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문제 정의
- 2와 같은 일회용 갈락토오즈 측정 바이오센서를 제작하였다. 0 pM에서 400 pM 갈락토오즈 표준용액을 이용하여 제작한 일회용 갈락토오즈 바이오센서의 감응성과 재현성을 조사하여 현장검사 적용 가능성을 연구하였다.
- 통해 그 성능을 조사하였다. 또한 전자전달 매개체의 농도와 인가전위를 조절하여 갈락토오즈 측정센서가 최상의 성능을 나타낼 수 있는 조건을 연구하였다. 먼저 GAO와 HRP의 효소 농도의 비율을 최적화하기 위해 1, 1-forrocenedimethanol의 농도와 인가전위, 완충용액의 농도와 pH 등을 고정화하고 일정 전위를 걸어주어 측정하였다.
- 본 연구에 의해 개발된 갈락토오즈 바이오센서의 감도를 높이기 위해 센서의 감도에 영향을 줄 수 있는 pH 변화에 따른 성능을 조사하였다. 그 결과 Fig.
- 또한 혈당측정기와 같은 휴대용 소형진단기의 개발과 잘 발달된 통신망 및 인터넷을 연결하여 자택 및 원격진료의 기반을 구축하기 위한 연구가 활발히 진행되고 있다. 본 연구에서는 갈락토오즈산화효소와 다양한 전자전달 매개체를 이용하여, 현장검사가 가능한 일회용 갈락토오즈 측정 바이오센서스트립의 개발에 관해 논하고자 한다.
- 본 연구에서는 혈액 내에 존재하는 갈락토오즈 농도의 정량적인 측정이 가능한 센서를 개발하였다. 본연구에 의해 개발된 바이오센서는 낮은 인가전압 하에서 갈락토오즈를 측정할 수 있으므로, 혈액 내에 존재하는 방해종들에 대한 영향을 최소화할 수 있다.
제안 방법
- 약물의 복용으로 혈액 중에 농도가 증가하기도 하는 대표적 방해물질인 ascorbic acid, acetaminophen, uric acid의 영향을 다양한 전위에서 실험하여 비교 조사하였다. 120 pM의 ascorbic acid, 50 pM의 uric acid, 200 pM의 acetaminophen을 0~200 mV의 인가전위에서 측정하였다. 위의 세 가지 방해물질의 농도는 사람의 혈액 내에 들어 있는 방해종의 농도에 근거하여 정하였다.
- 7V)으로 인하여, 시료내 존재하는 방해물질 (ascorbic acid, uric acid, acetaminophen 등) 의영향을 받아 정확한 측정이 어려운 문제를 가지고 있다. Stoecker는 Nafion과 diazobenzene 고분자 막을 이용하여 방해물질이 전극의 표면에 확산되는 것을 방지하여 그 영향을 제거하고자 하였고 Mannino는 로듐(rhodium)과 효소를 카본페이스트에 함께 혼합한 후전극위에 올려 인가전압을 낮춤으로써 방해물질의 영향을 제거하고자 하였다.27 그러나 이러한 센서들은 센서를 최초로 사용하기 위해 20분 이상의 안정화 시간이 필요하며, 센서를 제작하기 위해 복잡한 여러 단계를 거쳐야하는 단점이 있다.
- szab 와 Glee, Ekinci는 갈락토오즈와 갈락토오즈 산화효소의 반응에 의해 생성된 과산화수소를 정 량함으로써갈락토오즈를 측정하였다. 그러나 이러한 방법은 높은 인가전압(0.
- 인가전압의 높아짐에 따라감응전류가 비례해서 증가하는 것을 볼 수 있다. 그러나 높은 인가전압을 적용할 경우 생체 시료 내 존재하는 방해물질의 영향으로 오차가 발생할 수 있는 점을 고려해 감응신호가 비교적 크고, 방해물질의 영향을 덜 받는 100 mV의 인가전압을 이후의 실험에 적용하였다. Fig.
