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문제 정의
- 따라서 본 연구는 인삼과 국내산 및 중국산 산양삼, 자연산 산삼의 열수 추출물과 국내산 산양삼으로 증류 추출한 산삼약침의 항산화작용을 평가하고, 특히 산양삼과 산삼이 암세포의 성장을 얼마나 억제하며 생존 증가 효과를 나타내는가를 비교해 보고자 시도되었다.
- 따라서 본 연구에서는 자연산 산삼과 국내산 산양삼, 그리고 중국산 산양삼의 항산화효과와 항암효과를 알아보기 위해 열수 추출한 추출물과 증류 추출한 약침을 in vitro에서 xanthine oxidase 환원 법 을 이용하여 SOD 유사활성 효과를 측정 하였고, ICR mouse에 colon 26- L5(CT-26) human colon cancer cell line을 이용하여 피부암과 복강암을 유발한 후, 추출물을 경구 투여하고 암세포의 성장억제효과와 생존율의 차이를 비교한 결과 유의한 결론을 얻어 이에 보고하는 바이다.
- 중요한 역할을 하는 효소이다. 본 실험은 산삼추출물의 활성산소 제거 효과를 확인하기 위해 HX/XOD system에서 superoxide의 발생을 유도하고 이것이 DCFDA와 반응하여 형광을 나타내는 원리를 이용하였다. 만일 이 반응계에 존재하는 산삼추출물이 SOD와 유사한 효과가 있어서 생성된 superoxide를 scavenging하면 DCFDA와의 반응이 감소하고, 따라서 형광의 강도가 감소될 것이다.
- 산삼약침을 제외한 모든 시료들은 고전적 섭취 방법인 열수추출법을 동일하게 적용하여 어떠한 차이를 나타내는가를 관찰하고자 시도하였다.
제안 방법
- 6마리 의 ICR mouse를 한 군으로 하여 CT-26 cancer cell을 복부의 피하에 이식한 후 아무런 처치를 하지 않은 대조군과 국내산 산양삼군(K-CWG), 중국산 산양 삼군(C-CWG), 자연산 산삼군(WG)으로 나누어 암세포의 성장억제 효과를 평 가하였다. CT-26 결장암세포의 성장을 육안으로 확인한 후 종류별 산삼 추줄물을 하루에 100(/1 씩 매일 경구투여하면서 종양의 크기를 종양 발생 후 9일부터 3일 간격으로 종양의 체적을 측정하였다.
- 사용하였다. CT-26 결장암세포를 mouse의 북 강에 이식한 후 암세포의 성장을 육안으로 확인한 다음(Fig. 5)종류별 추출물을 하루에 100M 씩 매일 경구투여하면서 종양의 체적을 측정하였다,
- 평 가하였다. CT-26 결장암세포의 성장을 육안으로 확인한 후 종류별 산삼 추줄물을 하루에 100(/1 씩 매일 경구투여하면서 종양의 크기를 종양 발생 후 9일부터 3일 간격으로 종양의 체적을 측정하였다. 그 결과 실험군 모두 12일째부터 대조군에 비하 여유의 하게 종양의 성장을 억제하였고, 15일과 18일에서도 유의한 억 제 효과를 나타내 었다(Table 6.
- HX/XOD system에 존재하는 국내산 10년근 산양삼 추출물의 농도에 따른 항산화 효능을 평가하였다. 0.
- HX/XOD system에 존재하는 국내산 인삼 추출물의 농도에 따른 항산화 효능을 평가하였다. 0.
- HX/XOD system에 존재하는 산삼약침의 농도에 따른 항산화 효능을 평가하였다. O.
- HX/XOD system에 존재하는 인삼과 국내산 및 중국산 산양삼, 자연산 산삼 추출물의 항산화작용을 비교하여 보았다.대부분의 시료들이 hng/의 농도에서 항산화 효과가 급격하게 증가하였고, 산삼추출물의 종류에 따라 대조군에 비해 활성산소가 약 10배에서 약 29배까지 제거되는 효과를 나타내었다.
- HX/XOD system에 존재하는 자연산 산삼 추출물의 농도에 따른 항산화 효능을 평가하였다. 0.
- HX/XOD system에 존재하는 중국산 산양삼 10년근 추출물의 농도에 따른 항산화 효능을 평가하였다. 0.
