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문제 정의
- 이에 저자는 川楝구가 만성 비세균성 전립선염에 미치는 효능을 실험적으로 규명하고자 rat에 17 P -estradiol를 투여하여 만성 비세균성 전립선염을 유발시킨 후 혈액 및 전립선 조직의 관찰을 통해 유의성 있는 결과를 얻었기에 보고하는 바이다.
- 또한 고령의 Wistar rat에게 17 0-estardiol의 투여와 고환 절제술을 시행할시 100% 비세균성 전립선염을 일으키는 것으로 보고되고 있으며, 유발된 전립선염은 자발적 비세균성 전립선염과 매우 유사한 조직병리학적 변화가 발생되는 것으로 알려져 있다27td. 이에 저자는 川楝구의 만성 비세균성 전립선염에 대한 치료 효과 및 작용기전 등을 관찰하기 위해 고령의 Wistar rat에게 17estardiol의 투여 및 고환 절제술을 시행하여 만성 비세균성 전립선염을 유발한 후 Ⅲ楝子 를 투여하여 다음과 같은 결과를 얻었다.
가설 설정
- (A) none-treated normal group- Duct epithelial cells were long columnar in shape and fibrous tissues were poorly developed in the surrounding stroma. (B) treated group with 17 p-estradi0l (s.
제안 방법
- Ether를 이용하여 마취한 rat의 음낭피부를 절개한 후 고환 상위부위의 정관, 혈관 및 신경조직을 봉합사로 묶고 고환과 부고환을 절제하였다. 고환절제 후 음낭 피부를 봉합하고, 1일간의 회복기를 거치게 하였다.
- 고환절제 후 음낭 피부를 봉합하고, 1일간의 회복기를 거치게 하였다. 고환 절제술 2일째부터 17 Q-estradiol을 sesame oil로 희석하여 30일 동안 0.
- 고환절제 후 음낭 피부를 봉합하고, 1일간의 회복기를 거치게 하였다. 고환 절제술 2일째부터 17 Q-estradiol을 sesame oil로 희석하여 30일 동안 0.25mg/2ml/kg 용량으로 실험동물의 등에 피하 주사하여 비세균성 전립선염을 유발하였다.
- 본 연구의 실험군은 정상군(normal group), 대조군(control group), 테스토스테론 투여군 (testosteron e group), 그리고 川楝子 투여군(TOF group)등 4군으로 나누고 각 군당 5마리씩을 배정하였다.
- 않았다. 대조군의 rat에게는 고환절제술 다음날부터 17 P-estradiol을 30일간 피하로 주사하였고 17일째부터 생리 식염수 5mM翦만을 경구 투여하였다. 양성 대조군은 고환 절제술 다음날부터 17 P -estradiol을 30일간 피하로 주사하면서 17일째부터 Testosterone을 0.
- 대조군의 rat에게는 고환절제술 다음날부터 17 P-estradiol을 30일간 피하로 주사하였고 17일째부터 생리 식염수 5mM翦만을 경구 투여하였다. 양성 대조군은 고환 절제술 다음날부터 17 P -estradiol을 30일간 피하로 주사하면서 17일째부터 Testosterone을 0.25mg/k碧의 용량으로 생리 식염수에 현탁하여 피하 주사하였다. 川楝子 투여군은 고환 절제술 다음날부터 17 S-estradiol을 30일간 피하로 주사하면서 17일째부터 川楝구를 400㎎/㎏의 용량으로 생리 식염수에 현탁하여 rat zonde를 이용하여 1일 1회 경구로 주입하였다.
- 25mg/k碧의 용량으로 생리 식염수에 현탁하여 피하 주사하였다. 川楝子 투여군은 고환 절제술 다음날부터 17 S-estradiol을 30일간 피하로 주사하면서 17일째부터 川楝구를 400㎎/㎏의 용량으로 생리 식염수에 현탁하여 rat zonde를 이용하여 1일 1회 경구로 주입하였다.
- 실험 시작 31일째에 rat의 심장에서 채혈하여 AST(aspartate aminotrans), ALT(alanine aminotra ns), creatinine 등의 생화학적 분석을 시행하였다.
- 마지막 투약한 다음날 체중의 측정과 채혈 후 rat 의 전립선을 절제하여 그 무게를 측정하였다. 측정이 끝난 전립선을 10% 중성 완충 포르말린 용액에 고정한 후 70%, 80%, 95%, 100% 에탄올에 차례로 담가 탈수시킨 후 파라핀 블록을 만들었다.
- 측정이 끝난 전립선을 10% 중성 완충 포르말린 용액에 고정한 후 70%, 80%, 95%, 100% 에탄올에 차례로 담가 탈수시킨 후 파라핀 블록을 만들었다. 이후 microtome을 이용하여 4㎛의 두께로 각 전립선조직을 관상으로 절 편한 다음 gelatin coated slide에 부착시켰다.