- 따라서 이러한 방해물질들의 영향을 제거하기 위하여 다양한 연구가 진행되어 왔으며, 그 중 대표적인 것으로 반응에 의해 생성된 과산화수소만을 선택적으로 투과시키고, 방해물질이 전극에 도달하는 것을 차단하기 위한 나피온(Na Gon), cellulose acetate와 같은 투과막을 도입하는 것에 관한 연구가 진행되어 왔다. 그러나 투과 막을 센서의 표면에 도입할 경우 측정시간이 증가하고, 감도가 떨어 질 수 있으므로, 본 연구에서는 전자 전달매개체와 HRP 효소를 도입하여 인가전압을 낮춤으로써 방해물질의 영향을 최소화하였다. 본 연구에서는 실제 피 속에 포함되어 있는 양보다 많은 양의 방해물질을 첨가하여 실험 하였다.
- 먼저 GAO와 HRP의 효소 농도의 비율을 최적화하기 위해 1, 1-forrocenedimethanol의 농도와 인가전위, 완충용액의 농도와 pH 등을 고정화하고 일정 전위를 걸어주어 측정하였다. 다음으로 인가전위를 최적화하기 위해 1, 1 -ferrocenedimethanol-el 농도와 완충용액의 농도와 pH, 효소의 비율 등을 고정시킨 뒤 인가전위의 변화에 따른 감응성을 조사하였다. 같은 방법으로 전자전달매개체의 농도를 최적화하였으며 바탕용액으로는 0.
- 0에서 가장 큰 활성을 가지고, 또한 가장 큰 감응 신호를 나타내는 것을 볼 수 있다. 따라서 이 후의 실험은 pH 7.0의 0.05M phosphate 완충용액을 이용해 효소를 고정화하여 제작한 센서로 진행하였다.
- 또한 전자전달 매개체의 농도와 인가전위를 조절하여 갈락토오즈 측정센서가 최상의 성능을 나타낼 수 있는 조건을 연구하였다. 먼저 GAO와 HRP의 효소 농도의 비율을 최적화하기 위해 1, 1-forrocenedimethanol의 농도와 인가전위, 완충용액의 농도와 pH 등을 고정화하고 일정 전위를 걸어주어 측정하였다. 다음으로 인가전위를 최적화하기 위해 1, 1 -ferrocenedimethanol-el 농도와 완충용액의 농도와 pH, 효소의 비율 등을 고정시킨 뒤 인가전위의 변화에 따른 감응성을 조사하였다.
- 본 연구에서 갈락토오즈 검출 가능성을 확인한 후 GAO와 HRP 효소를 다양한 비율로 전극에 고정화한후 100-500 piM 갈락토오즈 표준용액에 대한 감응신호를 통해 그 성능을 조사하였다. 또한 전자전달 매개체의 농도와 인가전위를 조절하여 갈락토오즈 측정센서가 최상의 성능을 나타낼 수 있는 조건을 연구하였다.
- 본 연구에서는 갈락토오즈 산화효소(Galactose oxidase; GAO)에 의해 갈락토오즈를 선택적으로 산화시킨 후 반응에 의해 생성된 과산화수소를 horseradish peroxidase(HRP)24-27 효소로 환원시키고, 전자전달매개체(electron mediator)가 전극으로부터 전자를 받아산화된 효소에 전자를 전달하는 감응 메카니즘에 의해 갈락토오즈를 전기화학적 방법으로 측정하였다 (Fig. 1 참조).
- 본 연구에서는 스크린 프린팅 방법을 이용하여 대량생산이 용이하고, 가격이 저렴하며, 현장에서 바로측정 할 수 있는 Fig. 2와 같은 일회용 갈락토오즈 측정 바이오센서를 제작하였다. 0 pM에서 400 pM 갈락토오즈 표준용액을 이용하여 제작한 일회용 갈락토오즈 바이오센서의 감응성과 재현성을 조사하여 현장검사 적용 가능성을 연구하였다.
