를 분리한 후, oligo-(dT) primer와 Impro m-IITM reverse transcriptase (Promega Bioscience , San Luis Obispo, USAX 이용하여 cDNA를 합성하였다.
- 수거하였다. 세포로부터 TRIzol 용액 (Invitrogen) 을 이용하여 total RNA를 분리한 후, oligo-(dT) primer와 Impro m-IITM reverse transcriptase (Promega Bioscience , San Luis Obispo, USAX 이용하여 cDNA를 합성하였다. cDNA 에 및 iNOS, TNF-a, IL-1。에대한 각 specific primers (sence, anti-sence)를 넣은 후 10x buffer, 250pM dNTP, 1U Tag polymerase 등을 혼합하여 denaturation을 위해 94oC에서 30초, annealing 을 위해 55〜 60oC 에서 50초 및 extension 을 위해 70oC에서 60초 조건에서 25-30 cycles로 PCR을 수행하였다.
- 세포로부터 TRIzol 용액 (Invitrogen) 을 이용하여 total RNA를 분리한 후, oligo-(dT) primer와 Impro m-IITM reverse transcriptase (Promega Bioscience , San Luis Obispo, USAX 이용하여 cDNA를 합성하였다. cDNA 에 및 iNOS, TNF-a, IL-1。에대한 각 specific primers (sence, anti-sence)를 넣은 후 10x buffer, 250pM dNTP, 1U Tag polymerase 등을 혼합하여 denaturation을 위해 94oC에서 30초, annealing 을 위해 55〜 60oC 에서 50초 및 extension 을 위해 70oC에서 60초 조건에서 25-30 cycles로 PCR을 수행하였다. PCR 반응의 표준 대조구로 GAPDH를 사용하였다.
- cDNA 에 및 iNOS, TNF-a, IL-1。에대한 각 specific primers (sence, anti-sence)를 넣은 후 10x buffer, 250pM dNTP, 1U Tag polymerase 등을 혼합하여 denaturation을 위해 94oC에서 30초, annealing 을 위해 55〜 60oC 에서 50초 및 extension 을 위해 70oC에서 60초 조건에서 25-30 cycles로 PCR을 수행하였다. PCR 반응의 표준 대조구로 GAPDH를 사용하였다.
- iNOS 단백질 발현을 조사하기 위해 각 세포 (lxl06cells/ml)를 6-well plate에 배양하고 CR-C을 농도별로 30분간 전처리한 후 LPS(1呢/ml)를 처리하여 24시간 동안 배양한 후 세포를 수거하였다. 세포를 수거하여 lx ice-cold PBS로 두 번 세척한 다음 lysis buffer(lM Tris-HCl, 5M NaCl, 0.
- 5% Triton X-100, protease inhibitor cocktail) 100以를 넣어 세포를 lysis시켰다. 이를 14, 000rpn에서 20분간 원심분리하여 상층액을 회수한 후 Bradford 용액과 BSA 표준용액을 이용하여 단백질 양을 정량하고 20昭의 단백질을 10% polyacrylamide gel 을 이용하여 SDS-PAGE를 실시하였다. 전기영동 후 gel을 분리하여 nitrocellulose membrane에 옮기고 5% skim milk로 실온에서 1시간 동안 blocking 시켰다.
- 다음날 membrane을 TBS-T 용액으로 3회 세척하고 TBS-T로 희석된 HRP-conjugated 이차항체를 넣어 실온에서 1시간 반응시켰다. 이를 다시 TBS-T로 3회 세척한 다음 enhanced chemiluminescence detection system(Ame rsham)을 이용하여 X-ray film에 감광시켰다. 각 단백질의 발현에 대한 대조군으로 actin에 대한 일차 항체를 이용하여 위와 동일한 방법으로 수행하였다.
- 이를 다시 TBS-T로 3회 세척한 다음 enhanced chemiluminescence detection system(Ame rsham)을 이용하여 X-ray film에 감광시켰다. 각 단백질의 발현에 대한 대조군으로 actin에 대한 일차 항체를 이용하여 위와 동일한 방법으로 수행하였다.
- CR-C의 세포독성을 조사하기 위해서 BV2 세포에 50〜lOOOWml의 CR-C을 처리한 후 MTT assay 를 수행하였다(Fig. 1). BV2 세포에서 CR-C 처리에 의한 세포생존도는 무처리구의 세포생존도 100%를 기준으로 50(®/ml, 100昭/ml, 200昭/ml, 500(zg/ml 및 1, 000^/ml 농도에서 각각 101.
