본 연구에서는 전극분무 이온화-이온 포획 질량 분석기를 이용하여 인체 IgG의 N-연결 글라이칸 중 이중촉각 구조를 가지면서 비환원 말단의 갈락토오즈 개수가 0, 1, 2 개인 서로 다른 세 가지 글라이칸의 단일 쪼개짐 (MS/MS) 및 다중 쪼개짐 현상을 관찰하고 이를 구조 분석에 이용하였다. MS/MS 분석에서는 퓨코오즈가 결합된 환원 말단의 N-아세틸 글루코사민의 0,2-고리 쪼개짐으로 파생되는 조각 피크가 가장 높은 세기로 나타나는 것을 관찰할 수 있었고, 전구체 피크와 별개로 연속적인 당 단위체의 쪼개짐이 일어나는 것을 알 수 있었다. 또한 G1 글라이칸의 경우에서만 비환원 말단의 갈락토오즈와 N-아세틸글루코사민이 결합된 채 쪼개지는 현상이 일어나는 것을 관찰할 수 있었다. 다중 쪼개짐 질량 분석 기법을 이용하여 MS/MS 스펙트럼에서 나타나는 조각 피크들의 구조를 재확인할 수 있었고, 이를 트리 구조로 정리할 수 있었다. 또한 추가적인 2,4-고리 쪼개짐 현상이 환원 말단 하나 바깥쪽의 N-아세틸 글루코사민에서 공통적으로 일어나는 것을 관찰할 수 있었다. 이와 같은 다중 쪼개짐 질량 분석기법을 이용하여 보다 복잡한 구조의 글라이칸 구조 분석에 이용될 수 있을 것으로 기대된다.
본 연구에서는 전극분무 이온화-이온 포획 질량 분석기를 이용하여 인체 IgG의 N-연결 글라이칸 중 이중촉각 구조를 가지면서 비환원 말단의 갈락토오즈 개수가 0, 1, 2 개인 서로 다른 세 가지 글라이칸의 단일 쪼개짐 (MS/MS) 및 다중 쪼개짐 현상을 관찰하고 이를 구조 분석에 이용하였다. MS/MS 분석에서는 퓨코오즈가 결합된 환원 말단의 N-아세틸 글루코사민의 0,2-고리 쪼개짐으로 파생되는 조각 피크가 가장 높은 세기로 나타나는 것을 관찰할 수 있었고, 전구체 피크와 별개로 연속적인 당 단위체의 쪼개짐이 일어나는 것을 알 수 있었다. 또한 G1 글라이칸의 경우에서만 비환원 말단의 갈락토오즈와 N-아세틸글루코사민이 결합된 채 쪼개지는 현상이 일어나는 것을 관찰할 수 있었다. 다중 쪼개짐 질량 분석 기법을 이용하여 MS/MS 스펙트럼에서 나타나는 조각 피크들의 구조를 재확인할 수 있었고, 이를 트리 구조로 정리할 수 있었다. 또한 추가적인 2,4-고리 쪼개짐 현상이 환원 말단 하나 바깥쪽의 N-아세틸 글루코사민에서 공통적으로 일어나는 것을 관찰할 수 있었다. 이와 같은 다중 쪼개짐 질량 분석기법을 이용하여 보다 복잡한 구조의 글라이칸 구조 분석에 이용될 수 있을 것으로 기대된다.
We used electrospary ionization ion trap tandem mass spectrometry (ESI-IT tandem MS) to structural elucidation of three different biantennary-type glycans having zero, one, two galactoses (G0, G1, G2). The highest fragment ion in the MS/MS spectra of three glycans was produced by 0,2-ring cleavage o...
We used electrospary ionization ion trap tandem mass spectrometry (ESI-IT tandem MS) to structural elucidation of three different biantennary-type glycans having zero, one, two galactoses (G0, G1, G2). The highest fragment ion in the MS/MS spectra of three glycans was produced by 0,2-ring cleavage of fucose-linked N-acetylglucosamine (GlcNAc) in reducing end. The fragment ions both from precursor ions and 0,2-ring cleaved ions ($^{0.2}An$; n=5 for G0, n=6 for G1 and G2) were not overlapped each other. As results of $MS^n$ analyses, tandem fragmentation trees of each glycans were generated and 2,4-ring cleavages ($^{2.4}A_6$) were occurred in GlcNAc linked to reducing end GlcNAc. This structural elucidation and fragmentation study of N-linked glycans by tandem mass spectrometry can be applied to structural analysis of more complicated glycans.