- 이후 microtome을 이용하여 4㎛의 두께로 각 전립선조직을 관상으로 절 편한 다음 gelatin coated slide에 부착시켰다. 작성된 조직 절편들은 조직염색을 위하여 xylene에 담가 파라핀을 제거하고, 100%, 95%, 80%, 70% 에탄올, 증류수에 차례로 담가 재수화(rehydrati on)시켰다. 재수화된 조직을 Hematoxyline-Eosin (H&E)으로 염색하여 광학현미경하에서 조직학적으로 평가하였다.
- 작성된 조직 절편들은 조직염색을 위하여 xylene에 담가 파라핀을 제거하고, 100%, 95%, 80%, 70% 에탄올, 증류수에 차례로 담가 재수화(rehydrati on)시켰다. 재수화된 조직을 Hematoxyline-Eosin (H&E)으로 염색하여 광학현미경하에서 조직학적으로 평가하였다.
- 선 조직(gland)의 손상 평가는 상피 세포(epithelial cell)의 형태에 따라 점수화 시켜 시행하였다. 상피세포의 형태가 원주형 세포(columnar cell)일 경우 2 점, 입방형 세포(cuboidal cell)인 경우 1점, 편평양세포(squamousTike cell) 인 경우 0점을 주었으며, 각 표본 당 20개씩의 선 조직 내에 존재하는 상피세포를 조사하여 평가하였다.
- 상피세포의 형태가 원주형 세포(columnar cell)일 경우 2 점, 입방형 세포(cuboidal cell)인 경우 1점, 편평양세포(squamousTike cell) 인 경우 0점을 주었으며, 각 표본 당 20개씩의 선 조직 내에 존재하는 상피세포를 조사하여 평가하였다.
- 결합조직 증식의 평가는 표본의 전 영역과 분비 선영 역의 현미경 사진을 이용하여 상피세포와 결합조직 면적 비율(epithelio-stromal ratio)을 계산하였다.
- Ⅲ楝구가 상피세포의 선 조직 손상정도에 미치는 영향을 알아보기 위해 상피세포의 형태에 따라 각각 원주형 (columnar)일 경우 2점을, 입방형 (cuboidal) 의 경우 1점, 편 평양(squamous-type)의 경우 0점으로 점수화 시켜 분석하였다. 대조군에서는 정상군에 비해 현저한 상피 계수의 감소가 관찰되어, 고환 절제술과 17 Q-estradiol의 투여로 유발된 만성 비세균성 전립선염에서 전립선 선 조직의 손상이 유발됨을 확인할 수 있었다.
대상 데이터
- 실험에 사용된 시약은 17 P-estradiol (Sigma, U.S.A), testosterone (한일약품, 한국), D-PBS (Sigma, U.S.A), xylene( Sigma Co., U.S.A), hematoxyline-eosin(Sigma Co., U.S.AX 사용하였다.
- 실험에 사용된 기기는 熱湯抽出器 (대웅, Korea), rotary vaccum evaporator (BUCHI Co., Switzerland), freeze dryer (EYELA Co., Japan), autoclave (Sanyo Co., Japan), micro-pipet (Gilson Co., France), water bath (Vision scientific Co., Korea), vortex mixer (Vision scientific Co., Korea), spectrophotometer (Shimazue Co., Japan), centrifuge (Sigma Co., U.S.A), deep-freezer (Sanyo Co., Japan), thermocycler system (MWG Biotech Co., Germany), ice-maker (Vision scientific Co., Korea), rat zonde(대종 기기, 한국), microtome(W.P.I Co., Germany), 광학현미경 (Nikon Co, Japan) 등을 사용하였다.
- 실험동물은 450g정도의 雄性 30주령 Wistar rat (SLC Co, Japan)를 공급받아 실험당일까지 고형사료 (항생제 무첨가, 삼양사료 Co.)와 물을 충분히 공급하고 실온 22±2℃를 계속 유지하면서 2주일간 실험실 환경에 적응시킨 후 체중 변화가 일정하고 건강한 동물을 선발하여 실험에 사용하였다.
- er Zucc.의 성숙한 과실을 건조한것으로 166) 대전대학교 부속 한방병원에서 구입한 것을 정선하여 사용하였다.
- 실험에 사용된 川楝구는 총 100g에 증류수 1, 000 航를 가하여 열탕 추출기에서 3시간 전탕한 후 여과하였다. 그리고 다시 감압 증류장치로 농축하고, 이를 동결 건조기로 완전 건조하여 川楝子 추출물 18g 을 얻었으므로 약 18% 정도의 추출률을 보였다.