- CR-C가 BV2 세포에서 LPS에 의해 유도되는 NO 생성에 미치는 영향을 조사하기 위해서 세포에 여러 농도의 CR-C를 처리한 다음, 세포배양액으로부터 NO 양을 Griess reagent로 측정하였다(Fig. 2). 무처리 대조구에서는 NO가 거의 검출되지 않은 반면, LPS 처리 후세포가 활성화됨으로써 33.
- 한편, CR-C가 NO 생성효소인 iNOS의 유전자 및 단백질 발현에도 억제효과를 나타내는지 확인하기 위하여 여러 농도의 CR-C을 BV2 세포에 처리한 다음, RT-PCR(Fig. 3A) 및 Western blot을 수행하였다(Fig. 3B).
- CR-C가 BV2 세포에서 LPS에 의해 유도되는 염증사이토카인인 TNF-a와 IL-1P 생성에 미치는 영향을 조사하기 위해서 여러 농도의 CR-C를 처리한 다음, 세포배양액으로부터 TNF-a와 IL-1P 양을 ELISA로 측정하였으며, 유전자발현을 RT-PCR로 조사하였다(그림 4).
- LPS 자극에 의해 활성화된 BV2 세포로부터 생성되는 염증물질인 NO는 CR-C에 의해 억제되는 것을 확인하였으며(Fig. 2A), CR-C의 NO 생성저해는 NO 합성효소인 iNOS의 유전자 발현억제를 통해 이루어졌다(Fig. 2B, C). 대표적인 염증물질인 NO는 동물의 대식세포 및 간세포에서 L-arginine으로부터 iNOS에 의해 합성되는 자유라디칼(free radical)로서세포 내 항상성 유지, 신경전달물질 운반, 항암작용 및 세포독성 등에 관여하는 신호전달자 역할을 한다.
대상 데이터
- 중국의 사천성에서 생산된 황련(川黃連; Coptidis chinensis Franch, Coptidis Rhizoma)을 광명당제약 (울산, 한국)에서 수입(원료시험성적서 구비)하여 동국대학교 한의과대학 본초학교실에서 검정하고 정선한 것을 본 실험에 사용하였다. 황련시료는 1kg을 분쇄하여 80% methanol로 5시간 동안 추출하였으며, 이 추출물을 다시 chloroform 으로 분획 추출한 다음 여액을 감압 농축 시킨 후, 동결건조하여 황련 chlorofonu 시료(CR-C)를 제조하였다.
- GibcoBRL, Invitrogen Life Technology, MD, USA), 1% penicillin(GibcoBRL) 및 streptomycin(GibcoBR L) 이 포함된 DMEM 배지 (Hyclone, UT, Canada) 에서 37°C, 5% COZ 조건으로 배양하였다.
데이터처리
- 결과는 3회 반복실험에 대한 평균土평균표준오차 (standard error of mean; SEM)로 나타내었으며 통계학적 분석은 Graphpad Prism program의 Student t-test로 검정하여 p값이 0.05 이하인 경우 유의성이 있는 것으로 판정하였다.
성능/효과
- 1). BV2 세포에서 CR-C 처리에 의한 세포생존도는 무처리구의 세포생존도 100%를 기준으로 50(®/ml, 100昭/ml, 200昭/ml, 500(zg/ml 및 1, 000^/ml 농도에서 각각 101.5±0.15%(mean+SEM), 99.6+1.83%, 97.4+1.98%, 72.1+1.02% 및 24.0+1.57% 로 측정되었다. 즉, BV2 세포에서는 200妃/ml의 CR-C 농도까지 독성이 없는 것으로 나타났다.
- 2). 무처리 대조구에서는 NO가 거의 검출되지 않은 반면, LPS 처리 후세포가 활성화됨으로써 33.6+0.34P M 농도로 증가되었다(Fig. 2). 또한 CR-C 처리농도 10昭/ml, 20yg/ml, 50(«/ml, 100(zg/ml 및 200昭/ml 에서 각각 33.
- 61iiM 농도로 검출되었다. 따라서 LPS에 의해 유도된 NO 생성은 CR-C 처리농도에 의존적이고 유의적으로 감소하는 것으로 나타났다. CR-C의 단독처리는 NO 생성에 영향을 주지 않는다.
- 또한 LPS에 의해 유도된 iNOS의 유전자 및 단백질 발현은 CR-C 처리 후 현저히 억제되었다. 따라서 CR-C에 의한 활성화된 BV2로부터의 NO의 생성 억제효과는 iNOS의 유전자 전사 단계의 조절로부터 이루어짐을 알 수 있었다.
- 또한 LPS에 의해 유도된 iNOS의 유전자 및 단백질 발현은 CR-C 처리 후 현저히 억제되었다. 따라서 CR-C에 의한 활성화된 BV2로부터의 NO의 생성 억제효과는 iNOS의 유전자 전사 단계의 조절로부터 이루어짐을 알 수 있었다.
