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문제 정의
- 수 많은 미생물이 문헌에 발표된 천연물기질의 대사 능력에 따라 선정되었다. 첫째 목표는 바라는 미생물 전환을 수행하기 위한 유능한 미생물을 동정하는 것이다. 미생물은 토양, 공기, 오물처리 시설에서 분리할 수 있으며 균주 기탁기관에서 순수배양 형태로 얻을 수 있다.
제안 방법
- 1-1% 한천이나 carboxymethylcellulose, polyvinyl alcohol 등의 수용성 중합체를 첨가하여 pellet의 형성을 줄인다. 균사의 성장을 촉진하거나 microcrystalline cellulose를 첨가하여 균사체의 응집을 방지하고 작은 pellet의 형성을 촉진하여 높은 생물전환율을 유도하였다. 최적의 전환 활성을 위해 미생물의 성장과는 별개로 pH, 폭기, 배지 농도 등의 발효 매개 변수들을 최적화할 수 있다.
- 인삼사포닌을 분해하는 β-glucosidase를 세균, 곰팡이, 효모, 담자균 등의 미생물로부터 얻어, protopanaxadiol-type saponin의 당기를 분해하여 희소한 사포닌 Rh1, Rh2를, α-rhamnosidase로 proto- panaxatriol-type 인삼 saponin Re를 가수 분해하여 Rg1을, Rg2를 가수분해하여 Rh1을 제조하였다. 또한 saponin 효소나 이 효소를 생산하는 미생물을 배양하여 혼합 인삼 saponin을 반응시켜서 항암성 saponin Rh1, Rh2의 함량이 높은 혼합 saponin을 생산하였다. (주)일화의 경우, 인삼농축액을 유산균으로 발효하여 암의 전이 억제, 면역증강, 항알레르기 작용이 증강된 락토진생을 개발하여 상업화하였으며 서울대학교와 (주)제일제당의 연구팀은 인삼을 특수 가공하여 홍삼에만 미량이 들어있는 특유의 약효성분인 인삼사포닌 Rg3, Rg5 등이 산삼보다 8배 이상 월등한 선삼을 개발하였다.
- 원광대학교 약학대학 김재백 교수팀에 의해 국내에서 처음으로 4년근 인삼을 적정온도에서 산도(pH), 수분을 조절하여 1개월 가량 발효시킨 다음 말려 분말로 제조 약리성분을 대폭 향상시킨 효삼(酵蔘)을 개발하였다. 또한 일화 중앙연구소와 경희대학교 약학대학 김동현 교수팀에 의해 세계최초 유산균 발효 인삼을 개발하여 인삼 사포닌의 대사 물질인 IH-901의 암 전이 억제 능력과 건강 증진 작용 등을 확인하였다. 인삼 농축액을 유산균으로 발효하여 사포닌 함량과 흡수력을 높여 인삼과 유산균의 효과를 동시에 내는 인삼 제품 락토진생을 출시하여 장내의 부패균 번식을 억제하고 유익균의 번식을 도와 장을 건강하게 하고, 인삼의 항암 및 건강 증진작용 효과를 함께 주는 것이 특징이다.
- 고체 및 액체 배양배지는 Lactobacilli MRS(Difco, Detroit, USA), Bacillus는 nutrient broth(NB, Difco)를, Saccharomyces는 YM broth(Difco), Aspergillus는 potato dextrose 배지(Difco)를 사용하며, 배양조건은 Saccharomyces와 Aspergillus인 경우 30℃에서 Bacillus 는 37℃에서 5일 간 120rpm으로 진탕 배양하며, Lactobacillus는 37℃에서 5일 간 정치배양을 한다. 발효한 인삼을 대상으로 주요 생리활성 성분인 saponin의 함량과 발효에 의해 생성되는 대사산물을 분석하기 위하여 배양액을 MeOH로 추출하고 ethylacetate(EtOAc)로 추출하여 saponin이 포함하고 있는 분획물을 thin layer chromatography(TLC)(silica TLC plate 0.25 ㎜；C/M/W=4/2/1, lower phase)(역상 RP-18 0.20 ㎜；70% MeOH)와 high performance liq- uid chromatography(HPLC)(60～100% MeOH；고정상, YMC C18 column；detector, PDA)하여 saponin의 함량 및 대사산물의 변화를 측정할 수 있다.
