식용 및 약용으로 광범위하게 이용되고 있는 산사자의 유용 생리활성 검토를 목적으로 산사자 추출물 및 분획물을 조제하여, 혈액내의 혈전 생성에 직접 관여하는 인간 트롬빈의 thrombin time(TT) 및 activated partial thromboplastin time(aPTT) 증가 활성을 측정하여 항혈전 활성을 평가하였다. 산사자의 항혈전 물질은 물 추출보다는 메탄을 추출이 적합하며(추출효율 40.4%), butanol 분획에서 가장 강력한 활성을 나타내었다. 산사자의 butanol 분획물은 1.25 mg/ml의 농도에서 835%의 TT 증가, 315%의 aPTT 증가를 보여 아스피린보다 2.9배 이상의 강력한 항혈전 활성을 나타내었다. 이러한 항혈전 활성은 기존의 보고된 quercetin, kaempferol, myricetin 및 rutin과는 무관하였다. 또한 산사자의 활성물질은 0.5 N HCl 처리시 120분 이상 안정하였으나, $100^{\circ}C$, 30분 열처리에는 85% 이상의 활성소실이 나타나 열에 매우 민감한 물질로 확인되었다. 본 연구결과는, 비열 처리와 적합한 가공 공정이 가능하다면 산사자 추출물이 혈액순환 장해 및 혈관계 질환 예방 및 치료제로 개발 가능함을 제시하고 있다.
식용 및 약용으로 광범위하게 이용되고 있는 산사자의 유용 생리활성 검토를 목적으로 산사자 추출물 및 분획물을 조제하여, 혈액내의 혈전 생성에 직접 관여하는 인간 트롬빈의 thrombin time(TT) 및 activated partial thromboplastin time(aPTT) 증가 활성을 측정하여 항혈전 활성을 평가하였다. 산사자의 항혈전 물질은 물 추출보다는 메탄을 추출이 적합하며(추출효율 40.4%), butanol 분획에서 가장 강력한 활성을 나타내었다. 산사자의 butanol 분획물은 1.25 mg/ml의 농도에서 835%의 TT 증가, 315%의 aPTT 증가를 보여 아스피린보다 2.9배 이상의 강력한 항혈전 활성을 나타내었다. 이러한 항혈전 활성은 기존의 보고된 quercetin, kaempferol, myricetin 및 rutin과는 무관하였다. 또한 산사자의 활성물질은 0.5 N HCl 처리시 120분 이상 안정하였으나, $100^{\circ}C$, 30분 열처리에는 85% 이상의 활성소실이 나타나 열에 매우 민감한 물질로 확인되었다. 본 연구결과는, 비열 처리와 적합한 가공 공정이 가능하다면 산사자 추출물이 혈액순환 장해 및 혈관계 질환 예방 및 치료제로 개발 가능함을 제시하고 있다.
The fructus of Crataegus pinnatifida Bunge has been used as medicinal and food source in worldwide. In this study, a strong direct thrombin inhibition and antithrombosis activity were identified from the methanol extract of C. pinnatifida Bunge fructus. The solvent fractionation of fructus extract u...
The fructus of Crataegus pinnatifida Bunge has been used as medicinal and food source in worldwide. In this study, a strong direct thrombin inhibition and antithrombosis activity were identified from the methanol extract of C. pinnatifida Bunge fructus. The solvent fractionation of fructus extract using hexane, ethylacetate, butanol revealed that the butanol fraction has a prominent antithrombin activity. Thrombin time(blood-clot formation time) and activated partial thromboplastin time(aPTT) extended to 835% and 315% by addition of the butanol fraction at concentration of 1.25 mg/mL, whereas thrombin time extended to 287% by addition of aspirin at concentration of 1,25 mg/mL. The butanol fraction showed anthrone-positive and weak ninhydrine-postive reaction. The thrombin inhibitory activity was not related to previously reported flavonoids or polyphenols. The activity was maintained against acid treatment(0.5 N HCl for 120 min), but rapidly lost by heat-treatment($100^{\circ}C$ for 30 min). Our results suggested that fructus of C. pinnatifida Bunge with non-heat treatment process could be developed as a natural source of antithrombosis.