We used electrospary ionization ion trap tandem mass spectrometry (ESI-IT tandem MS) to structural elucidation of three different biantennary-type glycans having zero, one, two galactoses (G0, G1, G2). The highest fragment ion in the MS/MS spectra of three glycans was produced by 0,2-ring cleavage of fucose-linked N-acetylglucosamine (GlcNAc) in reducing end. The fragment ions both from precursor ions and 0,2-ring cleaved ions ($^{0.2}An$; n=5 for G0, n=6 for G1 and G2) were not overlapped each other. As results of $MS^n$ analyses, tandem fragmentation trees of each glycans were generated and 2,4-ring cleavages ($^{2.4}A_6$) were occurred in GlcNAc linked to reducing end GlcNAc. This structural elucidation and fragmentation study of N-linked glycans by tandem mass spectrometry can be applied to structural analysis of more complicated glycans.
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제안 방법
본 연구에서는 전극분무 이온화-이온 포획 질량 분석기를 이용하여 인체 IgG의 N-연결 글라이칸 중 이중촉각 구조를 가지면서 비환원 말단의 갈락토오즈 개수가 0, 1, 2 개인 서로 다른 세 가지 글라이칸의 단일 쪼개짐 (MS/MS) 및 다중 쪼개짐 현상을 관찰하고 이를 구조 분석에 이용하였다. MS/MS 분석에서는 퓨코오즈가 결합된 환원 말단의 N-아세틸 글루코사민의 0, 2-고리 쪼개짐으로 파생되는 조각 피크가 가장 높은 세기로 나타나는 것을 관찰할 수 있었고, 전구체 피크와 별개로 연속적인 당 단위체의 쪼개짐이 일어나는 것을 알 수 있었다.
본 연구에서는 이와 같이 질량 분석기를 이용해 인체 IgG의 N-연결 글라이칸의 양이온 프로파일을 보고 이 중비환원 말단에 갈락토오즈의 개수가 0개, 1개, 2개이면서 나머지 구조는 전부 같은 3개의 글라이칸을 집중적으로 구조 분석에 이용하였다. 글라이칸의 구조 분석은 전극 분무 이온화-이온 포획 질량 분석기를 사용하여 첫째로 MS/MS 분석을 통한 서열 분석을 수행하였고, 둘째로 다중 쪼개짐 질량 분석 기법 (MS")을 통해 MS/MS로 유추한 서열을 재확인하였고, 마지막으로 그 과정에서 글라이칸 분자의 쪼개짐 현상에 대한 고찰을 하였다.
분석에 이용하였다. 글라이칸의 구조 분석은 전극 분무 이온화-이온 포획 질량 분석기를 사용하여 첫째로 MS/MS 분석을 통한 서열 분석을 수행하였고, 둘째로 다중 쪼개짐 질량 분석 기법 (MS")을 통해 MS/MS로 유추한 서열을 재확인하였고, 마지막으로 그 과정에서 글라이칸 분자의 쪼개짐 현상에 대한 고찰을 하였다.
매트릭스 보조 레이저 탈착/ 이온화 질량 분석기에 사용된 유기 매트릭스, 2, 5-dihysroxybenzoic acid (DHB; 30 mg/ mL) 는 0.1% trifluoroacetic acid (TFA) 가 함유된 용매 (methanol : water = 4 : 1)에 녹여 사용하였으며, 시료 준비는 dried droplet 방법을 이용하여 제조하였다. 사용된 질량 분석기는 337 nm 질소 레이저가 장착된 Biflex IV (Bruker, Bremen, Gennany)를 이용하여 양이온 모드에서 분석하였다.
