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문제 정의
- 본 연구에서는 ESMR의 비장 및 흉선세포의 증식, 면역세포 아집단에 미치는 효과와 마우스 섬유육종 세포(Fsa II)에 대한 세포독성효과를 관찰하였다. 또한 과다한 방사선량은 암세포뿐만 아니라 다른 정상세포를 괴사시키는데, 적은 방사선량으로 같은 효과를 나타내는지를 알아보기 위하여, ESMR과 방사선을 병용하여 마우스 섬유육종 세포에 대한 세포독성을 관찰하였다.
- 본 연구에서는 국내에서 생산되는 가시오갈피 뿌리 추출물의 면역세포의 활성에 미치는 효과를 살펴보고자 마우스 비장 및 흉선세포의 증식과 면역세포 아집단에 미치는 영향을 관찰하였고, 마우스 종양세포에서 항종양성을 알아보기 위하여 시험관 내 가시오갈피 및 방사선조사 병용과 방사선 조사 단독 상황에서 세포독성효과를 관찰하였다.
제안 방법
- 200, 2,000 및 20, 000개의 섬유육종 세포를 10% 혈청이 함유된 RPMI 1640 배지 액에 첨가하고 15시간 배양하였다. 지수성장기에 도달한 후 각 농도의 가시오갈피 뿌리 추출물과 비교 실험을 위한 고려인삼, 영지 및 홍삼 추출물을 각각의 세포 주 함유 배지에 첨가하여 1시간 동안 접촉시켰다.
- 또한 가시오갈피 뿌리 추출물의 세포 독성실험 비교를 위해 고려인삼, 영지버섯 및 홍삼의 시료를 사용하였다. 고려인삼 50 g과 영지버섯 150 g에 각각 1.0 L의 증류수를 가하고 100℃에서 5시간 동안 환류 추출한 다음 여과지 (Whatman No. 2)로 여과하였으며, 이 액을 원심 분리하여 냉각시킨 후 동결 건조하여 시료로 하였다. 동결 건조로 얻어진 인삼과 영지버섯 추출물은 각각 16.
- 지수성장기에 도달한 후 각 농도의 가시오갈피 뿌리 추출물과 비교 실험을 위한 고려인삼, 영지 및 홍삼 추출물을 각각의 세포 주 함유 배지에 첨가하여 1시간 동안 접촉시켰다. 그 후 RPMI 1640 배지로 세척하여 1주일 동안 CO2 배양기(37℃, 5% CO2 조건)에서 배양하면 종양세포주의 군집 형태인 콜로니가 형성되는데 이를 95% 알코올로 고정한 뒤 ciystal violet으로 염색하여 콜로니 수를 계산하였다. 그리고 콜로니 수의 비율에 따라 생존분율을 구하였다.
- 그 후 RPMI 1640 배지로 세척하여 1주일 동안 CO2 배양기(37℃, 5% CO2 조건)에서 배양하면 종양세포주의 군집 형태인 콜로니가 형성되는데 이를 95% 알코올로 고정한 뒤 ciystal violet으로 염색하여 콜로니 수를 계산하였다. 그리고 콜로니 수의 비율에 따라 생존분율을 구하였다.
- 사용하였다. 또한 culture flask와 96well microplate (Nunc, Denmark), inverted microscope (Zeiss Co, Axiovert 25, Gennany), ELISA 판독기 (Dynatech, MR500, USA), flow cytometer (Coulter, EPICS-XL, USA)를사용하였고, centrifuge (VS-1500CF), COi incubator (VS-9108MS)는 Vision 사의 제품, freezer dryer (FD5505)는 일신엔지니어링 제품을 사용하였다. 방사선조사는 저 에너지(250 KV)용 방사선 기기 (지멘스, 독일)를 사용하였으며, 사용된 방사선 조사량은 2, 4, 6 Gy이었다.
- 대한 세포독성효과를 관찰하였다. 또한 과다한 방사선량은 암세포뿐만 아니라 다른 정상세포를 괴사시키는데, 적은 방사선량으로 같은 효과를 나타내는지를 알아보기 위하여, ESMR과 방사선을 병용하여 마우스 섬유육종 세포에 대한 세포독성을 관찰하였다.
- 마우스를 경추 탈구시켜 비장 및 흉선을 무균으로 적출하고 각각의 세포를 Dulbecco's Phospate Buffered Saline (DPBS)로 세정하고 1,500 rpm에서 10분간 원심 분리하여 세포 부유 액을 세 번 반복하여 조제하였다. 이 세포 부유액을 lxi06 cells/well이 되도록 세포 수를 조정한 다음, 비장 세포 부유 액에는 LPS (10〃g/ml)를, 흉선세포 부유 액에는 Con A(l/2g/ml)를 접촉한 다음, 최종 농도가 10, 100zzg/ ml가 되도록 가시오갈피 뿌리 추출물을 첨가하여 48시간 동안 371의 5% CO2배양기 내에서 배양하였다.