- 인삼사포닌을 분해하는 β-glucosidase를 세균, 곰팡이, 효모, 담자균 등의 미생물로부터 얻어, protopanaxadiol-type saponin의 당기를 분해하여 희소한 사포닌 Rh1, Rh2를, α-rhamnosidase로 proto- panaxatriol-type 인삼 saponin Re를 가수 분해하여 Rg1을, Rg2를 가수분해하여 Rh1을 제조하였다.
대상 데이터
- 인삼발효에는 Lactobacillus plantarum KCTC3108, Lactobacillus acidophilus KCTC3155, Bacillus subtilis KCTC1666, Saccharomyces cerevisiae KCTC7919, Aspergillus oryzae KCTC6292 등을 사용한다. 고체 및 액체 배양배지는 Lactobacilli MRS(Difco, Detroit, USA), Bacillus는 nutrient broth(NB, Difco)를, Saccharomyces는 YM broth(Difco), Aspergillus는 potato dextrose 배지(Difco)를 사용하며, 배양조건은 Saccharomyces와 Aspergillus인 경우 30℃에서 Bacillus 는 37℃에서 5일 간 120rpm으로 진탕 배양하며, Lactobacillus는 37℃에서 5일 간 정치배양을 한다.
성능/효과
- 2) 포유류의 대사 경로를 조사하고 미생물 모델에 소급 적용하는 것으로 임시적으로 정한 포유류의 대사산물을 입증하는데 사용되며 두 모델 사이의 생물전환을 더 설명하고 유사함을 설명하는 방법이다. 3) 미생물 모델과 포유류 모델을 동시에 진행하는 것으로 대사산물의 대량생산은 생물학적, 독성학적 평가, 입체화학 및 생성 기작을 규명할 수 있는 방법이다.
- 여러 가지 화학반응 중에서 특히 산화작용을 촉매하는 monooxygenase 반응에서 동물 모델과 미생물 모델은 특별히 유사하며 대사과정의 Phase I 반응에 다양하게 관련되어 있다. Cunninghamella속(C. el- egans, C. echinulata)와 Beauveria bassiana은 포유류 모델, 기관, 세포 system에 의해 작동되는 모든 종류의 전환을 모방할 수 있는 것으로 알려졌다. 그러나 이러한 균주들이 폭 넓은 대사 능력을 가지고 있지만 실제 동물 대사산물의 모든 과정을 다루기 위해서는 이미 활성이 알려진 다른 균주를 사용할 경우가 있으며 특히 단일 대사산물을 높은 수율로 필요로 할 때 이용된다.
- 그러므로 원료로 사용되는 수삼은 saponin을 비롯한 여러 가지 유효성분이 고분자 구성성분과 연결되어 있어서 우리가 이것을 섭취했을 경우, 체내에서 분해되어 흡수를 할 수가 없으면 좋은 효과를 볼 수 없으며, 자연 건조된 백삼의 경우 수삼보다는 열수 추출법에 의해 유효성분이 추출이 되어도 체내에서의 분해는 불완전하여 좋은 효과를 기대하기가 어렵다. 가열 건조한 홍삼 역시, 유효성분의 추출은 가능하나 체내 분해 면에서는 불완전하여 더 좋은 효과를 보기 위해서는 열수 추출을 한 뒤 섭취하고 있으며, 홍삼 추출물의 경우에도 methanol로 유효성분을 추출할 수 있지만 체내에서의 분해는 불완전한 것으로 알려졌다. 인삼의 유효 성분으로 알려진 인삼사포닌은 섭취 후 사람의 장내에 서식하는 특유의 미생물에 의해 분해되지 않고서는 체내에 흡수가 되지 않아 그 약효를 발휘할 수가 없으므로 반드시 장내에 서식하는 미생물에 의해 분해가 되어 저분자의 형태로 흡수되어야 한다 [8].
- 산화반응의 경우, steroid의 11α나 11β 위치에 대한 미생물의 수산화 반응은 포유류에서 일어나는 수산화 반응과 일치하며, 곰팡이류의 monooxygenase 효소계는 포유류 간의 monooxygenase와 비슷한 작용기작을 보여준다. 다양한 유기화합물에 대한 미생물의 수산화 반응의 체계적인 연구를 통해 포유류에서 일어나는 천연물의 Phase I 전환 반응의 대부분을 미생물의 생물전환계가 모방할 수 있는 것으로 밝혀졌다.
