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문제 정의
- 그러나 기존의 검사법은 잔류물질 간이검사 (EEC-4 plate)와 미 생물 수용체법 (CharmTI)에 의한 AMGs 의심 시료에 대하여 정량하기에 용이하지 못하여 적절한 접근이 이루어지지 않아 미온적인 검사에 그쳐 왔다. 따라서 본 연구는 AMGs 항생제 동시검출을 위한 시료전처리 및 분석법에 대하여 연구하고자 하였다.
- 동시분석이 용이하지 못하였다. 본 연구는 이러한 문제점을 극복하고 보다 정확하고 안정적인 AMGs 10종 동시 분석을 고찰하고자 하였으며 결과는 다음과 같았다. 1.
제안 방법
- 5 ㎖ 20 mM HFBA 용액으로 용해하여 교반기를 이용 잘흔들어 준 다음 초음파로 15분간 처리하여 2, 500rpm에서 10분간 원심분리 후 Ependorf tube에 옮겨 담았다. 16, 000rpm 10분간 원심분리 한 뒤 중간증에서 200 ㎖를 취 하여 바이알에 옮겨 검사 하였다.
- Amikacin, apramycin, dihydrostrepto mycin, gentamicin, hygrosin B, kanamy cin, neomycin, spectinomycin 및 tobra mycin의 AMGs 표준품을 제조사의 정보에의 하여 함량과 순도를 고려하여 10 mg을 정확히 달아 100㎖ 용량플라스크에 DW로 채워서 각기 0.05, 0.1, 0.2, 0.5, 1.0, 5.0 /zg7㎖ 표준용액 을 제조하여 1,000㎖를 vial에 넣고 1 ㎕의 formic acid를 첨가 후 교반 하여 Polyethylene Vial에 넣어 분석하였다(주의유리 바이알은 일부 표준품이 흡착 될 수 있음). 각 표준품에 대한 농도별로 3회 반복분석을 하였으며 각 물질별 면적비를 구한 후 회귀 분석하여 Fig3과 같이 표준곡선(X coefficient value : 0.
- HPLC 이동상은 100 mM HFBA, ACN과 DW을 사용하여 Table 1과 같은 기울기 용매 조건으로 동시분석을 하였다. 분석용 columne XTerra (Waters) 2.
- 정량을 하였다. 각각의 시료는 3회 반복실시 하였으며, 분석 결과 AMGs의 면적비를 구하여 회귀 분석한 표준곡선에 대입하여 농도를 구하였다. 검출된 시료에 대해서는 LC/MS/MS (Waters Quattro Micro)로 확인 검사하였다.
- 이러한 요구에 따라 본 실험에서는 ionparing 시약 HFBA와 질량분석기를 이용 쉽게 AMGs 물질들을 검출할 수 있는 검사법을 적용하였다. 시료전처리는 cartilage를이용하였으며, 시험결과 시료전처리 시료의 양은 1g을 사용하였다.
- 5㎛를 사용하였으며 분석은 35분으로 검사했다. 전처리한 시료를 Table 2의 조건하에서 30 ㎖를 HPLC (Waters 2690)에 주입 하여 분석하였으며, LC/MS (Waters ZQ)을 이용하여 Fig 1 및 Fig 2와 같이 정성 . 정량을 하였다.
- 현재 주사제로 사용하는 AMGs 항생물질 5종 (gentamicin, apramycin, kanamycin, amikacin, streptomycin) 을 체 중 1.5 - 2 kg (9 주령) 내외의 육계에 펠렛형 육계 후기사료와 음용수는 사육기간 중 무제한 급여하면서 1일 2회 3일간 근육내로 약물을 투여하였으며, 약물 최종 투여 후 6시간 뒤에 경정맥 방 혈 후 가슴살을 채취 냉동보관 후 실험에 공여하였다.
대상 데이터
- 4) 10% Acetic acid in MeOH(HOAC/MeOH) -5 ㎖ glacial acetic acid (HPLC grade)에 MeOH 45 mg를가하여 제조하였다. 5) 30% W/V NaOH- NaOH 30g을 D.W 100 ㎖로 채워서 제조하였다. 6) 10 mM KH2PO4 with 0.
- streptomycin, gentamicin, hygrosin B, kanamycin, neomycin, spectinomycin, tob ramycin) 표준품과 ethylenediaminetetra acetic acid (EDTA)는 Sigma(USA) 제 품을, heptafluorobutyric acid (HFBA) 는 Lancas ter 제품을 사용하였으며, 분석에서는 HPLC grade로 사용하였다. 시험에 사용된 증류수는 Bamstead 증류수 제조기를 이용하여 제조하였으며 검사 당일 0.
- 사용하였다. 시험에 사용된 증류수는 Bamstead 증류수 제조기를 이용하여 제조하였으며 검사 당일 0.2㎛ membrane filter (Alltech 2106718)로 여과 후 검사에 사용하였다.