- 각 실험군은 10마리를 한 군으로 하여 mouse의 복강 안에 CT-26 종양세포를 이식한 후 복강암을 유발하였고, 아무런 처치를 하지 않은 대조군과 자연산 산삼군 (WG)의 두 군으로 나누어 시행하였다' 대조군에는 생리식염수를, 산삼군은 자연산 산삼 추출물을 하루에 100씩 매일 경구투여하면서 생존률의 변화를 측정하였다.
- 각 실험군은 6마리를 한 군으로 하여 종양을 피하에 이식한 후 아무런 처치를 하지 않은 대조군과 국내산 산양 삼군(K-CWG), 중국산 산양삼군(C-CWG), 자연 산산 삼군(WG)으로 나누어 시행하였고 모든 시료는 열수 추출물을 사용하였다. CT-26 결장암세포를 mouse의 북 강에 이식한 후 암세포의 성장을 육안으로 확인한 다음(Fig.
- 각 실험군을 10마리로 하여 종양을 복강에 이식한 후 아무런 처치를 하지 않은 대조군과 자연산 산삼 열수 추출물을 하루에 100씩 매일 경구 투여한 실험군(WG)의 두 군으로 나누어 복강암 유발 후부터 생존 기간을 관찰하였다. 그 결과 대조군은 복강에 CT-26ceB 을 주입한 후 10일째부터 죽기 시작하였고 10마리 모두 사망하는데 19일이 걸렸으나, 자연산산삼 투여군에서는 14일째부터 죽기 시작하여 모두 사망하는데 25일이 걸렸다.
- 산삼과 국내산 및 중국산 산양삼, 인삼의 항산화 효과를 알아보기 위해 DCFDA system에서 xanthine oxidase 환원법을 이용하여 SOD 유사활성 효과를 관찰하였고, 산삼과 산양삼의 항암효과를 관찰하기 위해 CT-26 human colon cancer cell을 이용하여 mouse에 피부암과 복강암을 유발한 후 암세포의 성장억제효과와 생존율의 차이를 측정한 결과 다음과 같은 결론을 얻었다.
- 산삼추출물의 활성산소 제거 효과는 hypoxanthine/ xanthine oxidase (HX/XOD) system에서 발생 하는 superoxide를 얼마나 잘 제거하는지 실험하는 방법으로 측정하였다. 제거되지 않은 superoxide는 반응액에 포함되어 있는 DCFDA와 반응하여 형광을 나타내게 된다.
- 먼저 산양삼을 흐르는 물에 깨끗이 세척하여 뇌두를 제거하지 않은 100g의 산삼을 1200 ml 의 3차 증류수와 배합한 후 2시간 전탕하여 찌꺼기는 따로 분리하고, 전탕액을 무균실에 있는 증류 추출기에 넣고 전탕하여 1,000ml의 약침을 얻었다. 얻어진 약침을 0.45, 0.2여과지로 2회 여과한 후, 멸균된 용기에 일정 용량 주입하였고, 밀봉하여 멸균기에 다시 멸균과정을 거친 후 시료를 준비하였다
- 시작하였다. 전탕 시에는 약재의 유효성분이 달아나지 못하도록 환류냉각을 시행하였고, impellar speed는 4.5-5로, 환류 냉각관에는 5℃ 의 냉각수가 흐르도록 한 후 3시간 동안 100℃로 가열하여 산삼과 한국산 및 중국산 산양삼, 그리고 인삼 열 추출물을 얻었다.
- 항산화 방법은 형광법을 이용한 DCFDA로 측정하였고, 암세포의 성장억제효과와 생존율 평가는 human colon cancer cell 인 colon26-L5(CT-26) 암세포주를 mouse 의 복부에 있는 피하와 복강에 주입하여 암을 유발한 후 시행하였다.
대상 데이터
- 10년근 산양삼을 사용하였다. 국내산은 충남 서천시에 있는 천방농산에서 재배한 것을 사용하였고, 중국산은 吉林省 戊松市에 있는 해발 1600m의 장백산 내에서 재배한 것을 사용하였으며, 재배자가 직접 파종 시기를 확인할 수 있는 삼만을 실험에 사용하였다(Fig. 2-3).
- 본 실험에 사용된 암세포주는 결장암세포인 colon26- L5(이하 CT-26)로 한국 세포주 은행으로부터 분양받아 사용하였다. CT-26 세포주는 Dulbeco's Eagle modified medium(DMEM)에 10%의 fetal bovine serum(FBS) 이 함유된 것으로 tissue culture plate에 이식 한 후 COz와 95% air의 배양기에서 37℃를 유지하며 배양하였다.
