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문제 정의
- 대한 실험 연구보고는 없었다. 따라서 본 실험에서는 면역 능을 증강시킬 수 있는 기능성식품을 개발하고자, 인삼과 속껍질이 있는 호도로 처방된 인삼호도탕을 물로 추출하여, 특이적 면역 및 비특이적면역에 미치는 영향을 관찰한 결과 약간의 지견을 얻었기에 이에 보고하고자 한다.
- 본 실험에서는 면역능을 조절하는 기능성식품을 개발하고자, 인삼호도탕을 물로 추출하여 생쥐에 투여한 후 흉선세포, 비장 세포 및 대식세포에 대한 영향을 관찰하였다.
제안 방법
- 2)에 부유시켜 실험에 사용하였다. Chemiluminescence 측정은 luminometer 를 이용하여 37℃ 에서 측정하였다 측정용 microplate (white)의 각 well에 준비된 macrophage 부유액 50 (d, lucigenin 용액 50 및 zymosan 용액 30 를 첨가하여, 3 7℃에서 15분간 전처리한 다음, 5분 간격으로 30분 동안 lucigenin 가lemiluminescence 양을 측정하였다.
- 5 % H3PO4) 100 를 혼합하여 96 well module에 넣고, 3 기에서 10 분간 방치한 후 570 nm에서 microplate-readei로 흡광도를 측정하였다. In vivo 실험에서는 GE 및 IHT 500 ㎎/㎏ 을 1일 2회씩 5일간 경구투여 하였다. 약물 투여 2일째 mouse 복강에 3% thioglycollate 2 를 주입하고, 5일째 경추탈골하여 도살시킨 다음, 생쥐를 경추탈골하여 도살하여 동일한 방법으로 세포를 분리하여 실험하였다.
- 1N-HC1 에 용해시킨 10%-SDS 100 를 각 well에 첨가하여 차광 상태에서 18 시간 더 배양한 후, 발색된 각 well의 흡광도를 microplate reader로 570 run에서 즉정하여 세포 생존율을 산정하였다. In vivo 실험에서는 생쥐 5 마리를 1군으로 하여 GE 또는 IHT 500 ㎎/㎏을 1일 2회씩 (09시, 18시) 5 일간 경구투여한 다음, 생쥐를 경추탈골하여 도살한 후, 동일한방법으로 세포를 분리하여 실험하였다.
- 3회 세척하였다. T 및 B cell의 subpopulatione PE-conjugated anti-B220 및 FITC-conjugated anti-Thyl monoclonal antibody로, T cell의 populatione PE-conjugated anti-CD4 및 FITC-conjugated anti-CD8 monoclonal antibody로 이 중 염색하여 4 ℃ 에서 30 분간 반응시킨 후 flow cytometer [excitation; 488 nm, emission; 525 nm(FITC), 575 nm(PE)]로 subpopulation을 측정하였다죄.
- The samples (500 ㎎/㎏) were administered orally twice a day for 5 days, and the serrated splenocytes were stained with PE-conjugated anti-B220 and FITC-conjugated anti-Thy1 monoclonal antibody or PE-conjugated anti-CD4 and FITC-conjugated anti-CD8 monoclonal antibody for 30 minutes at 4DC. The subpopulation was determined with a flow cytometer.
- Griess법끠으로 측정하였다. 각 well에 GE 및 IHT를 각각 50, 10 및 2 , jg/ml 농도로 처리한 다음, LPS 1와 y-IFN 25 units/ml를 첨가하여 48 시간 배양한 후, 배양액 100 와 Griess 시약 (1 % sulfanilamide + 0.1 % N~naphthylenediamine 2HCl + 2.5 % H3PO4) 100 를 혼합하여 96 well module에 넣고, 3 기에서 10 분간 방치한 후 570 nm에서 microplate-readei로 흡광도를 측정하였다. In vivo 실험에서는 GE 및 IHT 500 ㎎/㎏ 을 1일 2회씩 5일간 경구투여 하였다.
- 세포에 GE 및 IHH를 각각 50, 10 및 2 농도로 처리한 다음, 흉선세포에는 concanavalin A (Con A) 5 /zg/ml을 비장 세포에는 lipopolysaccharide (LPS) 10 /zg/ml를 첨가하여 37℃ 의 COi incubator에서 48 시간 배양하였다. 배양 종료 4 시간 전에 5 mg/ml 농도로 DPB&A에 희석된 MTT용액 20 를 각 well에 첨가하고, 0.1N-HC1 에 용해시킨 10%-SDS 100 를 각 well에 첨가하여 차광 상태에서 18 시간 더 배양한 후, 발색된 각 well의 흡광도를 microplate reader로 570 run에서 즉정하여 세포 생존율을 산정하였다. In vivo 실험에서는 생쥐 5 마리를 1군으로 하여 GE 또는 IHT 500 ㎎/㎏을 1일 2회씩 (09시, 18시) 5 일간 경구투여한 다음, 생쥐를 경추탈골하여 도살한 후, 동일한방법으로 세포를 분리하여 실험하였다.