The fructus of Crataegus pinnatifida Bunge has been used as medicinal and food source in worldwide. In this study, a strong direct thrombin inhibition and antithrombosis activity were identified from the methanol extract of C. pinnatifida Bunge fructus. The solvent fractionation of fructus extract using hexane, ethylacetate, butanol revealed that the butanol fraction has a prominent antithrombin activity. Thrombin time(blood-clot formation time) and activated partial thromboplastin time(aPTT) extended to 835% and 315% by addition of the butanol fraction at concentration of 1.25 mg/mL, whereas thrombin time extended to 287% by addition of aspirin at concentration of 1,25 mg/mL. The butanol fraction showed anthrone-positive and weak ninhydrine-postive reaction. The thrombin inhibitory activity was not related to previously reported flavonoids or polyphenols. The activity was maintained against acid treatment(0.5 N HCl for 120 min), but rapidly lost by heat-treatment($100^{\circ}C$ for 30 min). Our results suggested that fructus of C. pinnatifida Bunge with non-heat treatment process could be developed as a natural source of antithrombosis.
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문제 정의
본 연구에서는, 산사자의 유용 생리활성 검토를 위한 연구의 일환으로, 산사자 추출물 및 분획물을 조제하여 혈액 내의 혈전 생성에 직접 관여하는 인간 트롬빈의 저해활성 및 aPTT 증가활성을 평가하여, 산사자 추출물의 butanol 분획물에서 강력한 항혈전 활성을 확인하였으며, 트롬빈 저해 활성 물질의 특성을 검토하였다. 이러한 연구는, 산사자 추출물이 혈액 순환 장해 및 혈관계 질환의 예방, 치료제로 사용됨에 있어 유용한 정보를 제공하게 될 것이다.
제안 방법
수분함량은 18% (w/w)이었으며, 4℃에서 냉장보관하여 사용하였다. 산사자 메탄올 추출물의 조제는 시료 200g에 메탄올 1리터를 가하여 24시간 상온 추출하였으며, 3회 반복한 후 추출액은 50*C에서 1시간 감압 농축하여 분말로 제조하여 사용 전까지 저온 밀봉 보관하였다. 산사자 물 추출물 조제는 시료 200g에 증류수 1리터를 가하고, 30℃ 실온에서 24시간 추출하거나, 100℃에서 1시간 추출한 후, 추출액을 50℃에서 1시간 감압 농축하여 .
메탄올 추출물의 경우에는 물에 현탁한 후, n-hexane, ethylacetate, butanol을 이용하여 순차적으로 분획하고, 물 잔류물을 회수하였다. 준비된 시료는 DMSO(dime-thylsulfoxide)에 녹인 후 적당한 농도로 희석하여 thrombin time (TT) 측정, activated partial thromboplastin time(aPTT) 측정, 열 및 산 안정성 평가에 사용하였다. 혈장은 최근 1개월동안 약물투여를 받지 않은 지원자의 전혈로부터 조제하였으며, 채혈 후 즉시 4C에서 5,000 g로 5분 동안 원심분리하여 혈장을 분리하고 냉동한 상태로 보관하였으며 (신선동결 혈장), 필요시 상온에서 해동하여 사용하였다.
항혈전 활성은 시료의 TT 및 aPTT를 측정하여 평가하였다. 트롬빈 저해 활성은 기존의 보고한 Amelung coagulometer KC-1A (Japan)를 이용하여 혈액 응고시간을 측정하여 평가하였다[12, 21-24].
트롬빈 저해 활성은 기존의 보고한 Amelung coagulometer KC-1A (Japan)를 이용하여 혈액 응고시간을 측정하여 평가하였다[12, 21-24]. 37℃에서 0.
트롬빈 저해 활성은 기존의 보고한 Amelung coagulometer KC-1A (Japan)를 이용하여 혈액 응고시간을 측정하여 평가하였다[12, 21-24]. 37℃에서 0.5 U 트롬빈 (Sigma Co., USA) 50 ㎕와 20 mM CaCl2 50㎕, 다양한 농도의 시료 추출액 10 ㎕를 coagulometer의 튜브에 혼합하여 2분간 반응시 킨 후, 혈장 100 ㎕를 첨가한 후 혈장이 응고될 때까지의 시간을 측정하였으며, 시료 대조군으로는 아스피린(국산화학, Japan) 과 heparin (Sigma Co.)을, 용매 대조군으로는 시료 대신 DMSO를 사용하였다. DMSO의 경우 평균 33.
1 초의 응고 시간을 나타내었다. 열 안정성 평가의 경우에는 1 mg/ml의 산사자 추출물의 부탄올 분획물을 10CTC에서 일정시간 열처리한 후, 4(TC에서 냉각하여 잔존활성을 측정하였다. 산 안정성 평가를 위해서는, 0.
열 안정성 평가의 경우에는 1 mg/ml의 산사자 추출물의 부탄올 분획물을 10CTC에서 일정시간 열처리한 후, 4(TC에서 냉각하여 잔존활성을 측정하였다. 산 안정성 평가를 위해서는, 0.5 N HC1 용액에 일정시간 동안 실온에서 반응시킨 후, 1 N NaOH 용액으로 pH 7로 보정하여 잔존 활성을 측정하였다. 트롬빈 저해 활성은 3회 이상 반복한 실험의 평균치±표준오차 (mean±SD)로 나타내었다.