1% trifluoroacetic acid (TFA) 가 함유된 용매 (methanol : water = 4 : 1)에 녹여 사용하였으며, 시료 준비는 dried droplet 방법을 이용하여 제조하였다. 사용된 질량 분석기는 337 nm 질소 레이저가 장착된 Biflex IV (Bruker, Bremen, Gennany)를 이용하여 양이온 모드에서 분석하였다. 사용된 레이저의 세기는 최적 분해능 및 신호대 잡음비를 가질 수 있도록 30%에서 50% 사이에서 적절하게 사용하였다.
사용된 레이저의 세기는 최적 분해능 및 신호대 잡음비를 가질 수 있도록 30%에서 50% 사이에서 적절하게 사용하였다. 또한 분석된 스펙트럼은 100번 조사를 한 평균치를 취하였으며 분석 전 질량 분석기의 질량 보정은 bradkynin 2-9 (Mw; 903.4603), angiotensin I (Mw; 1295.6774), adrenocorticotropic hormone rat fragment 1-16 (Mw; 1935.9776) and adrenocorticotropic hormone fragment 18-39 (Mw; 2464.1909)로 구성된 혼합물을 가지고 수행하였다.
미세관 액체 크로마토그래피 (Agilent 1100, Palo Alto, CA)가 장착된 LCQ DECA-XP 이온 트랩 질량 분석기 (ThermoFinnigan, San Jose, CA, USA)를 이용하여 양이온 모드에서 분석하였다. 이동상 용매는 메탄올과 물의 일대일 혼합 용매를 5 111/mm 속도로 사용하였다.
이동상 용매는 메탄올과 물의 일대일 혼합 용매를 5 111/mm 속도로 사용하였다. 주입된 시료의 부피는 1~5 μ1로 하였으며 질량 분석기의 분석 조건은 기존의 분석 방법을 대부분 그대로 사용하였다(8), 보다 자세한 세부 조건은 다음과 같았다(분무 전압: 5 kV, 질소가스 유속: 15 AU, 이온주입 미세관 전압: 25 V, 이온 전달 미세관 온도: 275℃, 다중 질량 분석을 위한 이온 격리 폭: 1.5 Da, 중격 에너지: 30-40%).
1). 본 연구에서는 먼저 매트릭스 보조 레이저 탈착/이온화 질량분석기를 이용하여 IgG의 N-글라이칸의 양이온 모드에서의 프로파일을 확인하였다(Fig. 2-A). 그 결과 모든 피크가 수소가 아닌 나트륨 이온으로 양 이온화된 형태로 나타났으며, 이는 기존 다른 연구 그룹의 결과와 같았다(9).
또한 피크 세기에 차이가 있었는데 m/z 1485, 1647, 1809의 3개의 피크가 가장 높은 세기를 나타냈으며 이 3개의 피크는 각각 이중촉각구조의 비환원 말단에 갈락토오즈가 0개, 1개, 2개 결합된 글라이칸에 해당했다. 같은 시료를 전극분무 이온화 질량분석기로 프로파일링한 결과도 역시 이 3개의 피크가 가장 높은 세기를 보였고(Fig 2-B), 이후의 다중 쪼개짐 질량 분석에서 이 3개의 피크를 비교 분석하기로 결정하였다.
전극 분무 이온화-이온 포획 질량 분석기를 이용하여 앞서 언급했던 세가지 피크에 대해 다중 쪼개짐 질량 분석법을 수행하였고 그 결과를 트리 구조로 요약해 Fig. 6, 7, 8에 나타내었다. MS/MS 분석에서 가장 피크 세기가 컸던 만큼 0, 2 고리 쪼개짐 조각 피크의 다중 쪼개짐 현상이 가장 많이 관찰될 수 있었고, 추가적인 2, 4 고리 쪼개짐 현상을 관찰할 수 있었다.
대상 데이터
이 실험에 사용된 모든 물은 3차수를 사용하였고, 유기화합물 및 용매는 분석 시약용 제품을 구입하여 사용하였다. IgG는 Sigma로부터 구입하였고, N-이yean을 IgG로부터 이탈시키는데 사용된 N-glycosidase F는 Roche로부터 구입하였다.
