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문제 정의
- 나타나는 지를 연구해보고자 하였다. 본 임상시험은 인삼 다당체의 경구투여가 혈장내 proteJme 발현에 미치는 영향을 건강한 성인 남자군을 통해 알아보기 위한 연구로써, 2주간 인삼 다당체 투여의 유효성 및 안전성을 평가하는 데 그 목표가 있다. 인삼 다당체의 투여 전후의 변화를 알아보기 위하여 21명의 자원자에게 무작위로 인삼 다당체 및 위약을 투여한 후 이 중 탈락한 2명을 제외한 19명의 지원자에게 인삼 다당체 및 위약 투여 전후에 혈액을 채취한 후 혈장을 분리하여 2D-gel 분석을 실시하였다.
- 이에 연구자는 암 질환에 대한 예비임상연구 단계로 인삼 다당체 투여가 혈장 내 proteome 발현에 미치는 약리 역동적 영향 및 안전성 등을 건강한 성인 남자 군을 통해 관찰해보고자 인삼 다당체 투여 군과 위약군의 두 개의 군으로 나누어 각각 채혈한 뒤 혈장에 대한 이차원전기영동을 시행하고 2D-gel 분석을 통하여 차이가 나는 spot들을 찾아 질량분석과 단백질을 동정하여 분석하여 기대할 수 있는 효과 및 기전을 추적해보고, 또 기본적인 이학적 검사 및 병리검사를 통해 안전성 등에 대한 정보를 취득해 보았다.
- 이에 연구자는 전 임상시험을 통해 항암효과, 면역증진효과, 항암제 및 방사선치료 부작용 감소효과 등을 보인 인삼 다당체가 암환자의 인체에 미치는 영향을 알아보고자 연구 초기 단계로써 우선적으로 정상 성인 남자 군에 대해 어떠한 proteome의 변화가 나타나는 지를 연구해보고자 하였다. 본 임상시험은 인삼 다당체의 경구투여가 혈장내 proteJme 발현에 미치는 영향을 건강한 성인 남자군을 통해 알아보기 위한 연구로써, 2주간 인삼 다당체 투여의 유효성 및 안전성을 평가하는 데 그 목표가 있다.
제안 방법
- 2D-gel분석을 통한 spot을 질량분석기를 통하여 단백질 동정을 하였고, 1206, 3205, 3501, 5109, 7101을 확인하였다. 1206은 SP 40, 40, 3205은 Cytokeratin 9, 3501은 hypothetical protein LOC 54932, 5109는 apolipoprotein E, 7101은 human albumin의 일종으로 확인되었다(Table 3).
- Target plate 상에 적하되어 있는 단백질 단편들은 337 run의 N2 laser 조사에 의해 기화된 다음, 20 Kv injection pulse에 의해 가속되었다. 300 laser 아lots의 누적 peaks에 의해 각각의 단백질 spot에 대한 mass spectrum을 구하였다. Mass spectrum의 분석을 위해서 trypsin의 자가분해에 의해 생성된 펩타이드의 ion peak m/z(842.
- 5개의 spot이 대조군과 비교해 복용 전후의 유의성 있는 변화를 나타내어 이 spot을 대상으로 단백질 동정을 실시하였다 (Fig. 3, 4).
- 300 laser 아lots의 누적 peaks에 의해 각각의 단백질 spot에 대한 mass spectrum을 구하였다. Mass spectrum의 분석을 위해서 trypsin의 자가분해에 의해 생성된 펩타이드의 ion peak m/z(842.510, 2211.1046)를 표준 peaks로 이용하였다. 분석이 완료된 mass spectrum으로부터 단백질 동정을 위하여 Rockefeller 대학에서 개발한 Propound 검색엔진 (http://129.
- reswelling 되었다. Strip 당 시료는 각각 200 ug 을 사용하였으며, Amersham Biosciences 사의 Multiphore II system을 이용하여 제조회사의 사용메뉴얼을 준수하여 20℃에서 IEF를 수행하였다 IEF 조건은 150V에서 3, 500V까지의 도달시간을 3시간 되게 하였으며, 3, 500V에서 26시간 지속되도록 하여 최종적으로 96kVh 가 되도록 설정하였다.