- (주)일화의 경우, 인삼농축액을 유산균으로 발효하여 암의 전이 억제, 면역증강, 항알레르기 작용이 증강된 락토진생을 개발하여 상업화하였으며 서울대학교와 (주)제일제당의 연구팀은 인삼을 특수 가공하여 홍삼에만 미량이 들어있는 특유의 약효성분인 인삼사포닌 Rg3, Rg5 등이 산삼보다 8배 이상 월등한 선삼을 개발하였다. 또한 감귤의 발효를 통해 소화 흡수율과 생리활성이 강화된 무배당체의 화합물을 제조할 뿐 만 아니라 감귤에 함유되어 있는 무맛의 rutinosyl glycoside, 쓴맛의 neohesperidosyl 유 도체 등의 flavonoid 배당체를 생균제가 생산하는 배당체 분해 효소나 생합성 효소에 의해 당 결합이 분해됨으로써 감귤 특유의 쓴맛이 반감되거나 설탕, saccharin 보다 단맛이 강화된 감미료로 전환 및 용해도를 증가하였다.
후속연구
- 즉, 인삼사포닌의 생리활성은 장내 미생물에 의해 분해되었을 때 비로소 그 효능을 발휘하는 것으로, 인삼사포닌을 분해하는 장내미생물은 사람의 체질이나 건강, 환경, 식습관이 다른 민족차에 따라 존재 유무와 보유하고 있는 정도가 다르기 때문에 인삼을 복용한 뒤 흡수 정도에 차이를 보여 체내에서의 효능면에서 차이가 보인다. 따라서 인삼사포닌을 분해하는 장내미생물로서 인삼을 발효시킴으로써 이러한 흡수와 효능의 차이를 없애 누구에게서도 효능을 발휘할 수 있는 표준제품을 개발할 수 있다.
- 예상하지 못했던 새로운 대사산물이 생성되더라도 그 물질을 동정함으로써 동물에서 일어난 대사 과정을 유추할 수 있다. 또한 높은 활성을 가지거나 낮은 독성을 가진 새로운 대사산물을 발견함으로써 약리학적 연구에 선도물질로서 이용될 수 있다.
- 미생물을 사용한 대사작용에 대한 모델이 포유류의 대사과정을 모방하거나 천연물로부터 파생된 대사산물에 대한 정보를 줄 수 있다면 미생물 모델이 동물모델의 대체 모델로 사용 가능할 것이다. 1970년도 중반, Smith와 Rosazza에 의해 Microbial Models of Mammalian Metabolism이 제안되어 1980년 중반기부터는 포유류의 천연물대사 연구를 위해 미생물이 많이 이용되고 있다.
- 미생물을 이용한 대사작용 연구는 포유동물의 천연물대사의 연구를 보완하는 방편으로 적당하지만 미생물에 의한 천연물의 전환과 포유동물의 대사작용과의 상호관계를 설명하기 위해서는 많은 연구가 필요하다. 이미 알려진 다수의 미생물 전환 특성과 장점들을 이용하여 구조적으로 복잡한 새로운 천연물의 생물전환에 대한 연구가 촉진될 것이며, 천연물의 약리학적, 독성학적인 연구를 위한 많은 양의 대사산물을 얻기 위해서는 미생물의 대사작용이 확실히 유용할 것이다. 실제로 사람 간장에 존재하는 대부분의 cytochrome p450은 미생물에서도 발현되므로 후보천연물의 체내대사를 조사하기 위한 예비 수단으로서 성공적으로 사용되고 있다.
- 미생물의 대사과정에서 형성되는 유도체의 대부분은 생성되자마자 세포로부터 배출되어 그 이상의 대사작용이 일어나지 않아 일반적인 추출방법에 의해서도 배지에서 높은 수율로 분리가 가능하여 특정 대사산물의 분리를 쉽게 한다. 특정 대사산물은 천연물모체로부터 생산되어 크로마토그래픽를 통해 구체적인 구조 연구에 사용되며 scale-up 후, 세부적인 약물학적, 독성학 연구에 더 사용되어 진다. 유도, 폭기, 효소 저해 등의 배양에 관한 실험변수를 조절하여 예상하던 대사산물의 생성을 조절하기도 하고, prodrug으로부터 생성된 활성형 대사산물을 동정을 통하여 활성화된 대사산물을 쉽게 예상할 수 있다.
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