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문제 정의
- 본 연구는 phytoecdysteroid의 주 성분인 20- hydroxyecdysone를 이용하여 조골세포에 미치는 영향을 알아보기 위하여 조골세포의 세포 증식율, 염기 성인산분해효소 활성 및 gelatinase 활성을 관찰하였고, 파골세포에 미치는 영향을 알아보기 위하여 tartrate-저항성 인산분해효소 양성인 다핵세포의 형성을 측정함으로써 phytoecdysteroid가 골조직 세포에 미치는 영향을 알아보고자 하였다.
- 조골세포주를 배양하면서 20-hydroxyecdysone를 배양액에 첨가한 경우 조골 세포의 증식에는 영향을 미치지 못하였다. 염기성 인산분해효소는 조골세포의 표지효소로 이용되며 골조직 형성의 여러 단계에 관여할 것으로 추측되며,15,16)본 연구에서는 phytoecdysteroid가 조골세포의 활성에 미치는 영향을 관찰하기 위하여 조골세포 활성의 지표로 염기성 인산분해효소의 활성을 측정한 결과, 실험에 사용한 모든 농도에서 조골세포의 염기성 인산분해효소 활성을 증가시켰다. 따라서 본 연구 결과에 의하면 phytoecdysteroid가 조골세포에 작용하여 세포 증식에 대한 영향 없이 활성에 영향을 미치는 것으로 사료된다.
- 본 연구는 phytoecdysteroid가 파골세포에 미치는 영향을 알아보기 위하여, 파골세포 전구세포로부터 파골세포의 생성 및 활성에 미치는 영향을 관찰하였다. 뼈조직에서 유일하게 뼈의 파괴를 담당하는 파골세포는 단핵구/대식세포 계통의 세포이며, 여러 조직에 존재하는 단핵구 대식 전구세포로부터 시험관내에서 파골세포의 생성이 가능하다.
제안 방법
- 조골세포의 실험모델로는 HOS 세포주를 사용하였다. 통상적인 방법에 따라 조골세포를 10% FBS, 100 U/ml penicillin G와 100 ㎍/ml streptomycin sulfate 가 첨가된 DMEM을 이용하여 75 ㎠ 배양플라스크에 배양하였다. 배양액을 일주일에 2번씩 교환해 주면서 세포가 단층을 이루면 trypsin-EDTA로 처리하여 세포를 수집한 후 1：10으로 계대배양을 시행하였다.
- 통상적인 방법에 따라 조골세포를 10% FBS, 100 U/ml penicillin G와 100 ㎍/ml streptomycin sulfate 가 첨가된 DMEM을 이용하여 75 ㎠ 배양플라스크에 배양하였다. 배양액을 일주일에 2번씩 교환해 주면서 세포가 단층을 이루면 trypsin-EDTA로 처리하여 세포를 수집한 후 1：10으로 계대배양을 시행하였다. 세포배양 시 37℃의 온도와 95% 습도를 유지하였으며 5% CO2와 95% 공기를 공급하였으며, 세포를 24-well plate에 분주하여 실험에 이용하였다.
- 배양액을 제거하고 여러 농도의 phytoecdysteroid가 첨가된 배양액으로 교환하여 준 후 2일간 배양하였다. 배양이 끝난 후에 trypsin-EDTA 용액을 이용하여 부착된 세포를 모아 인산 완충 생리식염수 (D-PBS, pH 7, Gibco, USA)로 희석시킨 후 광학현미경 (Nikon, Japan)하에서 hemocytometer를 이용하여 계수하였다.
- 개의 세포가 들어가도록 분주하여 배양하면서 여러 농도의 phytoecdysteroid를 배양액 내에 첨가하여 준후 2일간 배양하였다. 배양이 끝난 후 0.1% Triton X-100/saline으로 처리하여 세포추출액을 만들어 염기성 인산분해효소의 활성을 측정하였다. 효소활성의 측정은 일정량의 세포추출액을 기질인 100 mM의 p-nitrophenyl phosphate (pNPP, Sigma)가 포함된 glycine-NaOH 완충액 (pH 10.
- 4)에서 30분간 반응시킨 후 기질인 pNPP에서 분해된 p-nitrophenol의 양을 405 nm의 파장에서 microplate absorbance reader (SLT 400)를 이용하여 비색정량 하였다. 단백질 양은 BCA protein assay reagent를 이용하여 측정하였으며, 효소활성을 nmole substrate/h/mg protein으로 측정하였으며 대조군에 대한 백분율로 나타냈다.