- 적출한 흉선 및 비장을 DPBSA를 넣은 petri dish에서 잘게 분쇄하고 멸균된 Painless mesh로 여과하여 세포 부유액을 얻은 후 DPB&A로 2회 세척한 다음 1,500 rpm에서 10 분간 원심분리하여 흉선 및 비장세포를 분리하였다. 복강대식세포의 분리는 생쥐 복강에 3% ycollate 2 ml를 주입하고, 3일째 생쥐를 경추탈골하여 도살하였다. 복강에 cold PBS 10 ml 를 넣어 복강세포를 수집한 후 수집한 세포를 4℃에서 1, 500 rpm으로 10 분간 원심분리하고 RPMI 배지로 2회 세척하였다.
- 분리한 macrophage를 2 x 106 cls/ml가 되도록 DME (without phenol red, 0.34 g/L NaHCO* 2.6 g/L HEPES, pH 7.2)에 부유시켜 실험에 사용하였다. Chemiluminescence 측정은 luminometer 를 이용하여 37℃ 에서 측정하였다 측정용 microplate (white)의 각 well에 준비된 macrophage 부유액 50 (d, lucigenin 용액 50 및 zymosan 용액 30 를 첨가하여, 3 7℃에서 15분간 전처리한 다음, 5분 간격으로 30분 동안 lucigenin 가lemiluminescence 양을 측정하였다.
- 분리한 macrophage를 24 well plate에 well당 2 x 106 cells 을 분주한 후 macrophage로 부터 생성되는 nitric oxide (NO) 의양을 Griess법끠으로 측정하였다. 각 well에 GE 및 IHT를 각각 50, 10 및 2 , jg/ml 농도로 처리한 다음, LPS 1와 y-IFN 25 units/ml를 첨가하여 48 시간 배양한 후, 배양액 100 와 Griess 시약 (1 % sulfanilamide + 0.
- 생쥐 5 마리를 1군으로 하여 GE 또는 IHT 500 ㎎/㎏을 1일 2회씩 (09시, 18시) 5일간 경구투여한 다음, 생쥐를 경추탈골하여 도살한 후, 동일한 방법으로 세포를 분리하여, 각각 RPMI 1640 배지루 3회 세척하였다. T 및 B cell의 subpopulatione PE-conjugated anti-B220 및 FITC-conjugated anti-Thyl monoclonal antibody로, T cell의 populatione PE-conjugated anti-CD4 및 FITC-conjugated anti-CD8 monoclonal antibody로 이 중 염색하여 4 ℃ 에서 30 분간 반응시킨 후 flow cytometer [excitation; 488 nm, emission; 525 nm(FITC), 575 nm(PE)]로 subpopulation을 측정하였다죄.
- 분리한 흉선세포 및 비장 세포를 RPMI 1640 배지로 세포부유액을 조제한 후, 96-well plate의 각 well에 세포 부유액 100 (1 x 107 cells/ml) 를 분주하였다. 세포에 GE 및 IHH를 각각 50, 10 및 2 농도로 처리한 다음, 흉선세포에는 concanavalin A (Con A) 5 /zg/ml을 비장 세포에는 lipopolysaccharide (LPS) 10 /zg/ml를 첨가하여 37℃ 의 COi incubator에서 48 시간 배양하였다. 배양 종료 4 시간 전에 5 mg/ml 농도로 DPB&A에 희석된 MTT용액 20 를 각 well에 첨가하고, 0.
- In vivo 실험에서는 GE 및 IHT 500 ㎎/㎏ 을 1일 2회씩 5일간 경구투여 하였다. 약물 투여 2일째 mouse 복강에 3% thioglycollate 2 를 주입하고, 5일째 경추탈골하여 도살시킨 다음, 생쥐를 경추탈골하여 도살하여 동일한 방법으로 세포를 분리하여 실험하였다.
대상 데이터
- 본 실험에 사용한 인삼 (Ginseng Radix)은 농협중앙회 인삼검사소에서 검사된 고려인삼 6년근을 시중에서 구입하여 사용하였으며, 호도 (Juglandis semen)는 전라북도 무주에서 구입하여속껍질이 있는 상태로 사용하였다. 인삼은 50 g을 증류수 1, 000 ml로 2회 가열추출 하였으며, 인삼호도탕은 이남과 호도 동량 (인삼 50 g 및 호도 50 g) 을 혼합하여 증류수 1,000 ml로 2회 가열추줄 하였다.
