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문제 정의
- 본 연구는 인삼과 산양삼, 그리고 자연산 산삼의 특이적인 ginsenoside 함량 패턴을 확보하고, 인삼과 산양삼을 홍삼화시켰을 때 어떠한 성분의 변화가 일어나는지 관찰하고자 시도되었다.
- 본 연구진은 인삼과 산양삼 등이 함유하고 있는 수종의 ginsenosides들이 홍삼화 과정이라는 열 자극에 의해 어떠한 형태로 성분이동이 일어나고 그 양은 얼마나 되는지, 그리고 각각의 시료에서 어떠한 차이를 나타내는지를 규명하고자 하였다.
- 이에 인삼과 산양삼 그리고 자연산 산삼의 성분의 차이를 확보하기 위해 HPLC(High Performance Liquid Chromatography, 이하 HPLC)로 각각의 뿌리에 함유된 10여 종의 ginsenosides를 측정한 후 그 차이를 비교 분석하였고, 각각의 삼류들이 홍삼화 과정에서 어떠한 성분의 변화가 일어나는지를 추적하기 위하여 4년근 및 6년근 인삼과 수령 8-9년의 산양삼에 열을 가하여 홍삼화 처리한 후 ginsenosides의 변화를 분석한 결과 유의한 결론을 얻었기에 보고하는 바이다.
제안 방법
- )의 농축기를 사용하였고, 분석용 HPLC로는 Varian 9012 Solvent Delivery System, 검출기는 Varian Variable Wavelength 9050 UV-VIS detector, 그리고 Autosampler는 Varian 9300을 사용하였다. AcCN, MeOH 등의 분석시약은 모두 HPLC용 시약을 사용하여 측정하였으며, 추출 및 분획용 용매는 모두 특급시약을 사용하여 실험하였다.
- 비극성 사포닌류의 패턴 분석을 위한 표준액은 ginsenoside Rb1, Rb2, Rc, Rd, Re, Rf, Rg1, Rg3, Rh1 그리고 Rh2의 10종 표준품을 각각 100㎍/㎖씩 취한 후 MeOH 1㎖에 녹인 후 0.45㎛ membrane filter로 여과하여 사용하였고, 검액은 얻어진 시료 외에 n-BuOH 분획물 10㎎을 취한 후 MeOH 1㎖에 녹인 후 0.45㎛ membrane filter로 여과하여 분석하였다.
-
6) 10종 표준품의 HPLC chromatogram과 분석시료의 chromatogram 양상
상기에서 제시한 방법에 따라 HPLC로 분석하여 표준품 ginsenoside Rb1, Rb2, Rc, Rd, Re, Rf, Rg1, Rg3, Rh1 그리고 Rh2와 수종의 삼류에 대한 각각의 chromatogram을 얻은 후 정량 평가하였다(Fig. 3). 정량 평가에서 얻어진 값 중 최고와 최저치를 제외한 5개의 샘플의 평균을 구한 후 비교 분석하였다.
- 의 10종 표준품을 이용하여 검량선을 작성한 후 비교 분석하였다. 수종의 산삼, 산양삼 및 4년근과 6년근 인삼을 사포닌 제조방법25)에 따라 사포닌 주성분을 함유한 80% MeOH extract와 n-BuOH 분획물을 제조한 후 분석에 사용하였다.
- 수종의 삼류에 대하여 ginsenoside Rb1, Rb2, Rc, Rd, Re, Rf, Rg1, Rg3, Rh1 그리고 Rh2의 10종에 대한 함량 분석을 실시하였다.
- 연구방법으로는 삼류의 성분 분석에 유효하다고 알려진 HPLC를 이용하여22-24) ginsenoside Rb1, Rb2, Rc, Rd, Re, Rf, Rg1, Rg3, Rh1 그리고 Rh2의 10종 표준품을 이용하여 검량선을 작성한 후 비교 분석하였다. 수종의 산삼, 산양삼 및 4년근과 6년근 인삼을 사포닌 제조방법25)에 따라 사포닌 주성분을 함유한 80% MeOH extract와 n-BuOH 분획물을 제조한 후 분석에 사용하였다.
- 음건한 삼류(1-20g)에 80% MeOH 100-500㎖를 가하여 수욕 상에서 3시간씩 3회 환류 추출하고 여과 후 농축하여 80% MeOH 추출물을 얻었다. 얻어진 80% MeOH 추출물을 증류수에 현탁시켜 n-hexane, EtOAc 및 n-BuOH 순으로 분획한 후 농축하여 사포닌 주성분 분획물인 n-BuOH 분획물을 얻었다.