- 10% FBS와 5 ng/ml M-CSF가 포함된 α-MEM으로 100 mm 배양접시에 6×106개 세포가 되도록 분주하여 24시간 전 배양한 후 미부착세포들을 모았다.
- 7-8일간 배양하는 동안 10 ng/ml M-CSF, 1 ng/ml TGF-β 및 50 ng/ml RANKL과 여러 농도의 phytoecdysteroid가 포함된 배양액으로 배양하였으며, 3일과 6일째 신선한 배양액으로 교환하였다.
- 파골세포의 전구세포가 되는 미부착세포를 10% FBS, 10 ng/ml M-CSF and 1 ng/ml TGF-β가 포함된 α-MEM으로 96-well plate에 well당 5×104개의 세포가 되도록 분주하여 배양하였다.
- 배양이 끝난후 각각의 배양액을 모아 원심분리 하여 부유세포를 제거하고 필터형의 concentrator (Centricon TM, Amicon)을 이용하여 배양액을 약 5배 농축하였다. 농축된 배양액은 동량의 2X sample buffer로 혼합한 후 non-reducing 상태로 1 mg/ml의 gelatin이 첨가된 10% SDS-PAGE gel (zymogram gel, Novex, USA) 에 mini-gel electrophoresis system (Xcell Mini-Cell, Novex, USA)을 이용하여 25 mA/gel의 조건으로 전기영동을 시행하였다. 전기영동이 끝난후 renaturing buffer (0.
- 02% Brij 35)로 1회 세척하고 37℃에서 16시간 정도 incubation 하였다. 그 후 gel을 0.5% Coomassie brilliant blue R250으로 45분간 염색한 후 탈색하여 gelatinase 밴드를 관찰하였다.
- 마우스 골수세포를 분리하기 위해 마우스를 경부염전으로 희생시킨 후 대퇴골과 경골을 무균적으로 적출하고 연조직을 제거하였으며, 장골의 양끝을 절단한 후 26G 주사침을 이용하여 한쪽 끝의 골수강에 0.01% collagenase, 0.05% trypsin 및 0.5 mM EDTA 가 포함된 효소 용액 1 ml를 주사하여 골수를 모은후 30분간 37℃에서 교반하여 골수세포를 모아 원심분리한 후, 5초간 증류수로 처리하여 적혈구를 제거한 후 40 ㎛ nylon mesh (Cell strainer, Falcon, USA) 로 여과하여 단일 세포가 되도록 분산시켰다. 10% FBS와 5 ng/ml M-CSF가 포함된 α-MEM으로 100 mm 배양접시에 6×106개 세포가 되도록 분주하여 24시간 전 배양한 후 미부착세포들을 모았다.
- 7-8일간 배양하는 동안 10 ng/ml M-CSF, 1 ng/ml TGF-β 및 50 ng/ml RANKL과 여러 농도의 phytoecdysteroid가 포함된 배양액으로 배양하였으며, 3일과 6일째 신선한 배양액으로 교환하였다. 배양이 끝난 후 파골세포의 생성을 검사하기 위하여 세포를 고정하여 TRAP 염색을 시행하였다.
- MDBM 세포의 배양이 끝난 후 인산완충 생리식염수로 세포를 세척하고 citrate-acetone-formaldehyde 용액으로 고정한 후 tartrate-resistant acid phosphatase (TRAP) 염색을 시행하여 파골세포의 생성정도를 평가하였다. TRAP 염색은 Sigma 사의 TRAP 염색용 kit를 구입하여 제조사의 지시에 따라 시행하였으며, 기질로 naphthol AS-BI phosphate를 이용하였고, 염색제로는 fast Garnet GBC 용액을 사용하였다.
- TRAP 염색은 Sigma 사의 TRAP 염색용 kit를 구입하여 제조사의 지시에 따라 시행하였으며, 기질로 naphthol AS-BI phosphate를 이용하였고, 염색제로는 fast Garnet GBC 용액을 사용하였다. 염색이 끝난 후 광학현미경을 이용하여 핵이 3개 이상인 TRAP-양성 다핵세포를 계수하여 파골세포의 생성지표로 삼았다.
