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문제 정의
- 2013년 3월 정부조직법 개정으로 식품안전관리가 식품의약품안전처로 일원화 되면서 축산물 분야 관련 법령 및 고시 등이 식품의약품안전처 소관이 되었으나, 동일한 동물용의약품에 대한 상이한 잔류시험법이 존재하여 혼란이 발생 할 수 있어 시험법 조화가 필요하게 되었다. 따라서본 연구에서는 잔류허용기준이 설정되어 있는 8종과 잔류 허용기준이 설정될 예정인 아미카신을 포함하여 총 9종의아미노글리코사이드계열 동시분석법을 개선하고자 하였으며, 확립된 분석법을 사용하여 국내 유통 중인 축산물을 대상으로 실제 적용성 검증을 위한 잔류실태조사를 수행 하였다.
제안 방법
- 질량 분석기 조건을 확립하기 위해서 각각의 분석물질은 표준물질을 사용하여 칼럼을 통과하지 않고 직접 질량분석기(MS/MS)로 분석하였다. Electron spray ionization (ESI)의 양이온모드(positive ion mode)로 parent ion, daughter ion및 collision energy를 최적화하였으며, multiple reaction monitoring (MRM) 조건으로 분석하였다(Table 2).
- LC-MS/MS를 이용하여 아미노글리코사이드계 동물용의약품 9종에 대하여 동시분석법을 확립하고 잔류실태조사를 수행하였다. 현재 식품공전에 수록된 시험법을 기본으로 분석법을 개선하였으며 국제식품규격위원회 기준에 따라 특이성, 직선성, 정확성, 정밀성, 정량한계 등을 검증하였다.
- MS/MS 분석을 위해 ESI를 선택하였고, full scan mode 에서 질량 스펙트럼을 확인한 다음 precursor ion과 product ion을 생성한 후 특정이온을 선택하여 최적의 MRM 조건을 확립하였다. 분자의 선택성과 이온의 감도를 향상시키기 위하여 scan time, voltage, collision energy 등을 조정 하여 최적의 감도를 나타내도록 하였다.
- 「식품공전」8)에 고시된 아미노글리코사이드 동시분석법을 근간으로 회수율과 재현성을 높일 수 있도록 내부표준 물질을 적용하여 시험법을 개선하였다. 이동상은 ion-paring 시약 20 mM HFBA가 포함된 5% acetonitrile과 50% acetonitrile로 C18 칼럼을 사용하여 분석하였다.
- 개선된 분석법을 CODEX guideline에 따라 직선성 (linearity), 정확성(accuracy), 정밀성(precision), 정량한계 (limit of quantification, LOQ)를 측정하여 유효성을 검증 하였다21-22). 직선성은 혼합표준용액을 잔류허용기준 농도의 0.
- 3과 같으며, 아미카신, 아프라마이신, 디하이드로스트렙토마이신, 겐타마이신, 하이그로마이신 B, 카나마이신, 네오 마이신, 스펙티노마이신, 스트렙토마이신, 토브라마이신으로 분리가 되는 것을 확인 할 수 있었다. 검량선은 주어진 범위에서 시료 중의 분석물질 농도에 직접 비례하는 분석 결과를 얻는 항목으로 잔류허용기준의 0.125, 0.25, 0.5, 1, 2, 4배 농도 범위에서 검량선을 작성하여 직선성을 확인하였다. 모든 물질의 상관계수(R2)는 0.
- 5, 1, 2배 농도로 표준용액을 첨가한 후회수율과 상대표준편차(relative standard deviation, RSD, %)를 측정하였다. 검출한계(limit of detection, LOD)는 각각 신호대비 잡음비 3배 이상인 농도로 계산하였으며, 정량한계(limit of quantification, LOQ)는 각각 신호대비 잡음비가 10배 이상인 농도로 계산하였다.
- 5배, 1배, 2배 농도로 표준용액을 첨가한 후 회수율 실험을 3회 반복하였으며, 정확성과 정밀성을 평가하였다. 또한 잔류허용기준이 없는 물질의 경우 대상 식품의 가장 낮은 잔류허용기준을 적용하여 실험을 진행 하였다. 소고기의 평균 회수율은 60.
- 분석법의 실제 적용성을 검증하기 위하여 국내 유통 중인 식육(소고기. 돼지고기, 닭고기) 193건을 수거하여 아미노글리코사이드계 동물용의약품 9종에 대한 잔류량을 조사하였다(Table 3). 잔류조사 결과 모든 시료에서 9종의아미노글리코사이드계 항생제가 검출되지 않았다.