- 그러나 투과 막을 센서의 표면에 도입할 경우 측정시간이 증가하고, 감도가 떨어 질 수 있으므로, 본 연구에서는 전자 전달매개체와 HRP 효소를 도입하여 인가전압을 낮춤으로써 방해물질의 영향을 최소화하였다. 본 연구에서는 실제 피 속에 포함되어 있는 양보다 많은 양의 방해물질을 첨가하여 실험 하였다. 전자전달매개체 인 1, 1-ferrocenedimethanc)l는 100 mV (vs.
- 스크린 프린팅 방법을 이용하여 작동전극과 기준전극으로 구성된 일회용 갈락토오즈 측정 바이오센서를제작하였다. 작동전극 위에 1, 1 -ferrocenedimethanole-도포하여 건조시킨 후 GAO와 HRP를 그 위에 도포하여 50℃ oven에 약 10분간 고정화 시켜 스트립형태의 일회용 센서를 제작하였다.
- 물질이 함께 존재한다. 약물의 복용으로 혈액 중에 농도가 증가하기도 하는 대표적 방해물질인 ascorbic acid, acetaminophen, uric acid의 영향을 다양한 전위에서 실험하여 비교 조사하였다. 120 pM의 ascorbic acid, 50 pM의 uric acid, 200 pM의 acetaminophen을 0~200 mV의 인가전위에서 측정하였다.
- 120 pM의 ascorbic acid, 50 pM의 uric acid, 200 pM의 acetaminophen을 0~200 mV의 인가전위에서 측정하였다. 위의 세 가지 방해물질의 농도는 사람의 혈액 내에 들어 있는 방해종의 농도에 근거하여 정하였다.
- 유리질 탄소전극에 전자전달매개체와 중성의 계면활성제 Triton-XlOO을 혼합한 용액을 일정 량 도포하고건조시킨 후 GAO와 HRP가 혼합된 용액 일정 량을물리적 흡착법으로 고정화한 후 외부 보호막으로는 HPU를 사용하여 센서를 제조하였다. Fig.
- 유리질 탄소전극을 이용하여 최적화된 조건으로 바이오센서 를 제작하였다. Fig.
- 4(c)는 센서 제작 시 전자전달매개체의농도 변화에 따른 300 uM 갈락토오즈 표준용액에 대한 감응 전류의 크기를 나타낸 그래프로서 1, 1-ferrocenedimethanol의 농도가 1 mM 일때 최대의 전류를 나타내었다. 이상의 결과에 기초해서 1 mM 1, 1-ferrocenedimethanol 전자전달매개체와 GAO와 HRP 효소를 1:1 비율로 고정화한 갈락토오즈 바이오센서를 제작하고, 100 mV의 인가전압을 적용하여 시료내갈락토오즈를 측정하였다.
- 27 그러나 이러한 센서들은 센서를 최초로 사용하기 위해 20분 이상의 안정화 시간이 필요하며, 센서를 제작하기 위해 복잡한 여러 단계를 거쳐야하는 단점이 있다. 이에 본 연구에서는 탄소 반죽을 이용해 스크린 프린팅 방법으로 전극을 제작하고, 1, 1 -ferrocenedimethanol 전자전달매개체를 사용하여 방해물질의 영향을 줄이고, 빠른 시간에 안정화되는 센서를 제작하였다. 스크린프린팅 방법을 이용한 센서는 생산 공정 이 간편하여 대 량생산과 소형화가 용이하고 이로 인해 제작 단가를 절감할 수 있는 장점이 있다.
- 작동전극 위에 1, 1 -ferrocenedimethanole-도포하여 건조시킨 후 GAO와 HRP를 그 위에 도포하여 50℃ oven에 약 10분간 고정화 시켜 스트립형태의 일회용 센서를 제작하였다. Fig.
- 05 M phosphate buffer, pH 7을 사용하였다. 최적화된 효소의 비율 및 전자전달매개체 농도, 반응시간, 완충용액의 농도 및 pH를 실험을 통하여결정한 후 이를 바탕으로 100 mV (vs. Ag/AgCl)의 인가전압을 사용하여 최적화 실험을 진행하였다.