- Phytoecdysteroid가 조골세포에 미치는 영향을 관찰하기 위하여, HOS 세포를 이용하여 조골세포의 세포 증식, 염기성 인산분해효소 활성 및 gelatinase 활성을 측정하였다. 또한 파골세포에 미치는 영향을 관찰하기 위하여 마우스 골수세포를 분리하여 M-CSF 와 RANKL을 처리하여 파골세포의 분화를 유도하였고, TRAP에 양성인 다핵세포의 형성을 관찰하여 파골세포의 생성에 미치는 영향을 알아보았다.
- Phytoecdysteroid가 조골세포에 미치는 영향을 관찰하기 위하여, HOS 세포를 이용하여 조골세포의 세포 증식, 염기성 인산분해효소 활성 및 gelatinase 활성을 측정하였다. 또한 파골세포에 미치는 영향을 관찰하기 위하여 마우스 골수세포를 분리하여 M-CSF 와 RANKL을 처리하여 파골세포의 분화를 유도하였고, TRAP에 양성인 다핵세포의 형성을 관찰하여 파골세포의 생성에 미치는 영향을 알아보았다.
- Phytoecdysteroid가 파골세포의 생성에 미치는 영향을 관찰하기 위하여 파골세포 전구세포를 배양하여 M-CSF와 RANKL을 처리하여 TRAP 양성 다핵 세포인 파골세포의 분화를 유도하였으며, phytoecdysteroid는 TRAP 양성 다핵세포의 형성을 유의하게 감소시켰다 (Fig. 3).
- Phytoecdysteroid가 조골세포의 유기기질 분해에 미치는 효과를 알아보기 위하여, gelatinase의 활성을 측정하였다. 72 KDa의 gelatin을 분해한 띠가 관찰되었으며, 0.
대상 데이터
- Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM), α-minimum essential medium (α-MEM), fetal bovine serum (FBS), trypsin-EDTA 및 배양에 필요한 다른 시약들은 Gibco laboratories로부터 구입하였다 (Gibco, Invitrogen Co. Grand Island, USA).
- 재조합 사람 M-CSF, 재조합 사람 RANKL과 재조합 사람 TGF-β는 PeproTech EC Ltd (USA)으로 부터 구입하였다.
- Grand Island, USA). 세포배양용기들은 Corning (Corning, NY, USA)사로부터 구입하였다. BCA 단백질 정량 시약은 Pierce (Rockford, IL, USA)로부터 구입하였다.
- 세포배양용기들은 Corning (Corning, NY, USA)사로부터 구입하였다. BCA 단백질 정량 시약은 Pierce (Rockford, IL, USA)로부터 구입하였다. 20- hydroxyecdysone은 Sigma chemical company로부터 구입하였다.
- BCA 단백질 정량 시약은 Pierce (Rockford, IL, USA)로부터 구입하였다. 20- hydroxyecdysone은 Sigma chemical company로부터 구입하였다. 재조합 사람 M-CSF, 재조합 사람 RANKL과 재조합 사람 TGF-β는 PeproTech EC Ltd (USA)으로 부터 구입하였다.
- 재조합 사람 M-CSF, 재조합 사람 RANKL과 재조합 사람 TGF-β는 PeproTech EC Ltd (USA)으로 부터 구입하였다. 나머지 다른 시약은 Sigma chemical company (St. Louis, MO, USA)로부터 구입하였다. 실험에 사용된 동물은 6내지 8주된 웅성 ICR 마우스를 사용하였으며 다물 사이언스 (Korea) 로부터 구입하였다.
- Louis, MO, USA)로부터 구입하였다. 실험에 사용된 동물은 6내지 8주된 웅성 ICR 마우스를 사용하였으며 다물 사이언스 (Korea) 로부터 구입하였다.
- 조골세포의 실험모델로는 HOS 세포주를 사용하였다. 통상적인 방법에 따라 조골세포를 10% FBS, 100 U/ml penicillin G와 100 ㎍/ml streptomycin sulfate 가 첨가된 DMEM을 이용하여 75 ㎠ 배양플라스크에 배양하였다.
- MDBM 세포의 배양이 끝난 후 인산완충 생리식염수로 세포를 세척하고 citrate-acetone-formaldehyde 용액으로 고정한 후 tartrate-resistant acid phosphatase (TRAP) 염색을 시행하여 파골세포의 생성정도를 평가하였다. TRAP 염색은 Sigma 사의 TRAP 염색용 kit를 구입하여 제조사의 지시에 따라 시행하였으며, 기질로 naphthol AS-BI phosphate를 이용하였고, 염색제로는 fast Garnet GBC 용액을 사용하였다. 염색이 끝난 후 광학현미경을 이용하여 핵이 3개 이상인 TRAP-양성 다핵세포를 계수하여 파골세포의 생성지표로 삼았다.