- BV2 세포로부터 TNF-a의 생성은 무처리 대조 구에서는 거의 검출되지 않은 반면, LPS 처리 후 세포가 활성화됨으로써 996.8+10.09pg/ml 농도로 증가되었으며, CR-C 처리 농도 IQzg/ml, 20/Jg/ml, 504®/ ml, 100昭/ml 및 20(加g/ml 에서 각각 925.3+1.05pg/ml, 792.1±5.92pg/ml, 567.3+ 20.84pg/ri, 342.8+19.88pg/ ml 및 96.8±2.37pg/ml 로 농도 의존하여 감소되었다 (Fig. 4A).
- 따라서 LPS에 의해 생성된 두 염증사이토카인 모두 CR-C 처리농도에 의존적이고 유의적으로 억제되는 것으로 나타났다.
- 한편, CR-C은 BV2세포에서 LPS에 의해 유도된 TNF-a와 IL-1P의 유전자 발현을 효과적으로 억제시키는 것으로 나타났다(Fig. 5). 따라서 CR-C에 의한 활성화된 BV2로부터의 TNF-a와 IL-10의 생성억제 효과는 이들 유전자의 전사단계 조절에 의해 나타남을 알 수 있었다.
- 5). 따라서 CR-C에 의한 활성화된 BV2로부터의 TNF-a와 IL-10의 생성억제 효과는 이들 유전자의 전사단계 조절에 의해 나타남을 알 수 있었다.
- 2B, C), 이를 통해 NO 생성을 유의적으로 감소시킴으로써 항염효과를 나타내었다. 따라서 본 연구결과를 통해 CR-C가 다양한 염증 질환 치료에 매우 효과적일 수 있음을 알 수 있었다.
- 5). 따라서 CR-C는 염증사이토카인의 유전자 발현 단계를 조절함으로써 실제 염증사이토카인 분비를 억제시킬수 있으며 이는 CR-C가 염증성 질환 치료에 효과적일 수 있음을 시사한다.
- 결론적으로 황련의 chloroform 분획물은 LPS에 의해 활성화된 신경소교세포로부터 과도하게 생성되는 NO, TNF-a, IL-邙와 같은 염증물질을 iNOS 및염증사이토카인들의 유전자 발현을 억제시킴으로써효과적으로 감소시키는 것으로 나타났다. 따라서 황련의 chloroform 분획물은 신경소교세포에 대해 강력한 항염증 효과를 나타내는 분획물로서 단독 또는 기타 약물과의 혼합을 통해 퇴행성뇌질환의 염증 개선을 위해 사용되어질 수 있을 것으로 사료된다.
- 황련의 chloroform 분획물은 200uM/ml 농도까지 세포독성이 나타나지 않았으며, LPS에 의해 유도된 염증 물질인 NO와 염증사이토카인인 TNF-a, IL-1P 의 생성을 유의적으로 감소시켰다. 또한 CR-C에 의한 염증물질의 생성억제는 NO 합성효소인 iNOS와 염증사이토카인들의 유전자 발현 조절에 의한 것으로 나타났다.
- 황련의 chloroform 분획물은 200uM/ml 농도까지 세포독성이 나타나지 않았으며, LPS에 의해 유도된 염증 물질인 NO와 염증사이토카인인 TNF-a, IL-1P 의 생성을 유의적으로 감소시켰다. 또한 CR-C에 의한 염증물질의 생성억제는 NO 합성효소인 iNOS와 염증사이토카인들의 유전자 발현 조절에 의한 것으로 나타났다. 따라서 황련의 chloroform 분획물은 활성화된 신경소교세포에 대해 항염효과를 보이는 약재 분획물로서 앞으로 퇴행성 뇌질환 치료를 위한 약물개발에 이용되어질 수 있을 것이다.
후속연구
- 또한 CR-C에 의한 염증물질의 생성억제는 NO 합성효소인 iNOS와 염증사이토카인들의 유전자 발현 조절에 의한 것으로 나타났다. 따라서 황련의 chloroform 분획물은 활성화된 신경소교세포에 대해 항염효과를 보이는 약재 분획물로서 앞으로 퇴행성 뇌질환 치료를 위한 약물개발에 이용되어질 수 있을 것이다.
- 감소시키는 것으로 나타났다. 따라서 황련의 chloroform 분획물은 신경소교세포에 대해 강력한 항염증 효과를 나타내는 분획물로서 단독 또는 기타 약물과의 혼합을 통해 퇴행성뇌질환의 염증 개선을 위해 사용되어질 수 있을 것으로 사료된다.
※ AI-Helper는 부적절한 답변을 할 수 있습니다.