한편 aPTT 측정[12, 21-24]의 경우에는, 혈장 100㎕와 다양한 농도의 시류 추출액 10 ㎕를 Amelung coagulometer KC-1A (Japan) 의 튜브에 첨가하여 37℃ 에서 3분간 가온한 후, 50 ㎕의 aPTT reagent (Sigma, ALEXINe)를 첨가하고 다시 37℃ 에서 3 분간 반응하였다. 이후 50 ㎕ CaCh (35 mM)을 첨가한 후 혈장이 응고될 때까지의 시간을 측정하였다. 용매 대조군으로는 DM9O를 사용하였으며, 이 경우 55.
표준시 약으로는 tannic acid를 사용하였다. TLC의 경우에는, silica gel plate (Silica gel 6OF254, Merck, Darmstadt. Germany)를 사용하였으며, 클로로포름: 메탄올:물(52:28:8 v/v/v)을 전개용매로 하여 전개 후, 10% 황산용액을 분무하여 확인하였다.
산사자를 메탄올 및 증류수로 추출한 각각의 추출물의 항혈전 활성을 측정하였다. 먼저 100℃ 및 30℃ 물 추출물의 경우, 추출 효율은 각각 48.
준비된 시료는 DMSO(dime-thylsulfoxide)에 녹인 후 적당한 농도로 희석하여 thrombin time (TT) 측정, activated partial thromboplastin time(aPTT) 측정, 열 및 산 안정성 평가에 사용하였다. 혈장은 최근 1개월동안 약물투여를 받지 않은 지원자의 전혈로부터 조제하였으며, 채혈 후 즉시 4C에서 5,000 g로 5분 동안 원심분리하여 혈장을 분리하고 냉동한 상태로 보관하였으며 (신선동결 혈장), 필요시 상온에서 해동하여 사용하였다.
대상 데이터
실험에 사용한 산사자는 경북 안동에서 건조된 한국산 산사 자를 구입하여 사용하였다. 수분함량은 18% (w/w)이었으며, 4℃에서 냉장보관하여 사용하였다.
산사자 물 추출물 조제는 시료 200g에 증류수 1리터를 가하고, 30℃ 실온에서 24시간 추출하거나, 100℃에서 1시간 추출한 후, 추출액을 50℃에서 1시간 감압 농축하여 .분말 ' 로 제조하였다. 메탄올 추출물의 경우에는 물에 현탁한 후, n-hexane, ethylacetate, butanol을 이용하여 순차적으로 분획하고, 물 잔류물을 회수하였다.
이후 50 ㎕ CaCh (35 mM)을 첨가한 후 혈장이 응고될 때까지의 시간을 측정하였다. 용매 대조군으로는 DM9O를 사용하였으며, 이 경우 55.2초의 응고시간을 나타내 었다. aPTT의 결과는 3회 반복한 실험의 평균치±표준오차 (mean±SD)로 나타내었다.
이론/모형
총 flavonoid의 함량 측정은 Davis 방법[5]에 따라 측정하였으며, 각각의 시료를 18시간 메탄올 교반 추출하고 여과한 추출 검 액 400 ㎕에 90% diethylene glycol 4 mL를 첨가하고 다시 1 N NaOH 40 ㎕를 넣고 37℃ 에서 1시간 반응 후 420 nm에서 홉광도를 측정하였다. 표준시약으로는 rutin을 사용하였다.
표준시약으로는 rutin을 사용하였다.'총 polyphenol 함량은 Singleton 등의 방법 [2이에 따라 추출검액 400 ㎕에 50 ㎕의 Folin-ciocalteau, 100㎕의 Nag 포화용액을 넣고 실온에서 1시간 방치한 후 725 nm 에서 흡광도를 측정하였다. 표준시 약으로는 tannic acid를 사용하였다.
성능/효과
2초의 응고시간을 나타내 었다. aPTT의 결과는 3회 반복한 실험의 평균치±표준오차 (mean±SD)로 나타내었다.
활성을 측정하였다. 먼저 100℃ 및 30℃ 물 추출물의 경우, 추출 효율은 각각 48.1% 및 36.7%로 산사자가 많은 수용성 물질을 포함함을 알 수 있었으며, 각각의 추출물의 농도증가에 따른 TT와 aPTT의 증가가 비례적으로 나타나지는 않았다(Table 1).
그러나 5 mg/ml 농도의 100℃ 및 30℃ 물 추출물에서 각각 136%, 149%의 TT 증가 및 123%, 164%의 aPTT 증가를 나타내었다. 한편 메탄올 추출물의 경우에는 농도 의존적인 트롬빈 저해 활성과 aPTT 증가를 나타내었으며, 2.