- 탄소 반죽과 스크린 프린팅 방법을 이용하여 스트립형태의 일회용 전극(screen printed carbon electrode, SPCE) 을 제작하였다. 제작된 스트립 형태의 전극은 2전극계로서 탄소 반죽으로 제작한 작동전극과 은 반죽으로 제작한 기준전극으로 구성되었다.
- 폴리에스터(PE; polyester) 필름을 지지체로 사용하고, DuPont사의 탄소 반죽과 ASAHI사의 은 반죽, 그리고 JUJO 사의 AC-3G 제품을 절연체로 사용하여 스크린 프린팅 방법으로 전극을 제작하였다.
- 1. 효소를 이용한 갈락토오즈 바이오센서의 제작갈락토오즈 바이오센서는 유리질 탄소전극 또는 스크린 프린트된 전극위에 전자전달매개체를 먼저 dispensing을 통해 유리질 탄소전극 위에 고정화하고 GAO와 HRP가 혼합된 용액을 고정화하여 제작하였다. 먼저 1, 1 -ferrocenedimethanol( 1 mM)”-"과 중성의 계면활성제 (triton XI00)를 0.
대상 데이터
- 실험에 사용된 상용 작동전극으로는 BAS사의 MF-2070 유리 질 탄소전극 (glassy carbon electrode; GCE, d= 3 mm)을 사용하였고, 보조전극으로는 백금선 전극을, 그리고 기준전극으로는 CH Instruments사의 CHI 111 A이AgCl(3 M KC1) 전극을 사용하였다. 탄소 반죽과 스크린 프린팅 방법을 이용하여 스트립형태의 일회용 전극(screen printed carbon electrode, SPCE) 을 제작하였다.
- 전극 성능평가 시 약으로 D-(+)-galactose (≥ 98 %), L-ascorbic acid (>99%), uric acid (>99%), acetammophen (98 %) 도 Sigma-aldrich사의 제품을 사용하였다. 완충용액에 사용된 potassium chloride anhydrous (99.99 %), sodium hydrogenphosphate (99.995 %), sodium dihydrogenphosphate (99.999 %)는 Aldrich사(Milwaukee, USA)의 제 품을 사용하였다.
- Louis, MO, USA) 제품을 사용하였다. 전극 성능평가 시 약으로 D-(+)-galactose (≥ 98 %), L-ascorbic acid (>99%), uric acid (>99%), acetammophen (98 %) 도 Sigma-aldrich사의 제품을 사용하였다. 완충용액에 사용된 potassium chloride anhydrous (99.
- 0에 혼합하여 서로 교반시킨 후 전자전달매개체 용액과 동일한 방법으로 전극 위에 고정화하였다. 전자 전달매개체와 효소의 손실을 방지하기 위해 HPU (Hydrophilic Polyurethane)를 외부 보호막으로 사용하였다.
- 탄소 반죽과 스크린 프린팅 방법을 이용하여 스트립형태의 일회용 전극(screen printed carbon electrode, SPCE) 을 제작하였다. 제작된 스트립 형태의 전극은 2전극계로서 탄소 반죽으로 제작한 작동전극과 은 반죽으로 제작한 기준전극으로 구성되었다. Fig.
- 효소 용액 제조에 사용된 galactose oxidase (GAO) 는 Worthington사(U.S.A)의 제품을 사용하였고, horseradish peroxidase (HRP)와 전자전달매 개 체 인 1, 1-ferrocenedimethanol (98 %, FcDMOL)은 Sigma-aldrich 사(St. Louis, MO, USA) 제품을 사용하였다. 전극 성능평가 시 약으로 D-(+)-galactose (≥ 98 %), L-ascorbic acid (>99%), uric acid (>99%), acetammophen (98 %) 도 Sigma-aldrich사의 제품을 사용하였다.
