초록 ▼

1. 이미 보고되어 있는 Rat liver유래의 시알산전이효소 (ST3Gal Ⅲ)유전자의 염기서열을 기본으로 하여, Galβ1,3(4)GlcNAcα2,3-sialyltransferase를 코드하고 있는 cDNA (MB N1)가 Mouse brain cDNA library로부터 클로닝 되었다. 1,125 bp의 cDNA염기서열은 374개의 아미노산으로 이루어진 MB ST3Gal Ⅲ를 코드하는 ORF를 포함하고 있었다.2. Rat liver유래의 ST3Gal Ⅲ와 MB ST3Gal Ⅲ의 염기서열과 아미노산서열을 비교하면 각각 98%와

1. 이미 보고되어 있는 Rat liver유래의 시알산전이효소 (ST3Gal Ⅲ)유전자의 염기서열을 기본으로 하여, Galβ1,3(4)GlcNAcα2,3-sialyltransferase를 코드하고 있는 cDNA (MB N1)가 Mouse brain cDNA library로부터 클로닝 되었다. 1,125 bp의 cDNA염기서열은 374개의 아미노산으로 이루어진 MB ST3Gal Ⅲ를 코드하는 ORF를 포함하고 있었다.2. Rat liver유래의 ST3Gal Ⅲ와 MB ST3Gal Ⅲ의 염기서열과 아미노산서열을 비교하면 각각 98%와 99%이상의 높은 상동성을 나타내었다. 또한 MBST3Gal Ⅲ의 1차구조는 다른 당전이효소에서와 마찬가지로 N말단으로부터 세포질 영역 (아미노산 8개)과 20개의 소수성 아미노산으로 이루어진 막관통영역, 그리고 Stem region을 포함하는 긴 활성영역 (아미노산 346개)으로 되어 있는 Domain구조를 나타내었다.3. 이미 보고되어 있는 rat liver ST6Gal Ⅰ과 porcine submaxillary gland ST3Gal Ⅰ 그리고 rat liver ST3Gal Ⅲ에서 보존되어 있는 아미노산서열에 기본하여 합성된 Primer를 이용하여 PCR에 의해 만들어진 620 bP의 Probe를 이용한 Plaque hybridization에 의해 ST3Gal Ⅳ를 코드하고 있는 DNA클론이 Mouse brain cDNA library로부터 분리되었다. 1,002 bp의 cDNA 염기서열은 333개의 아미노산으로 이루어진 MB ST3Gal Ⅳ를 코드하는 ORF를 포함하고 있었다.4. Human placenta와 Human melanoma세포유래의 ST3Gal Ⅳ (Galβ 1,3GalNAc/Galβ1,4GlcNAc α 2,3-sialyltransferase)와 MB ST3Gal Ⅳ의 아미노산서열을 비교하면 약 90%의 높은 상동성을 나타내었다. MB ST3Gal Ⅳ의 아미노산서열의 1차구조는 다른 당전이효소에서와 마찬가지로 N말단 으로부터 8개의 아미노산으로 이루어진 세포질 영역과 18개의 소수성 아미노산으로 이루어진 막관통 영역, 그리고 Stem region을 포함하는 긴 활성영역 (아미노산 307개)으로 되어 있는 Domain구조를 나타냈다.5. Northern blot 해석에 의해 MB ST3Gal Ⅲ와 MB ST3Gal Ⅳ의 mRNA의 발현은 조직특이성을 나타내었다. 예를 들면, MB ST3Gal Ⅲ의 경우 Brain, Liver, Heart에 있어서 mRNA의 강한 발현이 나타났으나, Kidney에서는 발현이 약하고 그 외의 다른 조직에서는 거의 발현이 검출되지 않았다. 한편, MB ST3Gal Ⅳ의 경우는 mRNA의 발현량이 Liver에서 가장 많고, 다음은 Submaxillary gland, Heart, Lung에서 상당량이 존재하고, Brain, Placenta, Kidney에서는 소량이었다.6. MB ST3Gal Ⅲ의 C말단측의 활성영역을 COS세포에서 발현시켰을 때, MBST3Gal Ⅲ은 GaIβ1,3GlcNAc와 Galβ1,4GlcNAc의 2당류 구조를 가진 수용체에 대해서만 α2,3-시알산전이효소 활성을 나타내었는다. 그러나, 기질특이성을 있어서는, 2당류인 Galβ1,3GlcNAc보다 4당류인 Lacto-N-tetraose (Galβ1-3GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glc)에 대해서 우선적인 선택성을 나타내고, Galβ1-4GlcNAc에 대해서는 약한 선택성을 나타내었다. 한편, MB ST3Gal Ⅳ의 경우에는 활성측정에 사용된 어떠한 기질에 대해서도 효소활성을 나타내지 않았다.