- 만성 비세균성 전립선염의 병리기전 및 약물의 유효성을 검증하기 위해 사용되는 실험동물은 대부분 Lewis rat과 Wistar rat, 그리고 Copenhagen rat 등이다. 이러한 rat는 자발적 비세균성 전립선염의 발생률이 높으며, 조직병리학적 소견 또한 인간의 것과 매우 유사하다 보고되어 있다從.
데이터처리
- 동물실험에서 얻은 결과는 mean±standard error 로 기록하였다. 유의성 검증은 Student, s t-test 분석 방법을 이용하여 결정하였으며, 양방 검정 유의도(Two-tailed p value)는 p<0.
- 기록하였다. 유의성 검증은 Student, s t-test 분석 방법을 이용하여 결정하였으며, 양방 검정 유의도(Two-tailed p value)는 p<0.05 수준일 때를 기준으로 하였다.
성능/효과
- 그리고 다시 감압 증류장치로 농축하고, 이를 동결 건조기로 완전 건조하여 川楝子 추출물 18g 을 얻었으므로 약 18% 정도의 추출률을 보였다.
- Ⅲ楝구의 투여로 인한 간장과 신장의 기능 변화를 살펴보기 위해 AST, ALT, creatinine을 측정한 결과 정상군에 비해 고환 절제술 및 17 P-estradiol 을 투여한 대조군에서는 AST, ALT, creatinine0] 모두 증가하였다.
- 하지만 川楝구와 Testosterone의 투여한 실험군은 대조군에 비해 AST, ALT 모두 감소를 나타내었고 (Fig. 1, 2), 신장기능을 알 수 있는 creatinine 수치 또한 대조군에 비하여 川楝구와 testosterone 투여군에서 유의성있게 감소하였다(Fig. 3). 그리고 생체의 염증 정도를 알 수 있는 LDH는 정상군에 비해 고환 절제술 및 17 0-estxadiol을 투여한 대조군에서는 증가하였고, 川楝구와 testosterone 투여군에서는 유의성 있게 감소하였다(Fig.
- 3). 그리고 생체의 염증 정도를 알 수 있는 LDH는 정상군에 비해 고환 절제술 및 17 0-estxadiol을 투여한 대조군에서는 증가하였고, 川楝구와 testosterone 투여군에서는 유의성 있게 감소하였다(Fig. 4).
- 고환 절제술 및 30일간의 17 P-estradiol 투여와 川楝구의 투여가 체중 및 전립선 무게에 미치는 영향을 관찰한 결과, 대조군에 비해 川楝子 투여 군이 체중감소가 억제되었으나 유의성은 없었다(Fig. 5). 전립선 무게는 대조군에 비해 川楝子 투여군에서는 유의성(p<0.
- 5). 전립선 무게는 대조군에 비해 川楝子 투여군에서는 유의성(p<0.01)있게 감소를 억제하였다(Fig. 6).
- H&E 염색 표본의 광학 현미경 관찰에서 정상군은 다른 군에 비해 전립선의 크기가 크며, 선포 세포(acinar gland)가 둥근 형태로 위 죽 없이 잘 유지하고 있고, 도관 상피 세포(duct epithelial cell) 역시원주형의 형태로 정상 세포핵과 분비선들이 정상 형태를 유지하고 있었으며, 결합 조직의 증식이나 섬유화 역시 관찰되지 않았다 (Fig. 7A).
- 7B). Testosterone 투여군에서 선포세포는 둥근 형태로 정상군과 유사한 형태를 보였고, 도관 세포는 원주 모양으로 잘 유지되고 있었으며, 결합 조직은 경도의 증식과 섬유화가 GLS 투여군과 유사한 정도로 관찰되었다(Fig. 70.
- 70. TOP 투여군에서는 대조군에 비해 선포세포는 보다 둥근 형태로 뚜렸하게 위축이 관찰되었고, 도관 세포는 입방형의 형태로 세포핵과 분비선들의 형태 및 공간이 대조군에 비해 정상 형태에 가깝게 유지되어있었으며, 결합 조직은 경도의 증식과 함께 임파구, 단핵구의 침윤과 염증 화가 현저히 감소되었고, 섬유화 변성 역시 대조군에 비해 감소된 양상을 보였다 (Fig. 7D).
- 시켜 분석하였다. 대조군에서는 정상군에 비해 현저한 상피 계수의 감소가 관찰되어, 고환 절제술과 17 Q-estradiol의 투여로 유발된 만성 비세균성 전립선염에서 전립선 선 조직의 손상이 유발됨을 확인할 수 있었다.
- Ⅲ楝子 투여가 고환 절제술 및 17 p-estradiol 투여로 유발된 비세균성 전립선염에서의 전립선 결합조직의 증식에 미치는 영향을 평가하기 위해서 시행한 결합조직 대 결합조직을 제외한 선포 조직 간의 비율 계산에서 정상군은 결합조직 면적 비율이 31.8±4.8%로 나타난 반면 대조군에서는 74.6±4.8%로 현저하게 결합조직 면적 비율이 증가하여, 고환 절제술과 17 ^-estradiol의 투여로 유발된 만성 비세균성 전립선염에서 전립선 세포의 과다증식이 주로 결합조직에서 발생함을 확인하였다(Fig. 9).