- 에서 구입하여 사용하였으며, 기타 시약은 cell cultureg- 및 1급 시약을 사용하였다. 사용기구는 multi-well plate (96-well, 24-well, Costar), white multi-well plate (96-well, Nunc), microplate-reader (Dynatech MR5000), CCh incubator (Vision scientific Co.), flow cytometer (Coulter EPICS-XL), luminometer (TECAN, Infinite F200) 등을 사용하였다.
- 복강세포를 직경 120 mm petri dish에 분주하여 CO incubator 에서 2 시간 배양한 후, 부착되지 않은 세포를 제거하고 부착한 세포에 DPBS를 넣어 20분간 C6 incubator에 방치한 후 복강대식세포를 분리하였다. 세포를 배양할 때 배지는 RPMI1640 배지를 사용하였으며, 배지에 10% FBS와 penicillin-streptomycin (100 units/ml, 100 “g/ml)을 첨가하여 사용하였다.
- 실험에 사용한 생쥐는 C57BL/6계 수컷 6주령을 대한 실험동물(주)에서 구입하여, 온도 20±3, 습도 50±5%z dark/light 12시간의 조건하에서 1 주일 이상 실험실에 적응시킨 후 사용하였으며, 고형사료와 물을 자유스럽게 섭취하도록 하였다.
- 실험에 사용한 시약은 Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM), lucigenin, zymosan, MTT, sulfanilamide, N-naphthylethylenediamine . 2HC1, lipopolysaccharide (LPS), y -interferon (y-IFN)는 Sigma Co.
- 인삼은 50 g을 증류수 1, 000 ml로 2회 가열추출 하였으며, 인삼호도탕은 이남과 호도 동량 (인삼 50 g 및 호도 50 g) 을 혼합하여 증류수 1,000 ml로 2회 가열추줄 하였다. 추출 후, 여과하여 여액을 Rotary evaporator로 농축한 다음, freeze dryer로 동결건조하여 인삼분말 15.2 g (이하 GE라 함, 수득율; 30.4%) 및 인삼호도음 17.6 g (이하 IHT라 함, 수들율; 17.6%)을 얻어 실험에 사용하였다.
데이터처리
- 로 나타내었고 통계처리는 Student's t-test를 실시하여 p 기준으로 유의성 여부를 판정하였다.
이론/모형
- 생쥐의 흉선세포 및 비장세포의 분리는 Wysocki20* 및 Mizel" 등의 방법을 이용하였다. 적출한 흉선 및 비장을 DPBSA를 넣은 petri dish에서 잘게 분쇄하고 멸균된 Painless mesh로 여과하여 세포 부유액을 얻은 후 DPB&A로 2회 세척한 다음 1,500 rpm에서 10 분간 원심분리하여 흉선 및 비장세포를 분리하였다.
- 세포증식능 측정은 Mosmann22)이 개발하여 Kotnic 등으) 이변형시킨 MTT 방법으로 측정하였다. 분리한 흉선세포 및 비장 세포를 RPMI 1640 배지로 세포부유액을 조제한 후, 96-well plate의 각 well에 세포 부유액 100 (1 x 107 cells/ml) 를 분주하였다.
성능/효과
- 1 uM로증가하였다. In vitro 실험에서 GE 50, 1및 2 "g/ml를 각각 처리하였을 때 복강 macrophages로부터 생성되는 NO 양은 48.9±1.4, 55.2±1.3 및 60.2±1.1 nM로 대조군에 비해 10 g/ml 이하의 농도에서 증가하였으며, IHT 50, 1및 2 를 각각 처리하였을 때 복강 macrophages로부터 생성되는 NO 양은 49.3±0.8, 62.6+1.1 및 69.2±1.6 nM로 GE 처리군에 비해 10 “g/ml 이하의 농도에서 증가하였다(Table 5). In vivo 실험에서 대조군의 macrophage에 LPS와 Y-IFN을 처리하지 않았을 때 NO 생성양은 48 시간 후에 2.
- 비장세포에 B-lymphocyte mitogen인 lipopolysaccharide (LPS) 를 처리하였을 때, LPS를 처리하지 않은 대조군에 비해 세포생존율이 증가하였다. GE를 처리하고 LPS를 처리하였을 때 GE 2 /ml 농도에서 LPS를 처리한 대조군에 비해 세포생존율이 증가하였으며, IHH를 처리하고 LPS를 처리하였을 때 IHT 10, ug/ml 이하의 농도에서 GE를 처리한 군에 비해 세포생존율이 감소하였다.