- 인삼 4년근과 6년근 그리고 산양삼을 홍삼화 시킨 후 ginsenoside Rb1, Rb2, Rc, Rd, Re, Rf, Rg1, Rg3, Rh1 그리고 Rh2의 10종에 대한 함량 분석 결과를 비교하였다.
- 인삼 및 산양삼이 홍삼으로 되는 과정에서 나타난 ginsenoside의 함량 변화를 관찰하기 위하여 모든 시료를 흐르는 물에 깨끗이 세척한 후 고압증숙기 안에 가지런히 세운 후 95-100℃에서 15시간 동안 증숙하였다. 증숙이 끝난 시료들은 다시 건조를 위해 95-100℃에서 72시간 동안 각각의 시료들이 타지 않도록 주의를 기울이면서 건조시켜 실험에 사용하였다.
- 인삼과 산양삼, 그리고 산삼의 특이적인 ginsenoside 함량 패턴을 확보하고, 인삼과 산양삼을 홍삼화 시켰을때 어떠한 성분의 변화가 일어나는지 관찰하고자 HPLC를 이용하여 ginsenoside Rb1, Rb2, Rc, Rd, Re, Rf, Rg1, Rg3, Rh1 그리고 Rh2의 함량을 비교 분석하여 다음과 같은 결론을 얻었다.
- 3). 정량 평가에서 얻어진 값 중 최고와 최저치를 제외한 5개의 샘플의 평균을 구한 후 비교 분석하였다.
- 표준품 ginsenoside Rb1, Rb2, Rc, Rd, Re, Rf, Rg1, Rg3, Rh1 그리고 Rh2의 10종 표준품을 각각 500, 400, 300, 200, 100, 50㎍/㎖ 농도로 희석하여 분석하여 얻은 각각의 ginsenoside에 대한 피크 면적비 (X축)와 표준품 농도 (Y축)에 대한 검량선을 각각 작성하였다. 그 결과 각 ginsenoside류의 검량선의 함수와 상관계수 R2값은 Table 2.
대상 데이터
- Rotary vacuum evaporator는 Eyela (Tokyo Co.)의 농축기를 사용하였고, 분석용 HPLC로는 Varian 9012 Solvent Delivery System, 검출기는 Varian Variable Wavelength 9050 UV-VIS detector, 그리고 Autosampler는 Varian 9300을 사용하였다. AcCN, MeOH 등의 분석시약은 모두 HPLC용 시약을 사용하여 측정하였으며, 추출 및 분획용 용매는 모두 특급시약을 사용하여 실험하였다.
- 본 실험에 사용한 산양삼은 충남 서천시에 있는 천방 농산에서 1999-2000년 사이에 파종한 수령 8-9 년생 중 무작위로 추출된 7개의 샘플을 사용하였다(Fig. 1-B).
- 본 실험에 사용한 인삼은 4년근과 6년근으로 강화농협에서 구입하여 각각 7뿌리씩 무작위로 추출하여 실험에 사용하였다(Fig. 1-C&D).
- 본 실험에 사용한 자연산 산삼은 2009년 6-8월 장백산에서 채집한 것으로 뿌리의 길이는 7-30㎝ 전후이었고, 무게는 5-20g 추정 연령은 20-50년인 7개의 삼을 전문가의 감정을 통해 자연산으로 인증 받은 후 실험에 사용하였다(Fig. 1-A).
- 얻어진 80% MeOH 추출물을 증류수에 현탁시켜 n-hexane, EtOAc 및 n-BuOH 순으로 분획한 후 농축하여 사포닌 주성분 분획물인 n-BuOH 분획물을 얻었다. 조사포닌 n-BuOH 분획물을 사포닌의 패턴 분석을 위한 시료로 사용하였다(Fig. 2).
성능/효과
- 1. Ginsenoside Rb1, Rc, Rd, Rf, Rg1, 그리고 Rh1의 함량은 산삼 > 4년근 인삼 > 6년근 인삼 > 산양삼의 순으로 나타났다.
- 2. Ginsenoside Rb2와 Re의 함량은 4년근 인삼 > 산삼 > 산양삼 > 6년근 인삼의 순으로 나타났다.
- 3. Ginsenoside Rg3의 함량 분석에서는 산삼과 산양삼에서만 미량 검출되었고 4년근 인삼과 6년근 인삼은 모든 시료에서 검출되지 않았다.
- 4. Ginsenoside Rh2의 함량 분석에서는 산양삼에서만 미량 검출되었고 산삼에서는 검출되지 않았다.
- 5. 산양삼은 홍삼화 과정을 통해 ginsenoside Rb1, Rb2, Rc, Rd, Rg3, 그리고 Rh1이 증가하였고, Re와 Rg1이 감소하였음을 알 수 있었다.