분석하였다. 이동상 용매는 메탄올과 물의 일대일 혼합 용매를 5 111/mm 속도로 사용하였다. 주입된 시료의 부피는 1~5 μ1로 하였으며 질량 분석기의 분석 조건은 기존의 분석 방법을 대부분 그대로 사용하였다(8), 보다 자세한 세부 조건은 다음과 같았다(분무 전압: 5 kV, 질소가스 유속: 15 AU, 이온주입 미세관 전압: 25 V, 이온 전달 미세관 온도: 275℃, 다중 질량 분석을 위한 이온 격리 폭: 1.
이론/모형
3, 4, 5). 글라이칸 쪼개짐 구조의 명명은 Domon과 Costello의 명명법을 따랐다(10). 그 밖에도 MS/MS 분석을 수행한 전구체 이온 피크와 환원 말단의 0, 2 고리 쪼개짐 피크로부터 차례대로 퓨코오즈, N-아세틸 글루코사민이 떨어져 나오는 조각 피크들이 서로 겹치지 않고 연속적으로 나타나는 것을 세가지 MS/MS 분석 모두에서 확인할 수 있었다.
성능/효과
MS/MS 분석에서는 퓨코오즈가 결합된 환원 말단의 N-아세틸 글루코사민의 0, 2-고리 쪼개짐으로 파생되는 조각 피크가 가장 높은 세기로 나타나는 것을 관찰할 수 있었고, 전구체 피크와 별개로 연속적인 당 단위체의 쪼개짐이 일어나는 것을 알 수 있었다. 또한 G1 글라이칸의 경우에서만 비환원 말단의 갈락토오즈와 N-아세틸글루코사민이 결합된 채 쪼개지는 현상이 일어나는 것을 관찰할 수 있었다.
MS/MS 분석에서는 퓨코오즈가 결합된 환원 말단의 N-아세틸 글루코사민의 0, 2-고리 쪼개짐으로 파생되는 조각 피크가 가장 높은 세기로 나타나는 것을 관찰할 수 있었고, 전구체 피크와 별개로 연속적인 당 단위체의 쪼개짐이 일어나는 것을 알 수 있었다. 또한 G1 글라이칸의 경우에서만 비환원 말단의 갈락토오즈와 N-아세틸글루코사민이 결합된 채 쪼개지는 현상이 일어나는 것을 관찰할 수 있었다. 다중 쪼개짐 질량 분석 기법을 이용하여 MS/MS 스펙트럼에서 나타나는 조각 피크들의 구조를 재확인할 수 있었고, 이를 트리 구조로 정리할 수 있었다.
또한 G1 글라이칸의 경우에서만 비환원 말단의 갈락토오즈와 N-아세틸글루코사민이 결합된 채 쪼개지는 현상이 일어나는 것을 관찰할 수 있었다. 다중 쪼개짐 질량 분석 기법을 이용하여 MS/MS 스펙트럼에서 나타나는 조각 피크들의 구조를 재확인할 수 있었고, 이를 트리 구조로 정리할 수 있었다. 또한 추가적인 2, 4-고리 쪼개짐 현상이 환원 말단 하나 바깥쪽의 N-아세틸 글루코사민에서 공통적으로 일어나는 것을 관찰할 수 있었다.
다중 쪼개짐 질량 분석 기법을 이용하여 MS/MS 스펙트럼에서 나타나는 조각 피크들의 구조를 재확인할 수 있었고, 이를 트리 구조로 정리할 수 있었다. 또한 추가적인 2, 4-고리 쪼개짐 현상이 환원 말단 하나 바깥쪽의 N-아세틸 글루코사민에서 공통적으로 일어나는 것을 관찰할 수 있었다. 이와 같은 다중 쪼개짐 질량 분석기법을 이용하여 보다 복잡한 구조의 글라이칸 구조 분석에 이용될 수 있을 것으로 기대된다.
m/z 1485, 1647, 1809 세가지 피크의 MS/MS 분석 결과 3개의 피크 모두에서 환원 말단의 퓨코오즈가 연결된 N-아세틸 글루코사민의 0, 2 고리 쪼개짐 현상에 의한 피크가 가장 높게 관찰되었다(Fig. 3, 4, 5). 글라이칸 쪼개짐 구조의 명명은 Domon과 Costello의 명명법을 따랐다(10).
