락토페린 유전자도입 piggyBac 벡터에 의한 누에 형질전환 Germ Line Transformation of the Silkworm, Bombyx mori L. with a piggyBac Vector Harboring the Human Lactoferrin Gene원문보기
락토페린cDNA 유전자를 도입시킨 누에 형질전환 실험을 수행한 결과, 다음과 같은 결과를 얻을 수 있었다. 1. 사람 GI-101 세포주의 mRNA로부터 클로닝 된 락토페린 cDNA 유전자의 개시코돈 ATG와 종결코돈 TAA를 포함하는 open reading frame(2,136 bp) 영역을 확인하였다. 2. Sf9 배양세포의 조추출물 시료에 의한 Western blot 분석 결과, 락토페린으로 추정되는 약 80kDa의 단백질 발현을 확인하였다. 3. 누에 형질전환에 높은 전이효율과 활성을 나타내는 트랜스포존을 이용한 전이벡터 pPIGA3GFP를 개조하여 락토페린 cDNA를 삽입시킨 전이벡터 pPT-HLf를 구축하였다. 4. DNA 미량 주사법에 의한 누에 형질전환 개체의 발현 비율은 약 6.7% 정도를 나타냈다. 5. 형질전환 누에(G0) 동일한 세대간 교배 및 처리하지 않은 성충간의 역교배에 의한 차세대(G1) 개체로부터 락토페린 유전자와 동일한 크기의 2.1 kb DNA 단편을 확인 할 수 있었으며, 형질전환 G1 세대의 조추출물 시료에 의한 Western blot 분석 결과, 표준 락토페린 항체와 반응하는 약 80 kDa의 단백질 발현을 확인할 수 있었다.
락토페린 cDNA 유전자를 도입시킨 누에 형질전환 실험을 수행한 결과, 다음과 같은 결과를 얻을 수 있었다. 1. 사람 GI-101 세포주의 mRNA로부터 클로닝 된 락토페린 cDNA 유전자의 개시코돈 ATG와 종결코돈 TAA를 포함하는 open reading frame(2,136 bp) 영역을 확인하였다. 2. Sf9 배양세포의 조추출물 시료에 의한 Western blot 분석 결과, 락토페린으로 추정되는 약 80kDa의 단백질 발현을 확인하였다. 3. 누에 형질전환에 높은 전이효율과 활성을 나타내는 트랜스포존을 이용한 전이벡터 pPIGA3GFP를 개조하여 락토페린 cDNA를 삽입시킨 전이벡터 pPT-HLf를 구축하였다. 4. DNA 미량 주사법에 의한 누에 형질전환 개체의 발현 비율은 약 6.7% 정도를 나타냈다. 5. 형질전환 누에(G0) 동일한 세대간 교배 및 처리하지 않은 성충간의 역교배에 의한 차세대(G1) 개체로부터 락토페린 유전자와 동일한 크기의 2.1 kb DNA 단편을 확인 할 수 있었으며, 형질전환 G1 세대의 조추출물 시료에 의한 Western blot 분석 결과, 표준 락토페린 항체와 반응하는 약 80 kDa의 단백질 발현을 확인할 수 있었다.
Lactoferrin, an ion-binding 80-kDa glycoprotein, has been suggested to have many biologic activities, such as facilitating ion absorption and having antimicrobial and anti-inflammatory effects. Several of these activities are likely to only be facilitated by human lactoferrin because they depend on ...
Lactoferrin, an ion-binding 80-kDa glycoprotein, has been suggested to have many biologic activities, such as facilitating ion absorption and having antimicrobial and anti-inflammatory effects. Several of these activities are likely to only be facilitated by human lactoferrin because they depend on the binding of human lactoferrin to specific receptor. To produce recombinant human lactoferrin to animal foods using transgenic silkworm, Bombyx mori L, we have cloned and sequenced the cDNA encoding for a human lactoferrin (HLf) from the mRNA in mammary tumor line (GI-101). As a result, the 2.5-kb fragment of HLf gene was cloned with pGEM-T vector and then this fragment was sequenced. In the nucleotide sequence analysis, single open reading frame of the 2,136-bp encoding for a polypeptide of 712 amino acid residues was detected. On the other hand, we constructed a recombinant plasmid(pPT-HLf), containing human lactoferrin gene for germ line transformation of the silkworm using a piggyBac transposon-derived vector. A nonautonomous helper plasmid encodes the piggyBac transposase. Approximately 6.7% of individuals in the G0 silkworms expressed green fluorescent protein (GFP). PCR analyses of GFP-positive silkworms (G0 and G1) revealed that independent insertions occurred frequently. Furthermore, Western blot analysis showed that the recombinant HLf expressed in hemolymph has the same molecular weight (80 kDa) as a native protein. On the basis of these experiments, expression of HLf in next generation of transgenic silkworm is now in process.