- 02, nonlinear dynamics, UK)를 이용하여 수행하였다. 각 spot의 quantity는 total valid sopts의 intensity로 평 준화 (normalization)되었으며, 대조군에 비해 두 배 이상의 유의한 발현변화를 보여주는 단백질 spots을 선정하였다.
- 각각의 피험자에게 인삼 다당체 또는 위약이 14일간 무작위 이중맹검 방식으로 투여되었다. 사용된 인삼 다당체는 (주) 코인텍에서 제공된 것으로 식약청의 건강기능식품(제 2004-0226S) 승인을 받은 제품으로 250 mg 정제 8알(2,000 mg)을 1회 복용량으로 정하였고, 위약((주) 대전한방약품)은 전분을 사용하여 맛과 성상이 같은 제품을 사용하였다.
- 구해진 spot에 대한 단백질 동정 및 기능은 Profound 검색엔진을 통하여 얻어진 자료를 근거로 작성하였다.
- 05)가 나타나는 것을 유의한 것으로 정의하였다. 또한 시험군과 대조군 각각에 있어서 약물투여 전후에 변화되는 spot들에 대하여도 정량적 분석을 실시하여 발현의 차이에 유의성이 있는 지 확인하였다.
- 본 시험에서 이상반응은 임상시험 시작 전에 관찰되지 않은 증상이 발생하는 모든 바람직하지 않은 의학적 소견을 이상 반응으로 분류하였다.
- 스캐닝된 이미지로부터 단백질 spots의 발현변화 확인을 위한 정량적인 분석은 Phoretix 2D Evolution Softwae(version 2003.02, nonlinear dynamics, UK)를 이용하여 수행하였다. 각 spot의 quantity는 total valid sopts의 intensity로 평 준화 (normalization)되었으며, 대조군에 비해 두 배 이상의 유의한 발현변화를 보여주는 단백질 spots을 선정하였다.
- 시험 군 전체에서 반복시험에 상관성이 있는 프로테옴 변화 중 대조군과의 유의성 있는 차이가 있는 프로테옴의 발현을 주 평가지수로 하였다. 즉 혈장 내 프로테옴 분석을 통하여 얻은 시험 군과 대조군의 각 spot들을 정량적으로 분석하여 통계적 (paired t-test)으로 유의성 있는 차이(p<0.
- 시험군과 대조군 각각에 있어서 약물투여 전후에 변화되는 spot들에 대하여도 정량적 분석을 실시한 결과 대조군에서는 발현의 차이에 유의성이 있는 spot이 발견되지 않았다. 시험 군에서는 단백질의 발현에 변화를 보인 11개의 spot을 찾아낸 후, 이 중 투여 전, 후 유의성 있는 변화(p<0.05)를 보인 5개의 단백질을 단백질 동정을 통하여 확인하였다.
- 시험에 참여한 전례(Intention-to-Treat (ITT))에 대하여 평가하였다.
- 이화학적 검사의 이상소견 발현, 이상반응 및 중대한 이상 반응을 관측하였다.
- 본 임상시험은 인삼 다당체의 경구투여가 혈장내 proteJme 발현에 미치는 영향을 건강한 성인 남자군을 통해 알아보기 위한 연구로써, 2주간 인삼 다당체 투여의 유효성 및 안전성을 평가하는 데 그 목표가 있다. 인삼 다당체의 투여 전후의 변화를 알아보기 위하여 21명의 자원자에게 무작위로 인삼 다당체 및 위약을 투여한 후 이 중 탈락한 2명을 제외한 19명의 지원자에게 인삼 다당체 및 위약 투여 전후에 혈액을 채취한 후 혈장을 분리하여 2D-gel 분석을 실시하였다. 주평가지수로 정의했던 프로테옴 변화 중 대조군과의 유의성 있는 차이가 있는 프로테음의 발현을 기준으로 1개의 spot 이유 의성 있는 증가(p<0.