데이터처리
- 본 실험의 통계처리는 Student's t test 방법을 사용하였으며, 값은 평균과 표준 오차로 나타냈다.
성능/효과
- Phytoecdysteroid가 조골세포의 활성에 미치는 영향을 알아보기 위하여 조골세포의 표지 효소로 알려진 염기성 인산분해효소의 활성을 검사한 결과, 대조군에 비해 증가하는 경향을 보였으나, 0.032 μM의 농도에서만 유의성 있는 증가를 나타냈다 (Fig. 1).
- Phytoecdysteroid가 조골세포의 세포 증식률에 미치는 영향을 관찰한 결과, 실험에 사용한 모든 농도에서 조골세포의 세포 증식에는 영향을 미치지 못하였다 (Fig. 1).
- 72 KDa의 gelatin을 분해한 띠가 관찰되었으며, 0.032, 0.016, 0.8, 4 및 20 μM의 phytoecdysteroid 처리에 의해 gelatinase의 활성이 현저히 증가되었다 (Fig. 2).
- 염기성 인산분해효소는 조골세포의 표지효소로 이용되며 골조직 형성의 여러 단계에 관여할 것으로 추측되며,15,16)본 연구에서는 phytoecdysteroid가 조골세포의 활성에 미치는 영향을 관찰하기 위하여 조골세포 활성의 지표로 염기성 인산분해효소의 활성을 측정한 결과, 실험에 사용한 모든 농도에서 조골세포의 염기성 인산분해효소 활성을 증가시켰다. 따라서 본 연구 결과에 의하면 phytoecdysteroid가 조골세포에 작용하여 세포 증식에 대한 영향 없이 활성에 영향을 미치는 것으로 사료된다.
- Phytoecdysteroid가 조골세포의 유기기질 분해에 미치는 효과를 알아보기 위하여, gelatinase의 활성을 측정하였다. 본 실험에서 20-hydroxyecdysone는 실험한 모든 농도에서 HOS 세포의 gelatinase의 활성을 현저히 증가시켰다. 따라서 phytoecdysteroid는 조골세포의 gelatinase 효소의 활성을 증가시킴으로 골조직 대사에 영향을 미치리라 생각된다.
- 22) 파골세포가 조혈기관 기원인 것을 이용하여 다수의 파골세포 전구세포를 얻기 위하여 골수세포 배양이 널리 이용되고 있으며23) 이러한 골수세포 배양시 관찰되는 다핵세포는 TRAP 양성 반응을 나타내고 CT 수용체24)를 가지며 석회화된 상아질을 흡수할 때 주름변연을 형성하는25) 등의 파골세포의 특징을 나타내고 있으며, TPAP은 골조직내 다른 세포와 구별할 수 있는 파골세포의 세포화학적 표지효소로 이용된다.26) 본 연구에서는 파골세포 전구세포를 배양하여, M-CSF와 RANKL을 처리하여 TRAP 양성 다핵세포인 파골세포의 분화를 유도하였으며, 20-hydroxyecdysone를 처리한 결과 TRAP 양성 다핵세포의 형성이 유의하게 감소되었다. 위의 결과로 phytoecdysteroid가 파골세포의 생성을 억제시킴을 알 수 있었다.
- 26) 본 연구에서는 파골세포 전구세포를 배양하여, M-CSF와 RANKL을 처리하여 TRAP 양성 다핵세포인 파골세포의 분화를 유도하였으며, 20-hydroxyecdysone를 처리한 결과 TRAP 양성 다핵세포의 형성이 유의하게 감소되었다. 위의 결과로 phytoecdysteroid가 파골세포의 생성을 억제시킴을 알 수 있었다.
후속연구
- 이상의 결과 phytoecdysteroid는 조골세포의 세포증식율에는 영향을 미치지 않았으나, 염기성 인산분해효소 활성과 gelatinase의 활성을 증가시키며 파골 세포 생성을 감소시키는 결과를 나타내었으므로, phytoecdysteroid가 골수의 미세환경에서 세포의 조절작용을 하는 물질로 여겨지며, 정확한 작용기전의 규명이 필요하리라 사료된다.
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