Lactoferrin, an ion-binding 80-kDa glycoprotein, has been suggested to have many biologic activities, such as facilitating ion absorption and having antimicrobial and anti-inflammatory effects. Several of these activities are likely to only be facilitated by human lactoferrin because they depend on the binding of human lactoferrin to specific receptor. To produce recombinant human lactoferrin to animal foods using transgenic silkworm, Bombyx mori L, we have cloned and sequenced the cDNA encoding for a human lactoferrin (HLf) from the mRNA in mammary tumor line (GI-101). As a result, the 2.5-kb fragment of HLf gene was cloned with pGEM-T vector and then this fragment was sequenced. In the nucleotide sequence analysis, single open reading frame of the 2,136-bp encoding for a polypeptide of 712 amino acid residues was detected. On the other hand, we constructed a recombinant plasmid(pPT-HLf), containing human lactoferrin gene for germ line transformation of the silkworm using a piggyBac transposon-derived vector. A nonautonomous helper plasmid encodes the piggyBac transposase. Approximately 6.7% of individuals in the G0 silkworms expressed green fluorescent protein (GFP). PCR analyses of GFP-positive silkworms (G0 and G1) revealed that independent insertions occurred frequently. Furthermore, Western blot analysis showed that the recombinant HLf expressed in hemolymph has the same molecular weight (80 kDa) as a native protein. On the basis of these experiments, expression of HLf in next generation of transgenic silkworm is now in process.
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문제 정의
본 연구는 위와 같은 연구결과에 주목하여 첨단 생명공학 기법을 이용한 누에의 기능성 연구의 일환을 누에로부터 사람의 초유에 많이 함유된 항세균 및 면역증진물질인 락토페린을 생산하는 형질전환 누에를 개발하고자 하였다.
제안 방법
et al.(2000)이 사용한전이벡터 pPIGA3GFP를 개조하여 클로닝 한락토페린 cDNA를 삽입한 전이벡터를 구축하였다. 즉 전이벡터는 선택 마커인 GFP 유전자 영역과 락토페린 cDNA 영역을 각각의 프로모터에 의해 발현될 수 있도록 하였고, 목적 유전자의 전이 활성에 관여하는 helper 플라스미드는 Tamura et al.
12% polyacrylamide-SDS gel(Laemmli, 1970)에 의해 분리된 단백질 시료는 Coomassic Brilliant Blue 염색에 의한 단백질 확인과 함께 Western blot 분석을 수행하였다. SDS-PAGE 전기영동으로 분리된 단백질을 nitrocellulose membrane(Amersham-Pharmacia Biotech)에 전사시켜 3% skim milk로 blocking하고, 1st antibody(anti-rabbit IgG 1 : 1000 TBS buffer로 희석, Amersham Biosciences, UK) 및 2nd antibody(rabbit anti-lactoferrin, 1 : 1000 TBS buffer 희석 , Sigma)와 각각 반응시켰다.
이 형질전환 배지를 실온에서 15분간 반응시킨 후에 2시간 전에 미리 6-well plate에 고정시킨 세포에 분주하였다. 24시간 동안 27℃에서 세포를 배양한 후 lipopectin이 함유된 형질 전환 배지를 제거하고 10% 혈청이 첨가된 배지를 일정량 분주하여 4일간 배양한 세포를 회수하여 발현 단백질 분석에 사용하였다.