- 본 실험에 사용한 산양삼은 1995년에 파종하여 재배한 10년근 산양삼을 사용하였다. 국내산은 충남 서천시에 있는 천방농산에서 재배한 것을 사용하였고, 중국산은 吉林省 戊松市에 있는 해발 1600m의 장백산 내에서 재배한 것을 사용하였으며, 재배자가 직접 파종 시기를 확인할 수 있는 삼만을 실험에 사용하였다(Fig.
- 본 실험에 사용한 인삼은 10년 이상 한약관련 분야에 종사한 전문가가 직접 강원도 홍천군의 인삼 재배 농가에서 채취한 5년근 인삼을 줄기와 잎은 제거하고 뿌리만 실험에 사용하였다.
- 본 실험에 사용한 자연산 산삼은 2005년 7월 장백산에서 채집한 것으로 길이는 40cm, 무게는 21.45g, 그리고 추정 연령은 30년 전후이며 중국의 길림성 연길시에 있는 國家蔘茸 품질감독기관에서 자연산 산삼으로 인증 받은 후 실험에 사용하였다
- 산양삼은 산삼 혹은 산양삼의 종자를 적절한 환경에서 재배한 것으로 수령은 10년 전후로, 무게는 10g 내외의 국내산 산양삼을 사용하였다. 먼저 산양삼을 흐르는 물에 깨끗이 세척하여 뇌두를 제거하지 않은 100g의 산삼을 1200 ml 의 3차 증류수와 배합한 후 2시간 전탕하여 찌꺼기는 따로 분리하고, 전탕액을 무균실에 있는 증류 추출기에 넣고 전탕하여 1,000ml의 약침을 얻었다.
- 실험에 사용된 동물은 체중 20g 내외의 암컷 ICR mouse(오리엔트 바이오)로 2주 동안 고형사료와 물을 충분히 주며 실험실 환경에 적응시킨 후 사용하였다.
- 실험에 사용된 인삼은 재배시기를 정확하게 파악하기 위하여 직접 인삼 농가에서 5년근을 확보하여 사용하였고, 국내산 산양삼, 중국산 산양삼 모두 재배자가 1995년에 파종한 10년생 삼을 확보하여 실험에 사용하였다.
- 자연산 산삼은 장백산에서 채취한 수령 30년 전후의 삼을 전문가의 감정을 확인한 후 사용하였다.
- 반응시키는 동안 10분 간격으로 Beckman DTX 800/880 inicroplate reader를 사용하여 형광을 측정하였다. 측정에 사용된 시료는 산삼, 국내산 및 중국산 산양삼, 인삼 추출물과 증류 추출한 산삼 약침을 측정하였고, 대조군은 추출물 대신 93.75/zM ascorbic acid가 추가로 포함된 것을 사용하였다. 이 때 excitation wavelength는 485 이고 emission wavelength 는 535 nm이었다.
데이터처리
- Plate background는 xanthine oxidase가 포함되지 않은 반응액을 사용하여 측정하였으며 모든 측정값에서 plate background 값은 제외하였다. 모든 실험 조건은 세 배수로 수행하였으며 결과 값은 평균 土 표준오차로 나타내었다.
- 실험결과는 SPSS Version 10.0을 이용하여 student't- test를 시행하였고, 각 군별 항산화작용의 비교에서는 일표본 t-test를 시행하였으며 유의수준은 0.05로 검증하였다.
성능/효과
- 따른 항산화 효능을 평가하였다. 0.01 mg/ml 에서 20mg/ml까지 농도를 다양하게 하여 DCFDA에 의한 형광 값을 측정한 결과 농도의존성으로 항산화작용이 증가하는 것을 알 수 있었다. 특히 의 농도 조건에서 그 효과가 급격하게 증가하였다.
- 따른 항산화 효능을 평가하였다. 0.01 mg/ml 에서 20mg/ml까지 농도를 다양하게 하여 DCFDA에 의한 형광 값을 측정한 결과 농도의존성으로 항산화작용이 증가하는 것을 알 수 있었다. 특히 의 농도 조건에서 그 효과가 급격하게 증가하였다.
- 따른 항산화 효능을 평가하였다. 0.01 mg/ml 에서 20mg/ml까지 농도를 다양하게 하여 DCFDA에 의한 형광 값을 측정한 결과 농도의존성으로 항산화작용이 증가하는 것을 알 수 있었다. 특히 의 농도 조건에서 그 효과가 급격하게 증가하였다.