- 사용된 인삼 다당체는 (주) 코인텍에서 제공된 것으로 식약청의 건강기능식품(제 2004-0226S) 승인을 받은 제품으로 250 mg 정제 8알(2,000 mg)을 1회 복용량으로 정하였고, 위약((주) 대전한방약품)은 전분을 사용하여 맛과 성상이 같은 제품을 사용하였다. 임상시험용량은 1일 2회 2 g 씩 총 4 g을 경구 투여하였다. 투여용량의 결정은 현재 시판 중인 인삼 다당체 포함제품의 1일 평균 권장투여량(6 g) 중 인삼 다당체량(4 g)을 계산, 산정하였다.
- 투여용량의 결정은 현재 시판 중인 인삼 다당체 포함제품의 1일 평균 권장투여량(6 g) 중 인삼 다당체량(4 g)을 계산, 산정하였다. 투여기간은 유사선행연구에 근거하여 14일로 결정하였다. 인삼 다당체의 제조공정 및 특징을 요약하면 다음과 같다.
- 임상시험용량은 1일 2회 2 g 씩 총 4 g을 경구 투여하였다. 투여용량의 결정은 현재 시판 중인 인삼 다당체 포함제품의 1일 평균 권장투여량(6 g) 중 인삼 다당체량(4 g)을 계산, 산정하였다. 투여기간은 유사선행연구에 근거하여 14일로 결정하였다.
- 특히 시험시행은 투약 전 후를 비교하는 현장 내 프로티 옴 분석과 투약 후 병리 및 이학검사를 실시하였다.
- Block size를 4로 한다면 다음은 block size = 4 배정의 구체적인 예로써 경우의 수를 나열하며 : 1=AABB, 2=ABAB, 3=ABBA, 4=BAAB, 5=BABA, 6=BBAA 등 6 가지의 경우의 수가 나타난다. 피험자가 최종 선정되면 배정 표에 따라 시험군 또는 대조군에 피험자를 무작위 배정하고 배정표에 피험자 식별코드를 기록하였다.
대상 데이터
- Urea, Thiourea, CHAPS, DTT, Benzamidine, Bradford solution, Acrylamide, lodoacetamide, Bis-acrylamide, SDS, acetonitrile, trifluoroacetic acid 및 a-cyano-4-hydroxycinnamic acide Sigma-Aldrich(Electrophoresis grade or ACS reagents, Ultrapure) 사의 제품을 사용하였고, Pharmalyte(pH3.5-10)는 Amersham Biosciences 사의 제품을 사용하였다. IPG DryStrips(pH4-10 NL, 24 cm)은 Genomine Inc.
- 본 연구는 평균연령 23세(23.14±2.03)의 건강한 피험자(23 명, 남자)가 인삼 다당체 투여 연구를 위해 모집되었다. 여성의 경우 생리기간 중의 프로테옴 변화 등이 예상되어 본 임상시험에서 제외하였다.
- 1046)를 표준 peaks로 이용하였다. 분석이 완료된 mass spectrum으로부터 단백질 동정을 위하여 Rockefeller 대학에서 개발한 Propound 검색엔진 (http://129.85.19.192/profound_bin/ WebProFound.exe) 이용하였다.
- 방식으로 투여되었다. 사용된 인삼 다당체는 (주) 코인텍에서 제공된 것으로 식약청의 건강기능식품(제 2004-0226S) 승인을 받은 제품으로 250 mg 정제 8알(2,000 mg)을 1회 복용량으로 정하였고, 위약((주) 대전한방약품)은 전분을 사용하여 맛과 성상이 같은 제품을 사용하였다. 임상시험용량은 1일 2회 2 g 씩 총 4 g을 경구 투여하였다.
- IPG DryStrips(pH4-10 NL, 24 cm)은 Genomine Inc.에서 제작된 제품을 사용하였으며, Modified porcine trypsin(sequencing grade) 은 Promega사의 제품을 사용하였다.
- 피험자 수 결정 근거는 유사선행연구'에 근거하여 20명으로 설정하였고 이에 탈락률 20%를 감안하여 총 23명의 피험자를 모집하였다. 임상시험은 2006년 9월 16일부터 10월 16일까지 31일간 진행되었다.
- 총 23명의 지원자 중 4명이 탈락하였다. Screening 과정 중 1차 병리검사에서 1례는 ALT 수치가 50 u/l(<40)으로 확인되었고, 1례는 WBC가 3, 320/mm%%500-11,000)으로 확인되어 투약 전 탈락되었고, 2례는 순응도 검사시 임상시험 기간 중 음주의 경력을 보고하여 탈락되었다.