증가를 나타내었다. 한편 메탄올 추출물의 경우에는 농도 의존적인 트롬빈 저해 활성과 aPTT 증가를 나타내었으며, 2.5 mg/ml의 농도에서 164%의 TT 증가, 160%의 aPTT 증가를 나타내 었고, 5 mg/ml의 농도에서는 각각 1, 390% 및 450% 이상의 증가가 확인되었다. 이는 항혈전제로 이용되는 아스피린이 1.
Hexane, ethylacetate, butanol 각 분획물의 회수율은 각각 1.0%, 5.1%, 20.9%이었으며, 물 잔류물이 72.2%를 차지하여 대부분이 수용성 물질로 확인하였다. 각 분획물의 농도별 활성 측정 결과 대부분의 활성은 butanol 분획에서 나타났으며, 1.
2%를 차지하여 대부분이 수용성 물질로 확인하였다. 각 분획물의 농도별 활성 측정 결과 대부분의 활성은 butanol 분획에서 나타났으며, 1.25 mg/ml의 농도에서 835%의 TT 증가, 315%의 aPTT 증가를 보여 아스피린보다 훨씬 강력한 항혈전 활성을 나타내었다. 한편 ethylacetate 분획에서는 2.
산사자의 메탄올 추출물과 각각의 분획물의 총 플라보노이드, 폴리페놀 및 총당을 분석한 결과 (Table 3), 분석 물질들과 트롬빈 저해 활성의 특이한 상관관계는 나타나지 않았다.
Ethylacetate 분획에서는 높은 총 플라보노이드 함량 및 폴리페놀 함량, 총당 함량을 나타내었으며, butanol 분획에서는 ethylacetate 분획 다음으로 높은 폴리페놀 및 총당량을 나타내었으며, 총 플라보노이드 함량은 1.3㎍/g의 매우 낮은 수치를 나타내었다. 또한 butanol 분획은 강한 anthrone 반응과 약한 ninhydrin반응을 나타내어, 그 주성분이 당 함유 고분자 물질로 추측되었다.
이미 보고한 메밀종자 추출물의 butanol 분획물의 활성 성분은 30 kD 이상의 고분자 다당체로 확인되었으나, 환원당은 거의 검출되지 않았다[23]. 그러나 산사자의 butanol 분획물은 ethylacetate 분획물보다 환원당 함량은 낮았으나, 여전히 높은 169 mg/g의 환원당 함량을 나타내어 다당류보다는 당이 결합된 고분자 구조로 추측되며, 이러한 결과는 실제 항혈액 응고 의약품으로 사용되고 있는 헤파린이 뮤코다당체임을 고려할 때, 산사자의 butanol 분획물의 활성물질이 헤파린과 유사한 구조 및 유사한 항응고 작용기작을 나타내리라 추측된다. 또한 이러한 결과는 산사자의 주요 활성물질로 보고된 quercetin, myricetin 등이 산사자의 항트롬빈 활성에 관여하지 않음을 제시하며, 실제 butanol 분획물의 항트롬빈 활성을 측정 결과, 기존의 보고된 quercetin, kaempferol, myricetin 및 rutin 등의 혈관계 질환의 예방효과가 보고된 물질들[23]과는 트롬빈 저해 활성에서 다른 양상을 나타내었다(Fig.
또한 TLC에 의한 분석 결과 butanol 분획에서 다양한 물질들이 검출되었으나, quercetin, kaempferol, myricetin 및 rutine 거의 검출되지 않아(Fig.2), 산사자의 항혈전 활성이 기존의 산사자 및 산사 잎에서 보고된 물질에 의해 나타나지 않음을 확인하였다.
산사자의 항혈전 활성성분의 식품가공 적성 평가를 위해 butanol 분획물의 산 안정성과 열 안정성을 검토한 결과 (Table 4), 100℃, 30분 열처리에도 85% 이상의 활성 소실이 나타난 반면, 0.5 N HC1 처리에는 120분 이상 안정한 것으로 나타났다. 항혈전제로 사용되고 있는 아스피린이 뛰어난 산안정성 및 열 안정성을 나타냄[21, 23, 24]을 고려할 때, 산사자를 이용한 기능성 식품 제조에는 비가열처리가 필수적인 것으로 판단되며, 고온 추출은 부적합할 것으로 판단된다.
후속연구
특성을 검토하였다. 이러한 연구는, 산사자 추출물이 혈액 순환 장해 및 혈관계 질환의 예방, 치료제로 사용됨에 있어 유용한 정보를 제공하게 될 것이다.
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