- 1. HX/XOD system에서 인삼과 중국산 산양삼, 한국산 산양삼, 자연산 산삼의 항산화작용을 측정한, 결과 모든 시료에서 유의하게 농도 의존적 경향을 나타내는 항산화작용이 있음을 알 수 있었다. 특히 Img/ ml 의 농도에서 항산화 효과가 급격하게 증가하는 공통점을 나타내었다.
- 2. CT-26cancercelI을 복부의 피하에 이식한 후 암세포의 성장억제효과를 평가한 결과 중국산 산양삼, 한국산 산양삼 그리고 자연산 산삼 열수 추출물 투여군 모두 12일째부터 대조군에 비하여 유의하게 종양의 성장을 억제하였고, 15일과 18일에서도 유의한 억제효과를 나타내었다. 그러나 중국산, 한국산 산양삼과 자연산 산삼군 간의 유의한 차이는 나타내지 않았다.
- 3. 자연산 산삼의 경구 복용이 암으로 인한 사망률에 어떠한 영향을 미치는지 알아보고자 CT-26 cancer cell을 mouse의 복강에 이식하여 복강암을 유발한 후 생존기간을 관찰한 결과 대조군에 비하여 자연산 산삼 열수추출물을 투여한 실험군에서 31.6%의 생존 증가율을 나타내었음을 알 수 있었다.
- CT-26 cancer cell을 mouse의 복부 피 하에 이 식 한 후 암세포의 성장억제효과를 평가한 결과 중국산 산양삼, 한국산 산양삼 그리고 자연산 산삼열수 추출물 투여군 모두 12일째부터 대조군에 비하여 유의하게 종양의 성장을 억제하였고, 15일과 18일에서도 유의한 억제 효과를 나타내었다. 그러나 중국산, 한국산 산양삼과 자연 산산 삼군 간의 유의한 차이는 나타내지 않았다.
- HX/XOD system에서 인삼과 중국산 산양삼, 한국산 산양삼, 자연산 산삼의 항산화작용을 측정한 결과 모든 시료에서 유의하게 농도 의존적 경향을 나타내는 항산화 작용이 있음을 알 수 있었다. 특히 Img/id 의 농도에서 항산화 효과가 급격하게 증가하는 공통점을 나타내었고, 산삼추출물의 종류에 따라 대조군에 비해 활성산소가 약 10배에서 약 29배까지 제거되는 효과를 나타내었다.
- 효능을 평가하였다. O.Olmg/ml 에서 20 mg/ml까지 농도를 다양하게 하여 DCFDA에 의한 형광 값을 측정한 결과 농도의존성으로 항산화작용이 증가하는 것을 알 수 있었다.특히 의 농도조건에서 그.
- 관찰하였다. 그 결과 대조군은 복강에 CT-26ceB 을 주입한 후 10일째부터 죽기 시작하였고 10마리 모두 사망하는데 19일이 걸렸으나, 자연산산삼 투여군에서는 14일째부터 죽기 시작하여 모두 사망하는데 25일이 걸렸다. 따라서 산삼투여군은 대조군에 비하여 31.
- CT-26 결장암세포의 성장을 육안으로 확인한 후 종류별 산삼 추줄물을 하루에 100(/1 씩 매일 경구투여하면서 종양의 크기를 종양 발생 후 9일부터 3일 간격으로 종양의 체적을 측정하였다. 그 결과 실험군 모두 12일째부터 대조군에 비하 여유의 하게 종양의 성장을 억제하였고, 15일과 18일에서도 유의한 억 제 효과를 나타내 었다(Table 6. & Fig. 12)
- 보았다.대부분의 시료들이 hng/의 농도에서 항산화 효과가 급격하게 증가하였고, 산삼추출물의 종류에 따라 대조군에 비해 활성산소가 약 10배에서 약 29배까지 제거되는 효과를 나타내었다. 이 효과는 대표적인 항산화제 인 93.
- 그 결과 대조군은 복강에 CT-26ceB 을 주입한 후 10일째부터 죽기 시작하였고 10마리 모두 사망하는데 19일이 걸렸으나, 자연산산삼 투여군에서는 14일째부터 죽기 시작하여 모두 사망하는데 25일이 걸렸다. 따라서 산삼투여군은 대조군에 비하여 31.6%의 생존 증가율을 나타내었다(Eg. 13).