- 20㎖ 30% NaOH)으로 조정하였다. 필요에 따라 IN HC1 과 IN NaOH을사용하였다. 원심분리기에서 4, 000 rpm 으로 15분간 원심 분리한 뒤 상층액을 새로운 원심관에 취하고 지방을 제거하였다.
데이터처리
- 0 /zg7㎖ 표준용액 을 제조하여 1,000㎖를 vial에 넣고 1 ㎕의 formic acid를 첨가 후 교반 하여 Polyethylene Vial에 넣어 분석하였다(주의유리 바이알은 일부 표준품이 흡착 될 수 있음). 각 표준품에 대한 농도별로 3회 반복분석을 하였으며 각 물질별 면적비를 구한 후 회귀 분석하여 Fig3과 같이 표준곡선(X coefficient value : 0.999939—996713, curve : quadratic)을 작성하였고, 각각의 표준품에 대한 mass spectra는 Fig4와 같았다.
이론/모형
- 하였다μ). 그러나 최근 질량분석기의 발달에 의하여 heptafluorobutyric acid (HFBA) ion-pairing 시약을 이동상으로 이용하여 유도체화 시약을 사용하지 않고 AMGs 항생물질을 동시 분석하는 방법으로 단순화 되어지고 있다⑼ 따라서 본 시험은 CBX wide pore cartilage* 이용한 시료 전처리법을 적용하였고, 역상 (reverse-phase) column 과 질량분석기를 이용하여 분석을 실시하였다.
성능/효과
- 2. AMGs 분석을 위한 질량분석기 최적조건을 설정하고 각 물질별 회수율을 분석한 결과 amikacin 78%, apramycin 102%, dihydrostreptomycin 84%, hygrosin B 72%, kanamycin 74%, gentamicin 108 %, neomycin 110%, spectinomycin 82 %, streptomycin 82% 및 tobramycin 102%의 안정적이고 유의성 있는 평균 회수율(72~110%)을 보였다.
- 그러나 분리되어지는 시간이 비교적 오래 걸리는 gentamicin, neomycin의 경우에는 5 mM의 농도에서도 분리도가 좋았다. 20mM 의 농도를 가하여 용해시킨 시험용액에서는 10종의 모든 물질이 일정한 머무름 시간과 함께 분리도 높은 크로마토그램을 확인하였다. 따라서 농축액 용해에는 20 mM HFBA 를 사용하는 것이 적합하였다.
- 3. AMGs 5종을 육계에 투여하고 조직 내 잔류조사 검사를 실시한 결과 각각의 투여한 물질만이 검출됨을 확인하였다.
- 4. 잔류물질 간이검사 결과 AMGs 항생제의심 시료에 대하여 검사한 결과 총 7건중 gentamicin 1건, dihydrostrepto mycin 4건, 불검출은 2건으로 나타났다. 이상의 결과로 볼 때 AMGs 10종의 동시분석과 효율적인 전처리법 적용으로 보다 신속하고 정확한 검사를 통하여 축산물내의 AMGs 물질을 검사 할 수 있을 것으로 사료된다.
- 7 건의 시료 중 gentamicin 1건, dihydro streptomycin 4건으로 CharmTI에 의한 양성시료 7건 중 5건(71%) 정도의 시료에서검출되었다.
- AMGs 물질을 분석하는데 있어 ion-pairing 시 약으로 20 mM HFBA를 이 동상으로 사용하였으며, 시료전처리 시 추출용액의 농축 후 5mM과 20mM HFBA의 용액 05㎖을 각각 사용하여 용해한 후 크로마토그램을 확인한 결과 5mM의 농도에서는 Fig 5에서와 같이 물질들이 서서히 용출되어 머무름 시간이 넓어지며 피크의 모양이 길게 끌리며, AMGs 10종의 물질 중 크로마토그램 내에서 분리되어지는 시간이 비교적 짧은 spectino mycin, hygrosin B, streptomycin, dihydro streptomycin의 경우에 두드러 졌다. 그러나 분리되어지는 시간이 비교적 오래 걸리는 gentamicin, neomycin의 경우에는 5 mM의 농도에서도 분리도가 좋았다.
- 1. AMGs 분석을 위한 용매 HFBA의 농도가 20mM 일 때 분리도 높은 크로마토그램을 얻을 수 있었다.
- 가능함을 확인하였다. cartridge를 이용한 전처리법은 다량의 시료 검사에 용이하게 이루어질 수 있으며 기존의 검사법은 불완전반응과 시료 전처리에서 오는 각 단계에서의 검출 물질의 손실 등으로 검출이 쉽지 않은 단점이 있었으나 이번 실험은 질량분석기와 카트리지를 이용한 전처리법의 적용으로 시험 시간의 단축과 검출이 용이하여짐을 확인하였다. 이번 실험의 이동상 조건, HPLC 조건 및 MS의 분석 조건은 높은 분리도를 보이나, 분석시간이 45분으로 비교적 장시간 소요되는 단점을 가지고 있다.