- 6. 인삼 4년근은 홍삼화 과정을 통해 ginsenoside Rb1, Rd와 Rf는 큰 변화를 나타내지 않았고, Rg3, Rh1은 증가하였으며 ginsenoside Rb2, Rc, 그리고 Re는 감소하였음을 알 수 있었다.
- 7. 인삼 6년근은 홍삼화 과정을 통해 ginsenoside Rb1, Rb2, Rf, Rg3 그리고 Rh1은 증가하였고, Rc와 Rd 는 소폭 감소하는 경향을 나타내었다.
- ginsenoside Rg3의 함량 분석에서는 산삼과 산양삼에서 미량 검출되었고 4년근 인삼과 6년근 인삼은 모든 시료에서 검출되지 않았다.
- ginsenoside Rh2의 함량 분석에서는 산양삼에서 미량 검출되었고 산삼에서는 검출되지 않았는데, 이러한 결과는 ginsenoside Rh2가 산삼의 특유 성분으로 보기에는 무리가 있음을 알 수 있었다.
- 각각의 변화를 관찰하기 위하여 분석을 진행한 결과 산양삼은 홍삼화 과정을 통해 ginsenoside Rb1, Rb2, Rc, Rd, Rg3, Rh1이 증가하였고, Re와 Rg1이 감소하였음을알 수 있었다.
- 각각의 변화를 관찰한 결과 산양삼은 홍삼화 과정을 통해 ginsenoside Rb1, Rb2, Rc, Rd, Rg3, 그리고 Rh1이 증가하였고, Re와 Rg1이 감소하였음을 알 수 있었다.
- 각각의 시료들에 대한 회수율은 다양하게 나타났고, 홍삼화 과정에서 산양삼의 홍삼 수율이 인삼 4년근과 6년근에 비하여 월등하게 높은 것이 특이한 점이었다.
- 그 결과 Fig. 6에서 제시한 것처럼 인삼 4년근이 6년근이나 산양삼에 비하여 Rb1, Rb2, Rc, Re, 그리고 Rg1의 함량이 많은 것을 알 수 있었다.
- 그 결과 Fig. 7에서 제시한 것처럼 인삼 4년근보다 6년근이나 산양삼에서 Rb1, Rb2, Rc의 함량이 많이 증가한 것을 알 수 있었다. 인삼 4년근은 홍삼화 과정에서 Re와 Rg1이 상대적으로 많이 감소하였음을 알 수 있었다.
- 수종의 삼류를 홍삼화 시킨 후 ginsenoside에 대한 함량 분석을 실시한 결과 인삼 4년근보다 6년근이나 산양삼에서 Rb1, Rb2, Rc의 함량이 많이 증가한 것을 알 수 있었다. 인삼 4년근은 홍삼화 과정에서 Re와 Rg1이 상대 적으로 많이 감소하였음을 알 수 있었다.
- 수종의 삼류에 대하여 ginsenoside Rb1의 함량 분석을 실시한 결과 산삼은 3.52±1.21㎎/g, 산양삼은 1.18±0.18㎎/g, 4년근 인삼은 2.55±0.51㎎/g, 6년근 인삼은 1.39±0.54㎎/g을 나타내어 ginsenoside Rb1의 함량은 산삼 > 4년근 인삼 > 6년근 인삼 > 산양삼의 순으로 나타났다.
- 수종의 삼류에 대하여 ginsenoside Rb2의 함량 분석을 실시한 결과 산삼은 1.50±0.91㎎/g, 산양삼은 1.04±0.08㎎/g, 4년근 인삼은 2.16±0.43㎎/g, 6년근 인삼은 0.95±0.35㎎/g을 나타내어 ginsenoside Rb2의 함량은 4년근 인삼 > 산삼 > 산양삼 > 6년근 인삼의 순으로 나타났다.
- 수종의 삼류에 대하여 ginsenoside Rc의 함량 분석을 실시한 결과 산삼은 1.76±0.81㎎/g, 산양삼은0.71± 0.10㎎/g, 4년근 인삼은 1.56±0.32㎎/g, 6년근 인삼은 0.90±0.35㎎/g을 나타내어 ginsenoside Rc의 함량은 산삼 > 4년근 인삼 > 6년근 인삼 > 산양삼의 순으로 나타났다.
- 수종의 삼류에 대하여 ginsenoside Rd의 함량 분석을 실시한 결과 산삼은 0.61±1.21㎎/g, 산양삼은 0.22± 0.04㎎/g, 4년근 인삼은 0.41±0.06㎎/g, 6년근 인삼은 0.23±0.10㎎/g을 나타내어 ginsenoside Rd의 함량은 산삼 > 4년근 인삼 > 6년근 인삼 > 산양삼의 순으로 나타났다.