- 6%의 생존 증가율을 나타내어 산삼의. 복용이 암의 발현을 어느 정도 억제하고 생존을 증가시켜주는 효과가 있음을 알 수 있었다. 하지만 이러 한 결과는 권 등 Sarcoma-180 복강암 모델에서 산양삼을 증류하여 조제한 산삼약침을 mouse의 미정 맥에 주입하였을 때 생존증가율 115%를 나타낸 것과 비교하였을 때 상당히 낮은 수준임을 알 수 있었다.
- 암 발생시에 자연산 산삼의 경구 복용이 생존율 증가에 어떠한 영향을 미치는지를 관찰하기 위하여 CT-26 cancer cell을 mouse의 복강에 이식 한 후 아무런 처치를 하지 않은 대조군과 자연산 산삼 열수추출물을 경구투여한 실험군의 생존율을 관찰한 결과 산삼 추출물 경구 투여군에서 31.6%의 생존 증가율을 나타내어 산삼의. 복용이 암의 발현을 어느 정도 억제하고 생존을 증가시켜주는 효과가 있음을 알 수 있었다.
- 일표본 분석을 통한 인삼의 항산화작용은 Noimal Saline에 비하여 전 구간에서 유의한 항산화작용을 나타내 었다(Table 2. & Fig. 7).
- 일표본 분석을 통한 인삼의 항산화작용은 Normal Sae에 비하여 전 구간에서 유의한 항산화작용을 나타내었다(Table 1.& Fig. 6).
- 일표본 분석을 통한 인삼의 항산화작용은 Normal SalEe에 비하여 전 구간에서 유의한 항산화작용을 나타내 었다(Table 5. & Fig. 10).
- 일표본 분석을 통한 자연산 산삼의 항산화작용은 Normal Saline에 비하여 전 구간에서 유의한 항산화 작용을 나타내 었 다(Table 4. & Fig. 9).
- 일표본 분석을 통한 중국산 산양삼의 항산화작용은 Normal Saline에 비하여 전 구간에서 유의한 항산화 작용을 나타내 었다(Table 3. & Fig. 8).
- 있음을 알 수 있었다. 특히 Img/id 의 농도에서 항산화 효과가 급격하게 증가하는 공통점을 나타내었고, 산삼추출물의 종류에 따라 대조군에 비해 활성산소가 약 10배에서 약 29배까지 제거되는 효과를 나타내었다. 이 효과는 대표적인 항산화제 인 93.
- 01mg/ml에서 20mg/ml까지 농도를 다양하게 하여 DCFDA에 의한 형광 값을 측정한 결과 농도의존성으로 항산화작용이 증가하는 것을 알 수 있었다. 특히 Img/ml의 농도 조건에서 그 효과가 급격하게 증가하였고 가장 우수한 항산화 작용을 나타내었다.
- 01 mg/ml 에서 20mg/ml 까지 농도를 다양하게 하여 DCFDA 에 의한 형광 값을 측정한 결과 농도의존성으로 항산화 작용이 증가하는 것을 알 수 있었다. 특히 Img/nil의 농도 조건에서 그 효과가 급격하게 증가하였고 가장 우수한 항산화작용을 나타내었다.
- 01 mg/ml 에서 20mg/ml 까지 농도를 다양하게 하여 DCFDA 에 의한 형광 값을 측정한 결과 농도의존성으로 항산화 작용이 증가하는 것을 알 수 있었다. 특히 lmg/ml의 농도 조건에서 그 효과가 급격하게 증가하였고 가장 우수한 항산화 작용을 나타내었다.
- 복용이 암의 발현을 어느 정도 억제하고 생존을 증가시켜주는 효과가 있음을 알 수 있었다. 하지만 이러 한 결과는 권 등 Sarcoma-180 복강암 모델에서 산양삼을 증류하여 조제한 산삼약침을 mouse의 미정 맥에 주입하였을 때 생존증가율 115%를 나타낸 것과 비교하였을 때 상당히 낮은 수준임을 알 수 있었다.
- 특히 의 농도조건에서 그. 효과가 급격하게 증가하였고, 농도가 높아질수록 우수한 항산화 작용을 나타내어 20mg/ml에서 가장 우수한 항산화 작용을 나타내었다.
후속연구
- 이는 동일한 약재라 하더라도 제형의 변화나 투여 방법에 따라 상당히 다른 결과가 나올 수 있다는 것과 암세포의 종류에 따라 효능의 차이가 있을 수 있음을 가정할 수 있으므로 향후 이에 대한 후속 연구가 진행되어야 할 것으로 생각된다.
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