- 배양액의 다섯 배부 피의 아세톤을 가하여 -20℃에서 두 시간 침전시킨 다음, 원심분리하여 침전된 단백질을 회수하였다. 침전된 단백질은 7 M urea, 2 M Thiourea, 4%(w/v) 3-[(3-cholamidopropy)dimethyammonio]-l- propanesulfonate(CHAPS), l%(w/v) dithiothreitol(DTT), 2%(v/v) pharmalyte, 1 mM benzamidine로 구성된 시료용액으로 녹여서 이차원 전기영동의 시료로 사용하였다. 단백질의 농도 측정은 Bradford 법으로 수행하였다&).
- 대전대학교 둔산 한방병원의 임상시험 윤리위원회 (Institutional review board, IRB)에서 2006년 9월 13일 당 임상시험에 대한 승인이 있었으며 모든 참여자들(volunteers)로부터 자발적 동의서 (Written informed consent)# 취득하였다. 피험자 수 결정 근거는 유사선행연구'에 근거하여 20명으로 설정하였고 이에 탈락률 20%를 감안하여 총 23명의 피험자를 모집하였다. 임상시험은 2006년 9월 16일부터 10월 16일까지 31일간 진행되었다.
데이터처리
- 이미지 분석은 "Phoretix 2D Evolution Software를 사용하여 각 spot의 농도를 측정하여 각각의 평균과 표준편차를 구했다. 구해진 spot에 대한 단백질 동정 및 기능은 Profound 검색엔진을 통하여 얻어진 자료를 근거로 작성하였다.
이론/모형
- 균형 블록무작위 배 정 (balanced block randomization) 방법 을 사용하였다. 무작위 배정 표는 SAS system의 randomized program으로 발생된 난수(A 또는 B의 random number)의 순열을 피험자번호 1번부터 순차적으로 적용시킨 표이다(예 1번 =A= 시험군, 2번 =B=대조군).
- 단백질 spotse Shevchenkc의 방법에 따라 modified porcine trypsin을 이용하여 작은 단편으로 효소적으로 분해되었다. 젤 조각으로부터 SDS, 유기용매, 염색시약 등의 불순물을 제거하기 위하여 50% acetonitrile로 세척하였다.
- 단백질 추출은 아세톤 침전법을 이용하였다. 배양액의 다섯 배부 피의 아세톤을 가하여 -20℃에서 두 시간 침전시킨 다음, 원심분리하여 침전된 단백질을 회수하였다.
- 침전된 단백질은 7 M urea, 2 M Thiourea, 4%(w/v) 3-[(3-cholamidopropy)dimethyammonio]-l- propanesulfonate(CHAPS), l%(w/v) dithiothreitol(DTT), 2%(v/v) pharmalyte, 1 mM benzamidine로 구성된 시료용액으로 녹여서 이차원 전기영동의 시료로 사용하였다. 단백질의 농도 측정은 Bradford 법으로 수행하였다&).
- Equilibration이 완료된 strips을 SDS-PAGE gels(20 x 24 cm, 10-16%) 위에 배열시키고, Hoefer DALT 2D system(Amersham Biosciences) 을 이용하여 20 ℃ 에서 최종적으로 L7kVh가 되게 전개하였다. 이차원전기영동이 완료된 이차원젤의 단백질은 Oakley의 방법에 따라 은 염색으로 시각화되었으며, 질량분석기에 의한 단백질 동정을 위하여 glutaraldehyde 처리 단계는 생략되었다. 은 염색된 이차원 젤은 AGFA 사의 Duoscan T1200 스캐너로 스캐닝 하여 확장자가 TIFF 인 파일의 형태로 컴퓨터에 저장하였다.
- 질량분석기는 Ettan MALDI-TOF(Amersham Biosciences)를 사용하였다. Target plate 상에 적하되어 있는 단백질 단편들은 337 run의 N2 laser 조사에 의해 기화된 다음, 20 Kv injection pulse에 의해 가속되었다.