- Ⅲ楝子 투여군에서는 결합조직 면적 비율이 54.7±7.9%로 결합조직 증식이 현저하게 억제되었으며(p<0.05), testosterone 투여군에서는 결합조직 면적 비율이 53.2±6.9%로 유의하게 감소하였다(pCO.Ol ).
- 대조군에 비해 川楝구를 투여한 실험군은 체중감소의 억제에는 별다른 영향을 미치지 않았고, 전립선 무게의 감소를 억제하는 효과는 유의성 있는 결과를 보여주었다. 이는 전립선의 무게가 잔존 분비액의 양에 의해 결정된다는 점을 고려할 때 Ⅲ楝子 가 전립선 선포 상피세포의 기능과 형태를 유지 보호해주는 작용을 가질뿐 아니라 전립선액 분비의 감소를 개선시켜주는 작용도 있다는 것을 의미한다.
- 또한 川楝구의 투여가 모두 끝난 실험군의 AST, ALT, Creatinine, LDH의 측정을 통해 간과 신장의 기능에 미치는 영향을 관찰한 결과, 대조군에 비해 AST를 제외한 ALT, Creatinine, LDH에서 유의성 있는 수치의 개선을 나타내었는데, 만성 비세균성 전립선염의 주된 원인이 한의학적으로는 간과 신장의 기능 이상이므로, 이러한 실험 결과는 Ⅲ楝구가만성 비세균성 전립선염에 유의한 치료효과를 미칠 수 있음을 의미한다. 생각된다.
- 본 연구에서 고환 절제술 및 17 Q-estardiol의 투여는 심각한 상피-결합조직 면적 비율의 증가를 초래하여, 인간에서의 전립선염과 유사한 병태를 나타내었다. 이러한 결합조직 면적 비율의 증가는 Ⅲ楝 구의 투여로 감소하였는데, 이는 川楝구가 전립선 선포 상피세포의 보호 작용과 더불어 결합조직의 증식 억제 작용을 동시에 가진다는 것을 의미한다.
- 이러한 결합조직 면적 비율의 증가는 Ⅲ楝 구의 투여로 감소하였는데, 이는 川楝구가 전립선 선포 상피세포의 보호 작용과 더불어 결합조직의 증식 억제 작용을 동시에 가진다는 것을 의미한다. 따라서 川楝구는 기능적으로 전립선의 분비기능을 유지시킬 수 있으며, 동시에 구조적으로도 결합조직의과다 증식을 억제하는 기능을 가져 전립선염에서 나타나는 조직의 병리적 손상을 효과적으로 억제하는 효능을 가졌다고 할 수 있겠다.
- Ⅲ楝구가 고령의 Wistar rat에 고환 절제술과 17 Q-estradiol의 투여로 유발된 만성 비세균성 전립선염에 미치는 영향을 알아보기 위해 시행한 연구에서, 川楝子 투여군은 대조군에 비해 ALT, creatinin e, LDH가 유의성 있게 감소하였으나, AST는 큰 변화는 없었고, 전립선 무게의 감소는 유의성 있게 억제되었다. 또한 川楝子 투여군은 대조군에 비해 선포 및 도관 상피 세포의 형태 변화가 적고, 결합 조직의 증식이나 섬유화 역시 감소된 양상을 보였으며, 상피 계수의 개선을 나타내어 전립선 분비선의 손상을 억제하는 효능을 보였고, 결합조직의 면적 비율이 감소하여 川楝구가 결합 조직의 증식을 억제하는 작용을 보였다.
- 또한 川楝子 투여군은 대조군에 비해 선포 및 도관 상피 세포의 형태 변화가 적고, 결합 조직의 증식이나 섬유화 역시 감소된 양상을 보였으며, 상피 계수의 개선을 나타내어 전립선 분비선의 손상을 억제하는 효능을 보였고, 결합조직의 면적 비율이 감소하여 川楝구가 결합 조직의 증식을 억제하는 작용을 보였다.
후속연구
- 이상을 종합해보면 川楝구는 만성 비세균성 전립선염의 치료에 있어 안전성을 확보하고 있고, 전립선 조직 보호에 유의한 효과를 가지므로 앞으로 Ⅲ 楝구및 川楝구를 포함한 방제들에 대하여 지속적인 연구가 필요하리라 생각된다.
- 이상의 결과에서 川楝구는 만성비세균성 전립선에 대하여 유의 한 치료효과를 가지며 활용가능성이높으므로 앞으로도 지속적인 연구가 필요하리라 생각된다.
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