2〜3일간 배양한 Sf9 세포를 lipopectin method를 이용하여 재조합 발현벡터에 의한 형질전환 세포를 작성하였다. 즉, 벡터 DNA(pIZT-lacto)와 lipopectin 용액을 혈청과 항생제가 첨가되지 않은 배지에 분리하여 희석한 후 1 : 5의 비율로 함께 혼합한 형질전환 배지를 조제하였다.
3. 누에 형질 전환에 높은 전이 효율과 활성을 나타내는 트랜스포존을 이용한 전이벡터pPIGA3GFP를 개조하여 락토페린 cDNA를 삽입시킨 전이벡터pPT-HLf를 구축하였다.
Sf9 배양세포를 원심분리하여 얻은 시료를 파쇄하여 얻은 조추출물을 단백질 시료로 사용하여 SDS-PAGE를 수행하였다. 그런 다음 lactoferrin 항체를 이용한 Western blot 분석으로 배양세포 내에서 정상적으로 발현벡터 재조합 pIZT-lacto에 의해 외래단백질이 발현되는지 조사하였다.
Taq Dye Deoxy Terminator Cycle sequencing Kit을 이용하여 락토페린 cDNA의 염기배열을 결정하였다. 그 결과 클로닝 된 릭 토페린 cDNA 유전자에서 개시코 돈 ATG와 종결코 돈 TAA를 포함하는 open reading frame(2,136bp) 영역을 확인하였으며(Data 표시안함) NCBI database의 nucleotide homology 검색과도 일치하였다.
그런 다음 lactoferrin 항체를 이용한 Western blot 분석으로 배양세포 내에서 정상적으로 발현벡터 재조합 pIZT-lacto에 의해 외래단백질이 발현되는지 조사하였다. 그 결과 Fig.
사람의 GI-101 세포주에서mRNA를 추출한 후, PCR primers(Hum-lacto Al: AGAACC AGCCGAGTTTCTCA; Hum-lacto Bl: GAATGGCTGAGGCTTTCTTG; Hum-lacto B2: AAGACG ACAGCAGGGAATTG)를 이용하여 cDNA를 합성하였다. 합성된 락토페린 cDNA는 pGEM-T easy벡터(Promega Co.
인시목곤충 중에서도 특히 누에의 형질전환에 높은 전이 효율과 활성을 나타내고 있는 트랜스포존 영역을 이용한 전이벡터pPIGA3GFP를 개조하여 락토페린 cDNA를 삽입시킨 전이벡터pPT-HLf를 구축하였다 (Fig. 4). 즉 전이 벡터 pPT-HLf는 선택 마커 GFP 유전자를 기존의 Actin3 프로모터 영역의 하류에 두고, 발현하고자 하는 목적의 락토페린 cDNA 유전자를 바이러스 유래의 IE2 프로모터영역 하류에 두는 구조를 갖추고 있는 벡터를 구축하였다.
전이벡터(pPT-HLf)와 helper 플라스미드(pHA3PIG)가 도입된 각각의 E. coli를 LB broth 50ml에 배양한 후, Wizard Plus Minipreps DNA Purification Systems(Promega Co.)을 사용하여 플라스미드를 분리 정제하였다. 누에알 주사를 위한 전이 벡터와 helper 플라스 미드의 DNA 혼합용액은 5 mM KCl/0.
주사한 누에 알에서 부화한 세대에서의 형질전환 누에(G0) 및 선발된 성충간 또는 처리하지 않은 성충간의 역교배에 의한 차세대(G1) 개체는 형광현미경을 이용하여 marker 유전자인 녹색형광단백질(GFP)의 발현 유무로 선발하였다.
4). 즉 전이 벡터 pPT-HLf는 선택 마커 GFP 유전자를 기존의 Actin3 프로모터 영역의 하류에 두고, 발현하고자 하는 목적의 락토페린 cDNA 유전자를 바이러스 유래의 IE2 프로모터영역 하류에 두는 구조를 갖추고 있는 벡터를 구축하였다. 한편, 목적 유전자의 전이 활성에 관여하는 helper 플라스미드는 Tamura et al.