- 졌다. 그러나 분리되어지는 시간이 비교적 오래 걸리는 gentamicin, neomycin의 경우에는 5 mM의 농도에서도 분리도가 좋았다. 20mM 의 농도를 가하여 용해시킨 시험용액에서는 10종의 모든 물질이 일정한 머무름 시간과 함께 분리도 높은 크로마토그램을 확인하였다.
- 이는 시료전처리 과정에서 1g 보다 많은 양의 시료를 사용할 경우 원심력이 약하여 시험용액이 혼탁해지며, 혼탁해진 시료는 CBX cartilage 통과 시 AMGs 물질과 cartilage 사이에 이루어져야 할 화학적 상호작용을 물리적으로 저지함으로 추출이 용이하지 않았다. 따라서 1g의 적량을 사용할 경우 원심분리 시 충분한 원심력에 의해 고체 시료가 하층에 모여지고 투명한 상층액을 취할 수 있었으며, 투명한 상층액은 cartilage와 pH의 변화에 따른 화학적인 반응에 의하여 pH가 약염기성과 중성일 때에는 cartilage에 이온화된 AMGs 물질들이 흡착되며, cartilage를 세척 한 후 산성의 추출용매가 cartilage 를 통과할 때 cartilage 에 흡착되었던 AMGs 물질들이 cartilage 와 결합력을 잃고 추출되어졌으며반복 시험 시에도 재현성 있는 결과를 얻을 수 있었다.
- 미생물수용체법 (Chaim-II)에 의하여 AMGs 물질이 의심되어지는 시료 7건에 대한 검사결과 5건의 시료에서 gentamicin, dihydro streptomycin이 검출되었다. 축산물의 안전성 확보 및 약제의 잔류 예방을 위해서 이번실험과 같은 검사방법에 대한 연구 및 적용이 꾸준히 시도 되어야 할 것으로 판단된다.
- 육계에 근육주사 후 얻어진 시료에서는 각각 투여하였던 물질만이 검출되어지므로 기존 검사법은 각각의 물질별로 다른 유도 체화시약을 사용하거나 각기 다른 검출기를 이용하여 분석하는 번거로움이 있었으나 이번 AMGs 분석법은 단일 검사법에 의해 동시에 AMGs 물질들 10종을 질량검출기에 의해 분석이 가능함을 확인하였다. cartridge를 이용한 전처리법은 다량의 시료 검사에 용이하게 이루어질 수 있으며 기존의 검사법은 불완전반응과 시료 전처리에서 오는 각 단계에서의 검출 물질의 손실 등으로 검출이 쉽지 않은 단점이 있었으나 이번 실험은 질량분석기와 카트리지를 이용한 전처리법의 적용으로 시험 시간의 단축과 검출이 용이하여짐을 확인하였다.
- 평균검출농도는 gentamicin 0.84ppm, kanamycin 0.37ppm, streptomycin 2.14ppm, apramycin l.llppm, amikacin 0.31ppm의 농도로 검출되었다. 각물질은 다른 물질과 교차되어 검출되지 않았으며, 육계에 투여되었던 물질만이 각각 검출되었다.
- 5μg/g 농도가 되도록 시료에 spike후 시료 전처리하여 검사한 결과는 Table 3과 같았다. 회수율은 72% 110%정도로 물질 간 다소 차이를 보였으며 안정적인 회수율을 확인할 수 있었다.
후속연구
- 이번 실험의 이동상 조건, HPLC 조건 및 MS의 분석 조건은 높은 분리도를 보이나, 분석시간이 45분으로 비교적 장시간 소요되는 단점을 가지고 있다. 그러므로 물질 분리를 크게 요하지 않으면서 목적하는 물질을 확인할 수 있는 MS-MS의 장점을 이용하여 분석시간을 단축하는 방법이 개발되어 신속한 검사법으로 적용되어야 할 것이다.
- 잔류물질 간이검사 결과 AMGs 항생제의심 시료에 대하여 검사한 결과 총 7건중 gentamicin 1건, dihydrostrepto mycin 4건, 불검출은 2건으로 나타났다. 이상의 결과로 볼 때 AMGs 10종의 동시분석과 효율적인 전처리법 적용으로 보다 신속하고 정확한 검사를 통하여 축산물내의 AMGs 물질을 검사 할 수 있을 것으로 사료된다.
- 검출되었다. 축산물의 안전성 확보 및 약제의 잔류 예방을 위해서 이번실험과 같은 검사방법에 대한 연구 및 적용이 꾸준히 시도 되어야 할 것으로 판단된다.
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