- 용해시켜 18시간 동안 빛을 차단하였다. 발색된 각 well의 흡광도를 ELISA 판독기를 이용해서 570 nm에서 측정하고대조군의 흡광도와 비교하여 세포생존율을 백분율(%)로 환산하였다."
- 방사선조사 단독군의 경우 섬유육종 세포에 2, 4 및 6 Gy를 조사하였고, 가시오갈피와 방사선 병용군의 경우는 가시오갈피 0.2 mg/ml 농도의 추출물을 RPMI 1640 배지 액과 마우스 섬유육종 세포가 포함되어 있는 배지에 1시간 접촉한 직후 동일한 방사선 조사량을 주어 상기와 같은 방법을 이용하여 각각 생존분율을 구하였다. 두 군사이의 생존 분율 차이는 SPSS (version 12.
- 액을 세 번 반복하여 조제하였다. 이 세포 부유액을 lxi06 cells/well이 되도록 세포 수를 조정한 다음, 비장 세포 부유 액에는 LPS (10〃g/ml)를, 흉선세포 부유 액에는 Con A(l/2g/ml)를 접촉한 다음, 최종 농도가 10, 100zzg/ ml가 되도록 가시오갈피 뿌리 추출물을 첨가하여 48시간 동안 371의 5% CO2배양기 내에서 배양하였다. 배양 종료 4시간 전에 5 mg/ml 농도로 DPBS (pH 7.
- 200, 2,000 및 20, 000개의 섬유육종 세포를 10% 혈청이 함유된 RPMI 1640 배지 액에 첨가하고 15시간 배양하였다. 지수성장기에 도달한 후 각 농도의 가시오갈피 뿌리 추출물과 비교 실험을 위한 고려인삼, 영지 및 홍삼 추출물을 각각의 세포 주 함유 배지에 첨가하여 1시간 동안 접촉시켰다. 그 후 RPMI 1640 배지로 세척하여 1주일 동안 CO2 배양기(37℃, 5% CO2 조건)에서 배양하면 종양세포주의 군집 형태인 콜로니가 형성되는데 이를 95% 알코올로 고정한 뒤 ciystal violet으로 염색하여 콜로니 수를 계산하였다.
대상 데이터
- 22 “m pore size의 여과기 (Millipore, filter type GS)로 여과 멸균하여 시료 원액을 만들고 이로부터 각각의 희석 액을 만들어 실험에 사용하였다. 또한 가시오갈피 뿌리 추출물의 세포 독성실험 비교를 위해 고려인삼, 영지버섯 및 홍삼의 시료를 사용하였다. 고려인삼 50 g과 영지버섯 150 g에 각각 1.
- 고형 펠렛 사료와 물은 자유 섭취하도록 하였다. 또한 실험세포 주는 한국생명공학연구원(대덕, 대전)에서 분양받은 5~6주 태생의 C3H/N 마우스를 통해 얻은 섬유육종 세포(FSa II)를 사용하였다.
- 또한 culture flask와 96well microplate (Nunc, Denmark), inverted microscope (Zeiss Co, Axiovert 25, Gennany), ELISA 판독기 (Dynatech, MR500, USA), flow cytometer (Coulter, EPICS-XL, USA)를사용하였고, centrifuge (VS-1500CF), COi incubator (VS-9108MS)는 Vision 사의 제품, freezer dryer (FD5505)는 일신엔지니어링 제품을 사용하였다. 방사선조사는 저 에너지(250 KV)용 방사선 기기 (지멘스, 독일)를 사용하였으며, 사용된 방사선 조사량은 2, 4, 6 Gy이었다.
- 본 실험에 아용한 마우스는 BALB/c계통 웅성(8주령, 20+2 g)을 대한실험동물(주)에서 구입해서 사용하였으며, 사육은 온도 22±2℃, 습도 55+5%, 명암 주기(dark and light cycle)는 12시간 단위로 조절하였다. 고형 펠렛 사료와 물은 자유 섭취하도록 하였다.
- 전북 장수군 가시오갈피영농조합에서 분양받은 가시오갈피의 뿌리 250 g에 80% 메탄올 1.0 L를 가하고 40℃에서 12시간씩 세 번을 반복 진탕 추출한 다음, 감압 농축하고 동결 건조하여 23.7 g의 시료를 얻었다. 각 시료의 추출액은 증류수에 용해하여 0.
- 7 g이었다. 홍삼의 경우 한풍제약에서 생산된 한풍 홍삼액® (파우치 용기 80 ml 에 홍삼 고형성분 3% 포함)을 동결 건조하여 사용하였다.
데이터처리
- 2 mg/ml 농도의 추출물을 RPMI 1640 배지 액과 마우스 섬유육종 세포가 포함되어 있는 배지에 1시간 접촉한 직후 동일한 방사선 조사량을 주어 상기와 같은 방법을 이용하여 각각 생존분율을 구하였다. 두 군사이의 생존 분율 차이는 SPSS (version 12.0) 프로그램의 일반 선형모델 중 단 변량 공산분석을 이용하였다.