- 수종의 삼류에 대하여 ginsenoside Re의 함량 분석을 실시한 결과 산삼은 0.80±0.23㎎/g, 산양삼은 0.76± 0.06㎎/g, 4년근 인삼은 1.27±0.22㎎/g, 6년근 인삼은 0.64±0.24㎎/g을 나타내어 ginsenoside Re의 함량은 4년근 인삼 > 산삼 > 산양삼 > 6년근 인삼의 순으로 나타났다.
- 수종의 삼류에 대하여 ginsenoside Rf의 함량 분석을 실시한 결과 산삼은 0.37±0.14㎎/g, 산양삼은 0.18± 0.06㎎/g, 4년근 인삼은 0.31±0.04㎎/g, 6년근 인삼은 0.18±0.05㎎/g을 나타내어 ginsenoside Rf의 함량은 산삼 > 4년근 인삼 > 6년근 인삼 = 산양삼의 순으로 나타났다.
- 수종의 삼류에 대하여 ginsenoside Rg1의 함량 분석을 실시한 결과 산삼은 1.48±0.65㎎/g, 산양삼은 0.54± 0.20㎎/g, 4년근 인삼은 1.00±0.18㎎/g, 6년근 인삼은 0.69±0.11㎎/g을 나타내어 ginsenoside Rg1의 함량은 산삼 > 4년근 인삼 > 6년근 인삼 > 산양삼의 순으로 나타났다.
- 수종의 삼류에 대하여 ginsenoside Rh1의 함량 분석을 실시한 결과 산삼은 0.15±0.04㎎/g, 산양삼은 0.03± 0.00㎎/g, 4년근 인삼은 0.08±0.03㎎/g, 6년근 인삼은 0.04±0.01㎎/g을 나타내어 ginsenoside Rh1의 함량은 산삼 > 4년근 인삼 > 6년근 인삼 > 산양삼의 순으로 나타났다.
- 수종의 삼류에 대하여 ginsenoside Rh2의 함량 분석을 실시한 결과 자연산 산삼과 4년근 인삼, 그리고 6년근 인삼에서는 모든 시료에서 검출되지 않았고, 산양삼에서 0.01±0.02㎎/g이 검출되었다.
- 수종의 삼류에 대하여 ginsenoside Rh3의 함량 분석을 실시한 결과 산삼은 0.01±0.01㎎/g, 산양삼은 0.01±0.01㎎/g을 나타내었고, 4년근 인삼과 6년근 인삼은 모든 시료에서 검출되지 않았다.
- 수종의 삼류에 대한 ginsenoside의 함량 분석을 실시한 결과 ginsenoside Rb1, Rc, Rd, Rf, Rg1, 그리고 Rh1의 함량은 산삼 > 4년근 인삼 > 6년근 인삼 > 산양삼의 순으로 나타나 자연산 산삼과 비교했을 때 4년근 인삼에 ginsenoside의 함량이 높은 것이 특징적이었다.
- 인삼 4년근은 홍삼화 과정을 통해 ginsenoside Rb1, Rd와 Rf는 큰 변화를 나타내지 않았고, Rg3, Rh1은 증가하였으며 ginsenoside Rb2, Rc, 그리고 Re는 감소하였음을 알 수 있었다.
- 인삼 6년근은 홍삼화 과정을 통해 ginsenoside Rb1, Rb2, Rf, Rg3 그리고 Rh1은 증가하였고, Rc와 Rd는 소폭 감소하는 경향을 나타내어 산양삼과 유사한 결과를 보이고 있음을 알 수 있었다.
후속연구
- 따라서 ginsenoside 함량분석을 통하여 삼류의 성질이나 효능을 규명하기 위해서는 보다 광범위하고 반복적인 연구가 필요하다고 판단된다.
- 이러한 연구 결과를 바탕으로 향후 보다 더 질환별로 구체적인 성분을 증가시킬 수 있는 용도에 따른 맞춤형 홍삼과 홍산삼의 개발이 이루어지길 기원하는 바이다.
- 이상의 연구 결과 산삼과 산양삼, 그리고 수령에 따른 인삼의 ginsenoside 함량 패턴은 종자나 재배환경, 그리고 산지 등에 따라 개체 차이가 비교적 많이 나타나 함량에 따른 효능의 평가 등의 기준으로 설정하기에 어려움이 많고, 소량의 시료를 대상으로 분석하여 삼의 성격이나 효능을 평가하기에도 무리가 있다고 추정된다.
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