- In vitro 실험에서 LP와 Y-interferone 을 처리하였을 때 LPS와 Y-interferone을 처리하지 않은 대조군에 비해 NO 생성이 증가하였다. GE를 처리하였을 때 NO양은 10g/ml 이하의 농도에서 대조군에 비해 증가하였으며, IHH를처리하였을 때 10 pg/ml 이하의 농도에서 GE 처리군보다 NO 생성이 더 증가하였다. In vivo 실험에서도 GE 투여군은 LPS와 Y-interferone을 처리한 대조군에 비해 NO 생성이 증가하였으며, IHH를 투여한 군은 GE 투여군보다 더 증가하였다.
- 8 11M로 증가하였다. GE를 투여하고 분리한 복강 macrophages로부터 생성되는 NO 양은 58.4±1.3 uM로 대조군에 비해 증가하였으며, IHT를 투여하고 분리한 복강 macrophages로부터 생성되는 NO 양은 66.2+1.4 μM로 GE 처리군에 비해 증가하였다(Table 6).
- 7%로 증가하였다. GE를 투여하고 분리한 비장세포에 LPS를 처리하였을 때 세포 생존율은 148.5±2.5%로 mitogen 처리군에 너〕해 증가하였으나, IHT를 투여한 군은 139.2+2.3% GE를 투여한 군에 비해 감소하였다(Table 2).
- 1%로 증가하였다. GE를 투여하고 분리한 흉선세포에 Con A를 처리하였을 때 세포생존율은 129.6±2.5%로 mitogen 처리군과 별 차이가 없었으나, IHT를 투여한 군은 116.2±3.3% GE를 투여한 군에 비해 감소하였다. 대조군의 비장 세포에 LPS를 처리하지 않았을 때의 세포생존율을 100%로 하였을 때, LPS를 처리하였을 때 세포생존율은 132.
- 3%로 대조군에 비해 CD4* 세포의 population이 증가하였다. IHT 투여군의 CD4+ 세포는 17.9±0.2%로, CD8+ 세포는 8.3±0.2%로 GE 투여군에 비해 CD4* 세포의 population이 증가하였다(Table 4).
- 알려져 있디쯔). In vitro 실험에서 GE 50, 10 및 2 g/ml를 각각 처리하였을 때 복강 macrophages로부터 생성되는 CL 양은 대조군에 비해 농도의존적으로 증가하였으며, IHT 50, 10 및 2 /M를 각각 처리하였을 때 복강 macrophages로부터 생성되는 CL 양은 GE 처리군에 비해 감소하였다(Fig. 1). In vivo 실험에서 GE 투여군은 복강 macrophages로부터 생성되는 CL 앙이 대조군에 비해 증가하였으며, IHT 투여군은 GE 투여군에 비해 CL 양이 감소하였다(Fig.
- 1). In vivo 실험에서 GE 투여군은 복강 macrophages로부터 생성되는 CL 앙이 대조군에 비해 증가하였으며, IHT 투여군은 GE 투여군에 비해 CL 양이 감소하였다(Fig. 2).
- In vivo 실험에서 대조군의 흉선세포에 Con A를 처리하지 않았을 때의 세포생존율을 100%로 하였을 때, Con A를 처리하였을 때 세포생존율은 124.9±3.1%로 증가하였다. GE를 투여하고 분리한 흉선세포에 Con A를 처리하였을 때 세포생존율은 129.
- Thyl+ 세포는 GE를 투여하였을 때 대조군에 비해 증가하였으며, IHT를 투여하였을 때 GE 투여군보다 더 증가하였다. 이 결과는 IHT가 GE에 의해 증가되는 Thyl* 세포의 population을 더욱 증가시켜 면역능을 조절하고 있음을 시사하는 것이다.
- IHT 50, 10 및 2 을 처리하고 Con A를 처리하였을 때 세포생존율은 10 “g/ml 이하의 농도에서 GE 처리군에 비해 감소하였다. 대조 군의 비장 세포에 B-lymphocyte mitogen인 lipopolysaccharide (LPS) 를처리하지 않았을 때의 세포생존율을 100%로 하였을 때, LPS를 처리하였을 때 세포생존율은 128.3±L4%로 증가하였다. GE를 50, 10 및 2 /ml을 처리하고 LPS를 처리하였을 때 세포생존율은 2 /ml 농도에서 mitogen 처리군에 비해 증가하였다.