글라이칸 쪼개짐 구조의 명명은 Domon과 Costello의 명명법을 따랐다(10). 그 밖에도 MS/MS 분석을 수행한 전구체 이온 피크와 환원 말단의 0, 2 고리 쪼개짐 피크로부터 차례대로 퓨코오즈, N-아세틸 글루코사민이 떨어져 나오는 조각 피크들이 서로 겹치지 않고 연속적으로 나타나는 것을 세가지 MS/MS 분석 모두에서 확인할 수 있었다. 또한 비환원 말단의 갈락토오즈 개수에 따라 갈락토오즈가 떨어져 나와 발생하는 조각 피크들의 개수도 0, 1, 2개로 일치하였고, 특이하게도 갈락토오즈가 1개인 G1의 경우만 비환원 말단의 갈락토오즈와 N-아세틸 글루코사민이 동시에 떨어져 나오는 현상을 관찰할 수 있었다.
그 밖에도 MS/MS 분석을 수행한 전구체 이온 피크와 환원 말단의 0, 2 고리 쪼개짐 피크로부터 차례대로 퓨코오즈, N-아세틸 글루코사민이 떨어져 나오는 조각 피크들이 서로 겹치지 않고 연속적으로 나타나는 것을 세가지 MS/MS 분석 모두에서 확인할 수 있었다. 또한 비환원 말단의 갈락토오즈 개수에 따라 갈락토오즈가 떨어져 나와 발생하는 조각 피크들의 개수도 0, 1, 2개로 일치하였고, 특이하게도 갈락토오즈가 1개인 G1의 경우만 비환원 말단의 갈락토오즈와 N-아세틸 글루코사민이 동시에 떨어져 나오는 현상을 관찰할 수 있었다.
6, 7, 8에 나타내었다. MS/MS 분석에서 가장 피크 세기가 컸던 만큼 0, 2 고리 쪼개짐 조각 피크의 다중 쪼개짐 현상이 가장 많이 관찰될 수 있었고, 추가적인 2, 4 고리 쪼개짐 현상을 관찰할 수 있었다. 특히 2, 4 고리 쪼개짐 현상은 0, 2 고리 쪼개짐 현상이 일어났던 가장 안쪽의 환원 말단보다 하나 바깥쪽의 N-아세틸 글루코사민에서만 일어나는 것을 볼 수 있었다.
MS/MS 분석에서 가장 피크 세기가 컸던 만큼 0, 2 고리 쪼개짐 조각 피크의 다중 쪼개짐 현상이 가장 많이 관찰될 수 있었고, 추가적인 2, 4 고리 쪼개짐 현상을 관찰할 수 있었다. 특히 2, 4 고리 쪼개짐 현상은 0, 2 고리 쪼개짐 현상이 일어났던 가장 안쪽의 환원 말단보다 하나 바깥쪽의 N-아세틸 글루코사민에서만 일어나는 것을 볼 수 있었다. 이 밖에도 m/z 1809의 가장 큰 분자량을 갖는 G2 글라이칸의 경우 G1 글라이칸에 비해 갈락토오즈의 쪼개짐이나 떨어짐 현상이 덜 관찰되는 것을 볼 수 있었으며, G0에 비흥H서도 만노오즈의 쪼개짐 현상이 적게 관찰되었다.
특히 2, 4 고리 쪼개짐 현상은 0, 2 고리 쪼개짐 현상이 일어났던 가장 안쪽의 환원 말단보다 하나 바깥쪽의 N-아세틸 글루코사민에서만 일어나는 것을 볼 수 있었다. 이 밖에도 m/z 1809의 가장 큰 분자량을 갖는 G2 글라이칸의 경우 G1 글라이칸에 비해 갈락토오즈의 쪼개짐이나 떨어짐 현상이 덜 관찰되는 것을 볼 수 있었으며, G0에 비흥H서도 만노오즈의 쪼개짐 현상이 적게 관찰되었다. 이는 m/z 1809 피크의 초기 MS 스펙트럼에서의 피크 세기가 가장 낮았기 때문에 충분한 조각 피크를 얻을 수 없었을 가능성과 포획하는 이온의 m/z값이 증가함에 따라 검출할 수 있는 저분자량 쪼개짐 피크들의 양이 적어지기 때문으로 생각해 볼 수 있다, 또한 초기 MS 스펙트럼에서의 피크 세기가 낮음으로 인해 이후의 다중 쪼개짐 분석에 필요한 충분한 양의 이온을 확보하지 못해, 다른 두 글라이칸이 MS5까지 분석할 수 있었던 데 반해 m/z 1809 피크는 MS4까지만 분석할 수 있었다.