- MS/MS 분석을 위해 ESI를 선택하였고, full scan mode 에서 질량 스펙트럼을 확인한 다음 precursor ion과 product ion을 생성한 후 특정이온을 선택하여 최적의 MRM 조건을 확립하였다. 분자의 선택성과 이온의 감도를 향상시키기 위하여 scan time, voltage, collision energy 등을 조정 하여 최적의 감도를 나타내도록 하였다.
- 에 고시된 아미노글리코사이드 동시분석법을 근간으로 회수율과 재현성을 높일 수 있도록 내부표준 물질을 적용하여 시험법을 개선하였다. 이동상은 ion-paring 시약 20 mM HFBA가 포함된 5% acetonitrile과 50% acetonitrile로 C18 칼럼을 사용하여 분석하였다. 기울기 용리 조건에서 분석 대상 물질은 모두 분리되어 용출되었다.
- 98)을 구하였다. 정확성과 정밀성은 동물용의약품이 전혀 검출되지 않은 시료에 잔류허용기준의 0.5, 1, 2배 농도로 표준용액을 첨가한 후회수율과 상대표준편차(relative standard deviation, RSD, %)를 측정하였다. 검출한계(limit of detection, LOD)는 각각 신호대비 잡음비 3배 이상인 농도로 계산하였으며, 정량한계(limit of quantification, LOQ)는 각각 신호대비 잡음비가 10배 이상인 농도로 계산하였다.
- 직선성은 혼합표준용액을 잔류허용기준 농도의 0.125, 0.25, 0.5, 1, 2, 4배가 되도록 희석한 후 LCMS/MS에 주입하여 얻어진 피크면적으로 검량선(calibration curve)을 작성하고 직선성(R2 > 0.98)을 구하였다.
- HPLC 분석 조건은 Table 1과 같다. 질량 분석기 조건을 확립하기 위해서 각각의 분석물질은 표준물질을 사용하여 칼럼을 통과하지 않고 직접 질량분석기(MS/MS)로 분석하였다. Electron spray ionization (ESI)의 양이온모드(positive ion mode)로 parent ion, daughter ion및 collision energy를 최적화하였으며, multiple reaction monitoring (MRM) 조건으로 분석하였다(Table 2).
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표준원액 및 표준용액
표준물질을 각각 정밀히 달아 acetonitrile : acetic acid : water (v/v, 10:1:39) 혼합용액에 용해하여 표준원액을 만들었으며 잔류허용기준의 0.125, 0.25, 0.5, 1, 2, 4배 농도로 희석하여 표준용액으로 준비하였다. 표준원액은 튜브에 담아 냉동 보관하였으며, 표준용액은 사용직전에 조제 하여 실험에 사용하였다.
- LC-MS/MS를 이용하여 아미노글리코사이드계 동물용의약품 9종에 대하여 동시분석법을 확립하고 잔류실태조사를 수행하였다. 현재 식품공전에 수록된 시험법을 기본으로 분석법을 개선하였으며 국제식품규격위원회 기준에 따라 특이성, 직선성, 정확성, 정밀성, 정량한계 등을 검증하였다. 아미노글리코사이드 혼합표준용액을 잔류허용기준의 0.
- 확립된 분석법의 실제 적용성을 검증하기 위하여 잔류 실태조사를 수행하였다. 시료는 서울, 강원도, 경기도, 경상남도, 경상북도, 전라남도, 전라북도, 충청남도, 충청북도의 9개 지역의 대형 마트에서 유통되고 있는 축산물로서 총 193건을 수거하였다.
- 회수율을 측정하기 위해 소고기, 돼지고기, 닭고기에 잔류허용기준의 0.5배, 1배, 2배 농도로 표준용액을 첨가한 후 회수율 실험을 3회 반복하였으며, 정확성과 정밀성을 평가하였다. 또한 잔류허용기준이 없는 물질의 경우 대상 식품의 가장 낮은 잔류허용기준을 적용하여 실험을 진행 하였다.
대상 데이터
- S)인 토브라마이신(tobramycin)은 Fluka (Buchs, Swizerland)에서 구입하였다. Acetonitrile, methanol (Merck, Damstadt, Germany) 등 용매는 HPLC grade로 사용하였으며, heptafluorobutyric acid (HFBA) 등 그 이외의 분석용 시약 및 용매는 특급 또는 분석용을 사용하였다.
- Louis, MO, USA)에서 구입하여 사용하였다. 내부표준물질(internal standard, I.S)인 토브라마이신(tobramycin)은 Fluka (Buchs, Swizerland)에서 구입하였다. Acetonitrile, methanol (Merck, Damstadt, Germany) 등 용매는 HPLC grade로 사용하였으며, heptafluorobutyric acid (HFBA) 등 그 이외의 분석용 시약 및 용매는 특급 또는 분석용을 사용하였다.