성능/효과
- 총 23명의 지원자 중 4명이 탈락하였다. Screening 과정 중 1차 병리검사에서 1례는 ALT 수치가 50 u/l(<40)으로 확인되었고, 1례는 WBC가 3, 320/mm%%500-11,000)으로 확인되어 투약 전 탈락되었고, 2례는 순응도 검사시 임상시험 기간 중 음주의 경력을 보고하여 탈락되었다.
- 그 결과로는 comparative proteome analysis를 이용하여 인삼체부와 뿌리부위의 ginseng major protein (GMP) 함유물의 차이, peptide finger printing, internal amino acid sequencing를 이용한 주근, 잎과 뿌리의 차이 등을 검색해 볼 수있다최근 산양산삼을 이용해 건강한 성인 군에 산양산삼 약침 액을 정맥 내 주사를 한 뒤 혈장 내 프로테옴의 전·후 비교를 한 연구 또한 시도된 바 있는 데 이 연구에서는 분석된 약 30 여종의 변화된 프로테옴의 분석을 통해 산양산삼의 인체에 미치는 효능을 추측할 수 있는 결과를 내놓기도 하였다'4). 결과를 살펴보면 CR2-C3d, antitrypsin(단백질의 항 산화작용에 관여), proapolipoprotein 및 apolipoprotein(동맥경화의 예방과 개선에 중요한 역할 담당), Vitamin D binding protein(염증반응에서 폐를 보호하는 역할 담당), Ras-related protein Ral-A(phospholipid 대사과정의 조절, 세포골격형성을 조절 및 세포 내 외 운동이나 막의 물질교통(membrane traffic)에 관여), testis-specific protein Y(성 결정에 관여), transferrin, T-State Human Hemoblobin, 및 Human Hemoblobin(체내 철 평형에 관여) 등은 증가하였고, transthyTetin(가족성 아밀로이드 다면신경장애 (familial amyloid polyneuropathy, FAP)를 일으키는 주요 단백질)은 감소하였다. 연구자는 이에 근거하여 인삼 다당체도 유사한 효과를 가지고 있을 것으로 기대하였다.
- 결론적으로 인삼 다당체의 투여는 대조군에 비해 혈장 내의 human albumin 1종의 단백질에 대한 유의한 증가를 보였다. 대조군에 있어서 복용 전과 후에 차이를 보인 spot의 발현은 보이지 않았으나, 인삼 다당체 투여군에 있어서 복용 전과 후에 pSP 40, 40, Cytokeratin 9, hypothetical protein LOC 54932, apolipoprotein E의 4종의 단백질에 대한 유의한 감소 및 human albumin 1종의 단백질에 대한 유의한 증가효과를 나타냈다.
- 대조군에 있어서 복용 전과 후에 차이를 보인 spot의 발현은 보이지 않았으나, 인삼 다당체 투여군에 있어서 복용 전과 후에 pSP 40, 40, Cytokeratin 9, hypothetical protein LOC 54932, apolipoprotein E의 4종의 단백질에 대한 유의한 감소 및 human albumin 1종의 단백질에 대한 유의한 증가효과를 나타냈다. 또 안전성 검사에 있어서 일부 증례에서 간장과 신장의 손상이 발생하였다.
- SP 40, 40은 면역계 중 보체와 관계된 단백질이다23). 최근의 연구에서는 glioma 환자나 알츠하이머 환자의 뇌조직에서 clusterin의 일종으로 발현이 증가되는 것으로 알려져 있다%, 본 연구에서는 감소되는 결과를 보였다.
- SP 40, 40은 면역계 중 보체와 관계된 단백질이다23). 최근의 연구에서는 glioma 환자나 알츠하이머 환자의 뇌조직에서 clusterin의 일종으로 발현이 증가되는 것으로 알려져 있다%, 본 연구에서는 감소되는 결과를 보였다.
- 정상적인 경우 35-50 mg/ml가 존재하며, 21일의 반감기를 가지고 있으며, plasma 분석시 가장 많은 양이 존재한다. 본 연구에서는 증가되는 결과를 보였다.