세 가지 글라이칸 피크의 다중 쪼개짐 트리 구조를 통해 MS/MS로 유추한 조각 피크들의 구조를 보다 정확하게 확인할 수 있었고, 비환원 말단의 갈락토오즈 개수에 따라 상이한 다중 쪼개짐 현상을 관찰할 수 있었다. 이는 질량분석기를 이용한 보다 복잡한 구조의 글라이칸의 구조 해석에 기초 자료로 활용될 수 있을 것으로 생각된다.
후속연구
또한 추가적인 2, 4-고리 쪼개짐 현상이 환원 말단 하나 바깥쪽의 N-아세틸 글루코사민에서 공통적으로 일어나는 것을 관찰할 수 있었다. 이와 같은 다중 쪼개짐 질량 분석기법을 이용하여 보다 복잡한 구조의 글라이칸 구조 분석에 이용될 수 있을 것으로 기대된다.
다중 쪼개짐 현상을 관찰할 수 있었다. 이는 질량분석기를 이용한 보다 복잡한 구조의 글라이칸의 구조 해석에 기초 자료로 활용될 수 있을 것으로 생각된다.
참고문헌 (10)
Clamp, J. R and F. W. Putnam (1996), The carbohydrate prosthetic group of human gamma-globulin, J. Biol. Chem. 239, 3233-3240
Parekh, R. B., R. A. Dwek, B. J. Sutton, D. L. Fermandes, A. Leung, D. Stanworth, T. W. Rademacher, T. Mizuochi, T. Taniguchi, K. Matsuta, F. Takeuchi, Y. Nagano, T. Miyamoto, and A. Kobata (1985), Association of rheumatoid arthritis and primary osteoarthritis with changes in the glycosylation pattern of total serum IgG, Nature 316, 452-457
Wormald, M. R., P. M. Rudd, D. J. Harvey, S. C. Chang, I. G. Scragg, and R. A. Dwek (1997), Variations in Oligosaccharide-Protein Interactions in Immunoglobulin G Determine the Sire-Specific Glycosylation Profiles and Modulate the Dynamic Motion of the Fc Oligosaccharides, Biochemistry 36, 1370-1380
Kuster, B., Naveu, T. J., and D. J. Harvey (1996), Rapid approach for sequencing neutral oligosaccharides by exoglycosidase digestion and matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry, J. Mass. Spectrom. 31, 1131-1140
Kuster, B., Wheeler, S. F., Hunter, A. P., Dwek, R. A., am D. J. Harvey (1997), Sequencing of N-linked oligosaccharides directly from protein gels: in-gel deglycosylatlon followed by matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry and normal-phase high-performance liquid chromatography, Anal. Biochem. 22, 82-101
Saba, J. A., Kunkel, J. P., Jan, D. C, Ens, W. E., Standing, K. G., Butler, M., Jamieson, J. C., and H. Perreault (2002), A study of immunoglobulin G glycosylation in monoclonal and polyclonal species by electrospray and matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry, Anal. Biochem. 305, 16-31
Lee, C. S., Kim, Y. G., Joo, H. S., and B. G. Kim (2004), Structural analysis of lipid A from Escherichia coli O157 : H7 : K- using thin-layer chromatography and ion-trap mass spectrometry, Journal of Mass Spectrometry 39, 514-525
Creaser, C. S., Reynolds, J. C., and D. J. Harvey (2002), Structural analysis of oligosaccharides by atmospheric pressure matrix-assisted laser desorption/ionisation quadrupole ion trap mass spectrometry, Rapid Commun. Mass. Spectrom. 16, 176-184
Doman, B. and C. E. Costello (1988), A systematic nomenclature for carbohydrate fragmentations in FAB-MS/MS spectra of glycoconjugates, Glycoconjugate 5, 397-409
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