- 수거한 검체는 가식부분을 손질하여 분쇄한 후 균질화 하였으며 분석이 되기 전까지 −20℃ 냉동실에서 보관하였다. 본 연구의 잔류실태조사를 위한 지역별 검체 수거는 2013년 6월부터 2013년 11월 사이에 이루어 졌으며 지역별 수거량은 Table 3과 같다.
- 시료는 서울, 강원도, 경기도, 경상남도, 경상북도, 전라남도, 전라북도, 충청남도, 충청북도의 9개 지역의 대형 마트에서 유통되고 있는 축산물로서 총 193건을 수거하였다. 소고기, 돼지고기, 닭고기를 대상 식품으로 전국의 주요 소비 지역(서울, 부산, 인천, 대구, 대전, 광주, 강원 등)을 중심으로 한 인구비례와 소고기, 돼지고기, 닭고기의 지역별 생산량을 함께 고려하여 검체를 수거하였다. 전국의 주요 소비 지역 인구비례는 통계청의 2012년도 국내 인구분포 현황을 근거로 하였다.
- 확립된 분석법의 실제 적용성을 검증하기 위하여 잔류 실태조사를 수행하였다. 시료는 서울, 강원도, 경기도, 경상남도, 경상북도, 전라남도, 전라북도, 충청남도, 충청북도의 9개 지역의 대형 마트에서 유통되고 있는 축산물로서 총 193건을 수거하였다. 소고기, 돼지고기, 닭고기를 대상 식품으로 전국의 주요 소비 지역(서울, 부산, 인천, 대구, 대전, 광주, 강원 등)을 중심으로 한 인구비례와 소고기, 돼지고기, 닭고기의 지역별 생산량을 함께 고려하여 검체를 수거하였다.
- 시료는 시중에서 유통되고 있는 무항생제 소고기, 돼지 고기, 닭고기를 구입하여 사용하였다. 대상 시료는 구입 후 균질화하여 분석 전까지 냉동실(−20℃)에 보관하였다.
- 표준원액은 튜브에 담아 냉동 보관하였으며, 표준용액은 사용직전에 조제 하여 실험에 사용하였다. 실험에 사용한 용기는 모두 poly propylene 재질을 사용하였다.
- 아미노글리코사이드 분석을 위해 사용한 LC-MS/MS는 Thermo TSQ Quantum ultra (Thermo electron Co., Waltham, MA, USA), 칼럼은 Waters Xbridge C18(2.1 × 150 mm, 3.5µm, Dublin, Ireland) 을 사용하였다.
- 5µm, Dublin, Ireland) 을 사용하였다. 이동상 A는 20 mM HFBA가 포함된 5% acetonitrile을 사용하였고, 이동상 B 는 20 mM HFBA가 포함된 50% acetonitrile이었으며 gradient 용매 조건을 사용하였다. HPLC 분석 조건은 Table 1과 같다.
- 표준물질인 겐타마이신(gentamicin), 스펙티노마이신(spectinomycin)은 USP (MD, USA)를 사용하였고, 스트렙토마이신(streptomycin), 아미카신(amikacin)은 Dr. Ehrenstorfer GmbH (Augsburg, Germany)에서, 네오마이신(neomycin), 디하이드로스트렙토마이신(dihydrostreptomycin), 아프라마 이신(apramycin), 카나마이신(kanamycin), 하이그로마이신 B(hygromycin B)은 Sigma (St. Louis, MO, USA)에서 구입하여 사용하였다. 내부표준물질(internal standard, I.
성능/효과
- 회수율은 다른 연구 결과와 유사한 수준이었으며, 상대표준편차는 다른 연구 결과와 유사하거나 값이 조금 높은 것을 확인 할 수 있었다13,15). 검출한계는 0.001~0.009 mg/kg이며, 정량한계는 0.006~0.03 mg/kg으로 잔류허용기준의 범위를 고려할 때 만족할 만한 수준이었다. 이상의 결과는 Table 4, Table 5, Table 6에 나타내었다.
- 03 mg/kg이었다. 국내 유통 중인 축산물 (소고기, 돼지고기, 닭고기) 193건을 수거하여 개선된 분석법의 적용성 검증과 축산물의 안전성 확인을 위한 잔류조사를 수행한 결과 시험법의 적용성이 충분히 검증되었으며 모든 시료에서 아미노글리코사이드 계열의 항생제가 검출되지 않아 유통 축산물이 안전한 것으로 확인되었다. 확립된 분석법은 식육에 잔류할 수 있는 아미노글리코사이드계열 동물용의약품 안전관리에 활용할 수 있을 것으로 사료되는 바이다.
- 모든 물질의 상관계수(R2)는 0.98 이상으로 Codex에서 권장하는 R2> 0.95와 비교해도 매우 만족할 만한 수준이었다.