2〜3일간 배양한 Sf9 세포를 lipopectin method를 이용하여 재조합 발현벡터에 의한 형질전환 세포를 작성하였다. 즉, 벡터 DNA(pIZT-lacto)와 lipopectin 용액을 혈청과 항생제가 첨가되지 않은 배지에 분리하여 희석한 후 1 : 5의 비율로 함께 혼합한 형질전환 배지를 조제하였다. 이 형질전환 배지를 실온에서 15분간 반응시킨 후에 2시간 전에 미리 6-well plate에 고정시킨 세포에 분주하였다.
합성하였다. 합성된 락토페린 cDNA는 pGEM-T easy벡터(Promega Co.)를 이용하여 subcloning 하였으며 PCR 과정에서 발생할 돌연변이의 가능성을 최소화하기 위하여 pfu enzyme을 PCR에 첨가하고 클로닝 된 cDNA의 염기서 열은 Sp6와 T7 primer(Promega Co.)를 사용하여 2회 이상 결정하였다. 락토 페린 cDNA 단편의 염기배열 결정은 Taq Dye Deoxy Terminator Cycle Sequencing Kit(Perkin- Elmer)을 이용하여 제조사의 설명에 따라 ABI 377 sequencer에 의해 분석하였다.
대상 데이터
즉 전이벡터는 선택 마커인 GFP 유전자 영역과 락토페린 cDNA 영역을 각각의 프로모터에 의해 발현될 수 있도록 하였고, 목적 유전자의 전이 활성에 관여하는 helper 플라스미드는 Tamura et al.(2000)이 구축한 pHA3PIG를사용하였다.
즉 전이벡터는 선택 마커인 GFP 유전자 영역과 락토페린 cDNA 영역을 각각의 프로모터에 의해 발현될 수 있도록 하였고, 목적 유전자의 전이 활성에 관여하는 helper 플라스미드는 Tamura et al.(2000)이 구축한 pHA3PIG를사용하였다.
DNA를 주사한 후의 누에 알은 부화할 때까지 온도 25℃, 습도 70%의 배양기 내에서 보호하였다. 1령 유 충부터 인공사료로 사용하였으며 사육방법은 일반적인 사육법에 준하여 수행하였다. G0 및 G1세대 성충간의 교배는 동일한 형제 세대 또는 수용품종의 성충간 역교배에 의해 수행하였으며, 그 방법은 Fig.
DNA 미량주 사장치를 이용하여 누에 알에 DNA 혼합용액을 주사한 총누에알 개수는 1,907이었으며 그 중에서 형광실체현미경 관찰에 의한 GFP를 발현하는 누에 49 개체를 선발하였고 GFP 발현 개체의 출현비율은 약 6.7% 정도를 나타냈다(Table 1).
, 1989) 준하여 수행하였다. 또한 제한효소를 포함한 유전자 조작 관련 시약 등은 따로 기재되지 않는 한 미국 Promega사와 Sigma사의 제품을 구입하여 사용하였다.
본 연구에서는 농업과학기술원 농업생물부에서 계대 보존하고 있는 다화성 누에 품종인 HM을 사용하였다. DNA를 주사한 후의 누에 알은 부화할 때까지 온도 25℃, 습도 70%의 배양기 내에서 보호하였다.
이론/모형
락토 페린 cDNA 단편의 염기배열 결정은 Taq Dye Deoxy Terminator Cycle Sequencing Kit(Perkin- Elmer)을 이용하여 제조사의 설명에 따라 ABI 377 sequencer에 의해 분석하였다. cDNA 클로닝, 염기배열 결정, 전이 벡터 구축 등 일반적인 유전자조작 실험은 molecular cloning 방법에 (Sambrook et al., 1989) 준하여 수행하였다. 또한 제한효소를 포함한 유전자 조작 관련 시약 등은 따로 기재되지 않는 한 미국 Promega사와 Sigma사의 제품을 구입하여 사용하였다.
)를 사용하여 2회 이상 결정하였다. 락토 페린 cDNA 단편의 염기배열 결정은 Taq Dye Deoxy Terminator Cycle Sequencing Kit(Perkin- Elmer)을 이용하여 제조사의 설명에 따라 ABI 377 sequencer에 의해 분석하였다. cDNA 클로닝, 염기배열 결정, 전이 벡터 구축 등 일반적인 유전자조작 실험은 molecular cloning 방법에 (Sambrook et al.