이론/모형
- 전류법 (amperometry) 측정은 전기 화학 분석 기 (BAS 100B, USA)를 사용하였으며, 저 장된 자료의 도식화및 해석은 Wavematrix사(Lake Oswego, OR, USA)의 Igor 프로그램을 사용하여 처리 하였다.
성능/효과
- 7은 이렇게 제작한 갈락토오즈 바이오센서의 갈락토오즈 농도변화에 따른 검정곡선 그래프이다. 각 농도에서 3회 반복측정한 결과 L8 nA/μM의 기울기를 가지고, 우수한선형성(r2 = 0.99)을 나타내는 검정곡선을 얻을 수 있었다. 각 농도에서의 변동계 수(selTicient of variation; CV)를 구하여 재현성을 살펴본 결과 Table 1에서 볼수 있듯이 대부분의 농도에서 CV 5 % 이하의 우수한재현성을 나타냈다.
- 99)을 나타내는 검정곡선을 얻을 수 있었다. 각 농도에서의 변동계 수(selTicient of variation; CV)를 구하여 재현성을 살펴본 결과 Table 1에서 볼수 있듯이 대부분의 농도에서 CV 5 % 이하의 우수한재현성을 나타냈다.
- 또한 저농도인 0~200(1M에서도 측정 이 가능하여 신생아 검진 시에 갈락토오즈혈증 여부를 결정하는데 사용 가능함을 확인할 수 있었다. 개발된 갈락토오즈 측정 바이오센서는 기존의 분광법이나 크로마토그래피법 등보다 더 빠른 시간 안에 측정 이 가능하고 소형화가 가능하다. 따라서 제작된 일회용 갈락토오즈 바이오센서는 임상측정이 가능한 현장측정용 바이오센서로서 유용하게 활용될 수 있을 것으로 예상된다.
- pH 변화에 따른 성능을 조사하였다. 그 결과 Fig. 3에서 볼 수 있듯이 GAO 효소는 pH 7.0에서 가장 큰 활성을 가지고, 또한 가장 큰 감응 신호를 나타내는 것을 볼 수 있다. 따라서 이 후의 실험은 pH 7.
- 본연구에 의해 개발된 바이오센서는 낮은 인가전압 하에서 갈락토오즈를 측정할 수 있으므로, 혈액 내에 존재하는 방해종들에 대한 영향을 최소화할 수 있다. 또한 저농도인 0~200(1M에서도 측정 이 가능하여 신생아 검진 시에 갈락토오즈혈증 여부를 결정하는데 사용 가능함을 확인할 수 있었다. 개발된 갈락토오즈 측정 바이오센서는 기존의 분광법이나 크로마토그래피법 등보다 더 빠른 시간 안에 측정 이 가능하고 소형화가 가능하다.
- 5는 다양한 인가전압에서방해물질을 포함하는 각각 시료(120 μM ascorbic acid, 50 μM uric acid, 200 μM acetaminophen) 에 대한 갈락토오즈 바이오센서의 감응전류 크기를 나타낸그래프이다. 본 연구에 의해 개발된 갈락토오즈 바이오센서는 ascorbic acid를 제외한 acetaminophen, uric acid는 0~200 mV 인가전압(vs Ag/AgCl) 하에서 방해작용을 받지 않는 것으로 나타났다.
- 본연구에 의해 개발된 바이오센서는 낮은 인가전압 하에서 갈락토오즈를 측정할 수 있으므로, 혈액 내에 존재하는 방해종들에 대한 영향을 최소화할 수 있다. 또한 저농도인 0~200(1M에서도 측정 이 가능하여 신생아 검진 시에 갈락토오즈혈증 여부를 결정하는데 사용 가능함을 확인할 수 있었다.
후속연구
- 개발된 갈락토오즈 측정 바이오센서는 기존의 분광법이나 크로마토그래피법 등보다 더 빠른 시간 안에 측정 이 가능하고 소형화가 가능하다. 따라서 제작된 일회용 갈락토오즈 바이오센서는 임상측정이 가능한 현장측정용 바이오센서로서 유용하게 활용될 수 있을 것으로 예상된다.
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