- 대조군의 흉선세포 중 Th (CD4* 세포) 세포는 9.3%, Tc (CD8+ 세포) 세포는 3.8% 이었다 GE를 투여하였을 때 CD4+ 세포는 대조군에 비해 증가하였으며, IHH를 투여한 군은 GE 투여군보다 더 증가하였다. GE를 투여하였을 때 CD8+ 세포는 대조군에 비해 증가하였으나, IHH를 투여한 군은 GE 투여군에 비해 별 차이가 없었다.
- 이 결과는 IHT가 GE에 의해 증가되는 Thyl* 세포의 population을 더욱 증가시켜 면역능을 조절하고 있음을 시사하는 것이다. 비장 세포의 CD 세포는 GE를 투여하였을 때 대조군에 비해 증가하였으며, IHH를 투여하였을 때 GE 투여군보다 더 증가하였다. 비장 세포의 CD8+ 세포는 GE를 투여하였을 때 대조군에 비해 별 차이가 없었으며, IHH를 투여하였을 때 GE 투여군에 비해 별 차이가 없었다.
- GE를 투여하고 분리한 흉선세포는 대조군에 비해 별 차이가 없었으나, IHH를 투여하고 분리한 흉선세포는 GE 투여군에 비해 감소하였다. 비장세포에 LPS를 처리하였을 때 LPS를 처리하지 않은 대조군에 비해 세포생존율이 증가하였다. GE를 투여하고 분리한 비장세포는 대조군에 비해 증가하였으나, IHT를 투여하고 분리한 비장세포는 GE 투여군에 비해 감소하였다.
- GE를 투여하고 분리한 비장세포는 대조군에 비해 증가하였으나, IHT를 투여하고 분리한 비장세포는 GE 투여군에 비해 감소하였다. 이러한 실험 결과는 in vitro 실험의 결과와도 유사한 결과로서 GE는 면역세포의 생존율을 증가시켜 세포성면역을 증강시킬 수 있으나, IHT는 면역세포의 증식을 억제하여 세포성면역능을 감소시킬 수 있음을 시사하는 것이다.
- 이상의 실험결과 인삼을 투여하였을 때에 비해 인삼 호도 탕을 투여하였을 때 대체적으로 특이적 및 비특이적 면역 반응이 저하되었으나, 인삼호도탕을 투여하였을 때 인삼을 투여하였을 때에 비해 흉선세포와 비장세포에 있는 helper T 세포를 증가시켰다는 것은 매우 흥미로운 결과이다. 생체에서 일어나는 면역반응은 매우 다양하기 때문에, 이러한 실험결과는 인삼호도탕이 본 실험에서 관찰한 면역 경로가 아닌 또 다른 경로를 통하여 면역반응을 조절할 수 있음을 강력히 시사하는 것이며 이에 대한 자세한 기전은 추후 연구되어야 할 과제이다.
- 이상의 실험결과 인삼호도탕은 인삼에 비해 특이적 및 비특이적 면역반응을 약화시킬 수 있는 탕제라 사료된다.
- 인삼호도탕은 흉선세포 및 비장세포의 생존율을 인삼에 비해 감소시켰으며, 흉선세포의 CD4+ 세포, 비장세포의 Thyl+ 세포 및 비장세포의 CD4+ 세포 population을 인삼에 비해 증가시켰고, 복강 macrophages의 phagocytic activity# 인삼에 비해 감소시켰으며, nitric oxide의 생성을 인삼에 비해 증가시켰다.
- 호도를 천식에 사용할 때는 속껍질을 벗기지 않고 그대로 둔 채 사용하며, 유아의 천식에 人蔘胡桃湯을 사용하는 경우 속껍질이 있는 호도를 사용할 때는 천식이 가라앉았다가, 속껍질을 벗긴 호도를 사용하였더니 천식이 재발하였고 이어서 껍질을 벗기지 않는 것을 사용하였더니 천식에 효과가 있었다. 호두의 속껍질을 그대로 둔 채 복용하면 命門에 들어간다 하였고, "連皮則能固能補, 去皮則止於能行能潤耳 (껍질까지 쓰면 튼튼하게 하기도 하고 보양하기도 하는데 껍질을 제거한 것은 다만 소통하게 하고 윤활하게 할 수 있을 뿐이다)라고 하였다
후속연구
- 것은 매우 흥미로운 결과이다. 생체에서 일어나는 면역반응은 매우 다양하기 때문에, 이러한 실험결과는 인삼호도탕이 본 실험에서 관찰한 면역 경로가 아닌 또 다른 경로를 통하여 면역반응을 조절할 수 있음을 강력히 시사하는 것이며 이에 대한 자세한 기전은 추후 연구되어야 할 과제이다.
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