- 이는 Similar human albumirt으로 밝혀졌으며 임상적으로 효과를 기대하기는 어려운 프로테옴이었다. 시험군과 대조군 각각에 있어서 약물투여 전후에 변화되는 spot들에 대하여도 정량적 분석을 실시한 결과 대조군에서는 발현의 차이에 유의성이 있는 spot이 발견되지 않았다. 시험 군에서는 단백질의 발현에 변화를 보인 11개의 spot을 찾아낸 후, 이 중 투여 전, 후 유의성 있는 변화(p<0.
- 이 단백질은 SP 40, 40, Cytokeratin 9, hypothetical protein LCQC 54932, apolipoprotein E, human albumiri의 일종으로 확인되었으며, SP 40, 40, Cytokeratin 9, hypothetical protein LOC 54932, apolipoprotein Ee 감소하였고, human albumirie 증가하였다. SP 40, 40은 면역계 중 보체와 관계된 단백질이다23).
- 인삼 다당체의 투여 전후의 변화를 알아보기 위하여 21명의 자원자에게 무작위로 인삼 다당체 및 위약을 투여한 후 이 중 탈락한 2명을 제외한 19명의 지원자에게 인삼 다당체 및 위약 투여 전후에 혈액을 채취한 후 혈장을 분리하여 2D-gel 분석을 실시하였다. 주평가지수로 정의했던 프로테옴 변화 중 대조군과의 유의성 있는 차이가 있는 프로테음의 발현을 기준으로 1개의 spot 이유 의성 있는 증가(p<0.05)를 보였다. 이는 Similar human albumirt으로 밝혀졌으며 임상적으로 효과를 기대하기는 어려운 프로테옴이었다.
- SP 40, 40은 면역계 중 보체와 관계된 단백질이다23). 최근의 연구에서는 glioma 환자나 알츠하이머 환자의 뇌조직에서 clusterin의 일종으로 발현이 증가되는 것으로 알려져 있다%, 본 연구에서는 감소되는 결과를 보였다.
후속연구
- Leukocyte의 발생은 경도(1 positive)로 임상적으로 큰 문제가 되지 않고 또 요로감염 등 여러 상관인자의 관여를 의심할 수 있다. 각 1례씩의 BUN 및 ALT 수치의 정상범주 이상의 상승은 간장과 신장에 대한 독성을 고려해 볼 수 있으므로 향후 인삼 다당체의 투여 권장용량은 1일 4 g 미만으로 제한하는 것이 요구되어진다.
- 또 안전성 검사에 있어서 일부 증례에서 간장과 신장의 손상이 발생하였다. 따라서 농도 의존적 유효성 및 안전성에 대한 근거 확립을 위한 추가적인 dosage finding 임상시험이 뒤따라야 할 것으로 사료되며, 동시에 암환자에게 사용하기 위한 근거확보를 위해서는 향후 암환자에 대한 탐색 형 및 확증형 II상 임상시험이 요구되어지는 바이다.
- 본 임상시험에 있어서의 한계는 전임상연구가 대부분 암 질환을 중심으로 이루어진데 반해 약리 역동적 영향 및 안전성에 대한 정보를 수집하기 위한 일환으로 질환 군을 대상으로 하지 않고 정상 성인 남자 군을 대상으로 한 점이다. 따라서 인삼 다당체의 투여가 질환 군에서 본 임상시험에서 보인 것과 같은 양상으로 나타날 지는 미지수이다.
- 결과를 살펴보면 CR2-C3d, antitrypsin(단백질의 항 산화작용에 관여), proapolipoprotein 및 apolipoprotein(동맥경화의 예방과 개선에 중요한 역할 담당), Vitamin D binding protein(염증반응에서 폐를 보호하는 역할 담당), Ras-related protein Ral-A(phospholipid 대사과정의 조절, 세포골격형성을 조절 및 세포 내 외 운동이나 막의 물질교통(membrane traffic)에 관여), testis-specific protein Y(성 결정에 관여), transferrin, T-State Human Hemoblobin, 및 Human Hemoblobin(체내 철 평형에 관여) 등은 증가하였고, transthyTetin(가족성 아밀로이드 다면신경장애 (familial amyloid polyneuropathy, FAP)를 일으키는 주요 단백질)은 감소하였다. 연구자는 이에 근거하여 인삼 다당체도 유사한 효과를 가지고 있을 것으로 기대하였다.
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