성능/효과
1. 사람 GI-101 세포주의 mRNA로부터 클로닝 된 락토페린 cDNA 유전자의 개시코돈 ATG와 종결코 돈 TAA를 포함하는 open reading frame(2,136 bp) 영역을 확인하였다.
2. Sf9 배양세포의 조 추출물 시료에 의한 Western blot 분석 결과, 락토페린으로 추정되는 약 80kDa의 단백질 발현을 확인하였다.
4. DNA 미량주 사법에 의한 누에 형질 전환 개체의 발현 비율은 약 6.7% 정도를 나타냈다.
5.형질전환 누에(G0) 동일한 세대 간 교배 및 처리하지 않은 성충 간의 역교배에 의한 차세대(G1) 개체로부터 락토페린 유전자와 동일한 크기의 2.1kb DNA단편을 확인할 수 있었으며, 형질전환 G1 세대의 조 추출물 시료에 의한 Western blot 분석 결과, 표준락토페린 항체와 반응하는 약 80 kDa의 단백질 발현을 확인할 수 있었다.
그런 다음 lactoferrin 항체를 이용한 Western blot 분석으로 배양세포 내에서 정상적으로 발현벡터 재조합 pIZT-lacto에 의해 외래단백질이 발현되는지 조사하였다. 그 결과 Fig. 3[B]에 나타낸 것과 같이 락토페린으로 추정되는 약 80kDa의 발현 단백질을 확인하였다.
Taq Dye Deoxy Terminator Cycle sequencing Kit을 이용하여 락토페린 cDNA의 염기배열을 결정하였다. 그 결과 클로닝 된 릭 토페린 cDNA 유전자에서 개시코 돈 ATG와 종결코 돈 TAA를 포함하는 open reading frame(2,136bp) 영역을 확인하였으며(Data 표시안함) NCBI database의 nucleotide homology 검색과도 일치하였다. 전이벡터 구축을 위해 pBluescript KS 벡터에 subcloning된 락토페린 cDNA 유전자의 restriction map은 Fig.
선택marker로 도입한 녹색형광단백질(GFP) 유전자가 GO 세대의 누에게놈 내로 전이되었음이 PCR 반응으로 확인되었다(결과 표시하지 않음).이 결과를 기초로 하여 G0 세대에서 선발된 형질전환 누에의 동일한 세대 간 교배 및 처리하지 않은 성충간의 역교배에 의한 차세대(G1) 개체에서 강 한 녹색형광단백질(GFP)을 발현하는 개체로부터 분리한 게놈DNA를 이용하여 PCR(Lac-F: 3'-TACGGA'TCCATGAAACTTGTCTTCCTC-5', Lac-R: 3'-TAGGGATCCCTTCCTGAGGAATTCACAGG-5')을 수행한 결과, 형질전환 누에 개체(G1)에서 락토페린 유전자와 동일한 크기의 2.
표시하지 않음).이 결과를 기초로 하여 G0 세대에서 선발된 형질전환 누에의 동일한 세대 간 교배 및 처리하지 않은 성충간의 역교배에 의한 차세대(G1) 개체에서 강 한 녹색형광단백질(GFP)을 발현하는 개체로부터 분리한 게놈DNA를 이용하여 PCR(Lac-F: 3'-TACGGA'TCCATGAAACTTGTCTTCCTC-5', Lac-R: 3'-TAGGGATCCCTTCCTGAGGAATTCACAGG-5')을 수행한 결과, 형질전환 누에 개체(G1)에서 락토페린 유전자와 동일한 크기의 2.1kb DNA단편을 확 인할 수 있었다 (Fig. 6).
한편 G0 세대에서 선발된 형질전환 누에의 동일한 세대 간 교배 및 처리하지 않은 성충간의 역교배에 의한 차세대(G1) 개체에서 강한 녹색형광단백질의 발현을 확인할 수 있었다 (Fig. 5).
한편, 형질전환 Gl 세대의 누에 개체에서 추출한 조추출물을 시료로 하여 Western blot 분석을 수행한 결과, 표준 락토페린 항체와 반응하는 약 80-kDa의 발현 단백질을 확인할 수 있었다 (Fig. 7).
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