- 또한 잔류허용기준이 없는 물질의 경우 대상 식품의 가장 낮은 잔류허용기준을 적용하여 실험을 진행 하였다. 소고기의 평균 회수율은 60.5~114%이었으며, 상대표준편차는 3.8~21%로 나타났다, 돼지고기의 평균 회수율은 60.1~112%, 상대표준편차는 3.2~27.5%로 조사되었으며, 닭고기의 평균 회수율은 63.8~131%이었으며, 상대 표준편차는 3.9~25.3%의 결과를 얻을 수 있었다. 회수율은 다른 연구 결과와 유사한 수준이었으며, 상대표준편차는 다른 연구 결과와 유사하거나 값이 조금 높은 것을 확인 할 수 있었다13,15).
- 98 이상의 직선성을 확인하였다. 소고기의 회수율은 60.5~114%, 돼지고기의 회수율은 60.1~112%, 닭고기 회수율은 63.8~131%을 나타내었다. 또한 LOD는 0.
- 현재 식품공전에 수록된 시험법을 기본으로 분석법을 개선하였으며 국제식품규격위원회 기준에 따라 특이성, 직선성, 정확성, 정밀성, 정량한계 등을 검증하였다. 아미노글리코사이드 혼합표준용액을 잔류허용기준의 0.125배, 0.25, 0.5, 1, 2, 4배 농도에 따라 검량선을 작성한 결과 0.98 이상의 직선성을 확인하였다. 소고기의 회수율은 60.
- 주로 검출되는 동물용의약품은 테트라싸이클린계, 페니실린계, 퀴놀론계 및 설폰아마이드계인 것으로, 아미노글리코사이드계는 상대적으로 검출 빈도가 낮은 것으로 보고되어 있다9-11). 아미노글리코사이드계 동물용의약품의 잔류실태조사 결과를 종합해 볼 때 국내 유통 축산물은 매우 안전한 것으로 나타났으며, 국민의 식품안전과 동물용의약품 안전관리를 위해 잔류실태조사는 지속적으로 필요한 것으로 사료되는 바이다. 또한 본 연구에서 확립된 분석법이 실제 시료에 적용됨이 검증되었으므로 아미노글리코사이드계열 동시분석법이 표준시험법으로 널리 활용 될 수 있기를 기대한다.
- 돼지고기, 닭고기) 193건을 수거하여 아미노글리코사이드계 동물용의약품 9종에 대한 잔류량을 조사하였다(Table 3). 잔류조사 결과 모든 시료에서 9종의아미노글리코사이드계 항생제가 검출되지 않았다. 주로 검출되는 동물용의약품은 테트라싸이클린계, 페니실린계, 퀴놀론계 및 설폰아마이드계인 것으로, 아미노글리코사이드계는 상대적으로 검출 빈도가 낮은 것으로 보고되어 있다9-11).
- 특이성은 다른 성분이 존재 할 때 표적 분석물질만을 명확하게 식별해 낼 수 있는 항목으로 아미노글리코사이드계열 표준물질 9종 혼합액에 대한 크로마토그램은 Fig. 3과 같으며, 아미카신, 아프라마이신, 디하이드로스트렙토마이신, 겐타마이신, 하이그로마이신 B, 카나마이신, 네오 마이신, 스펙티노마이신, 스트렙토마이신, 토브라마이신으로 분리가 되는 것을 확인 할 수 있었다. 검량선은 주어진 범위에서 시료 중의 분석물질 농도에 직접 비례하는 분석 결과를 얻는 항목으로 잔류허용기준의 0.
후속연구
- 아미노글리코사이드계 동물용의약품의 잔류실태조사 결과를 종합해 볼 때 국내 유통 축산물은 매우 안전한 것으로 나타났으며, 국민의 식품안전과 동물용의약품 안전관리를 위해 잔류실태조사는 지속적으로 필요한 것으로 사료되는 바이다. 또한 본 연구에서 확립된 분석법이 실제 시료에 적용됨이 검증되었으므로 아미노글리코사이드계열 동시분석법이 표준시험법으로 널리 활용 될 수 있기를 기대한다.
- 국내 유통 중인 축산물 (소고기, 돼지고기, 닭고기) 193건을 수거하여 개선된 분석법의 적용성 검증과 축산물의 안전성 확인을 위한 잔류조사를 수행한 결과 시험법의 적용성이 충분히 검증되었으며 모든 시료에서 아미노글리코사이드 계열의 항생제가 검출되지 않아 유통 축산물이 안전한 것으로 확인되었다. 확립된 분석법은 식육에 잔류할 수 있는 아미노글리코사이드계열 동물용의약품 안전관리에 활용할 수 있을 것으로 사료되는 바이다.
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