이론/모형
- senticosus Maxim Root (10,100 mg/ml) was treated to cultured splencytes or thymocytes for 48 hours. The cell assayed by MTT method. The OD of each well was measured at 570 nm with a microplate reader.
성능/효과
- In vivo 실험에서는 비장 내 B세포 및 T세포를 증가시켰으나, 흉선세포에 대해서는 증가를 보이지 않았다. ESMRe 마우스 섬유 육종 세포에 대해 강한 세포독성 효과를 나타냈다. FSa II를 접종한 마우스에서 방사선 단독 보다 ESMR을 병용한 경우 방사선에 의한 세포손상이 약 50% 이상 증가되었으며, 두군 간의 차이는 통계학적 의미를 나타냈다.
- ESMRe 시험관 내 실험에서 비장 및 흉선세포의 증식을 촉진하였으며, 마우스 비장 및 흉선세포의 아집단 분석 결과 비장의 B세포와 T세포의 Th세포 및 Tc세포 모두를 증가시키는 것으로 보아 이를 항진시킴으로서 면역력을 조절하는 것으로 사료된다. 또한 clonogenic assay에 의해 얻어진 마우스 섬유육종세포에 대한 ESMR의 시험관내 세포독성 효과는 0.
- 0004 으로 나타났다. ESMR과 비교 실험을위한 각각의 추출물 농도에서 고려인삼은 세포독성 효과를 거의 나타내지 않았으나, 가시오갈피, 홍삼, 영지의 경우에는 현저한 세포독성 효과를 나타냈다.
- 02으로 나타났다. ESMR과 비교실험을 위한 고려인삼 추출물 농도 0.25, 2.5 mg/ml의 경우는 모두 1.0을 나타냈고, .홍삼 추출물 농도 0.
- 06 생존율을 나타내 우수한 세포독성을 나타냈다. ESMR과 비교실험을 위한 영지 및 홍삼에서 강한 세포독성을 나타내었으나, 인삼은 세포독성을 나타내지 않았다. 이러한 결과는 저자들이 전에 시행한 연구시기에서 얻어진 결과와 유사하였다.
- ESMRe 마우스 섬유 육종 세포에 대해 강한 세포독성 효과를 나타냈다. FSa II를 접종한 마우스에서 방사선 단독 보다 ESMR을 병용한 경우 방사선에 의한 세포손상이 약 50% 이상 증가되었으며, 두군 간의 차이는 통계학적 의미를 나타냈다.
- 결론적으로 ESMRe in vitro 실험에서 마우스 비장 세포의 생존율을 유의성 있게 증가시켰다. In vivo 실험에서는 비장 내 B세포 및 T세포를 증가시켰으나, 흉선세포에 대해서는 증가를 보이지 않았다.
- 것으로 사료된다. 또한 clonogenic assay에 의해 얻어진 마우스 섬유육종세포에 대한 ESMR의 시험관내 세포독성 효과는 0.2, 2 mg/ml 농도에서 각각 0.36, 0.06 생존율을 나타내 우수한 세포독성을 나타냈다. ESMR과 비교실험을 위한 영지 및 홍삼에서 강한 세포독성을 나타내었으나, 인삼은 세포독성을 나타내지 않았다.
- 또한 방사선 병용평가에 있어서 방사선 단독 보다, ESMR과 병용하였을 때 더욱 강한 세포독성을 나타냈다. 이는 ESMR의 세포독성 효과가 방사선조사 시 세포 독성과 병용되어 세포독성이 증가됨으로서 항종양효과를 나타내는 것으로 판단되며, 가시오갈피 뿌리 추출물을 투여할 경우 보다 적은 양의 방사선을 조사하더라도 소기의 치료 효과를 얻을 수 있을 것으로 사료된다.
- 6%의 증가를 나타냈다. 비장세포에 대해서 ESMRe 농도 의존적으로 증식 효과를 나타낸 반면, 흉선세포에 대해서는 낮은 증가율을 나타냈다.
- 결과는 Table 1과 같다. 비장세포의 B celle 41.5 (±1.3)에서 46.0 (±1.5)%로, T celle 16.9 (±0.9)에서 22.3 (±1.2)%로 증가하였으며, 특히 Th celle 10.4 (±0.7)에서 14.2 (±0.8)%로, Tc celle 3.6 (±0.4)에서 5.6 (±0.3)%로 증가하였다(p< 0.05). 그러나 흉선세포에서 T 림프구 증가율은 거의 보이지 않았다.
- 0073- 세포독성을 나타냈다. 즉 ESMR을 접촉 후 방사선 조사를 할 경우, 방사선에 의한 세포손상이 약 50% 이상 증가되었고, 두 군 간의 차이는 통계학적 의미를 나타냈다(p=0.0002).
후속연구
- 나타냈다. 이는 ESMR의 세포독성 효과가 방사선조사 시 세포 독성과 병용되어 세포독성이 증가됨으로서 항종양효과를 나타내는 것으로 판단되며, 가시오갈피 뿌리 추출물을 투여할 경우 보다 적은 양의 방사선을 조사하더라도 소기의 치료 효과를 얻을 수 있을 것으로 사료된다.
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