Abstract ▼

1. Based on the nucleotide sequence of the previously cloned rat liver sialyltransferase (ST3Gal Ⅲ), a cDNA (MB N1) encoding Galβ1,3(4)GlcNAc α 2,3-sialyltransferase has been isolated from mouse brain cDNA library. The cDNA sequence of 1,125 bp included an open reading frame (ORF)coding for MB ST3Ga

1. Based on the nucleotide sequence of the previously cloned rat liver sialyltransferase (ST3Gal Ⅲ), a cDNA (MB N1) encoding Galβ1,3(4)GlcNAc α 2,3-sialyltransferase has been isolated from mouse brain cDNA library. The cDNA sequence of 1,125 bp included an open reading frame (ORF)coding for MB ST3Gal Ⅲ consisting of 374 amino acids.2. Nucleotide and amino acid sequences of MB ST3Gal Ⅲ showed high homologies more than 98% and 99% with those of rat liver ST3Gal Ⅲ, respectively. The primary structure of MB ST3Gal Ⅲ suggested a putative domain structure, like that in other glycosyltransferases, consisting of a short NH₂-terminal cytoplasmic domain (8 amino acids), a signal-membrane anchor domain (20 amino acids) and a large COOH-terminal catalytic domain (346 amino acids) containing a proteolytically sensitive stem region.3. DNA clone encoding ST3Gal Ⅳ has been isolated from mouse brain cDNA libary by plaque hybridization using a probe (620 bp) produced by PCR with primers which were based on sequence information obtained from the conserved amino acid sequence of the previously cloned rat liver ST6Gal Ⅰ, porcine submaxillary gland ST3Gal Ⅰ and rat liver ST3Gal Ⅲ. The cDNA sequence of 1,002 bp included an open reading frame (ORF) coding for MB ST3Gal Ⅳ consisting of 333 amino acids.4. Amino acid sequence of MB ST3Gal Ⅳ showed about 90% homologies with those of ST3Gal Ⅳ (Galβ1,3GalNAc/Galβ1,4GlcNAc α2,3-sialyltransferase) from human placenta and human melanoma cells. The primary structure of MB ST3Gal Ⅳ suggested a putative domain structure, like that in other glycosyltransferases, consisting of a short NH₂-terminal cytoplasmic domain (8 amino acids), a signal-membrane anchor domain (18 amino acids) and a large COOH-terminal catalytic domain (307 amino acids) containing a proteolytically sensitive stem region.5. Northern blot analysis indicated that mRNA expression levels of MB ST3Gal Ⅲ and MB ST3Gal Ⅳ are tissue-specific; in the case of MB ST3Gal Ⅲ, it is prominent in brain, liver and heart, low level being found in kidney, while that in the other tissues was scarcely detectable. On the other hand, in the case of MB ST3Gal Ⅳ, it is the highest in liver, high level being found in submaxillary gland, heart and lung, while that in brain, placenta and kidney is low.6. Expression of COOH-terminal catalytic domain of MB ST3Gal Ⅲ in COS cells exhibited α 2,3-sialyltransferase activity only toward the disaccharide moiety of Galβ1,3GlcNAc and Galβ1,4GlcNAc of oligosaccharide, but showed a difference in acceptor substrate preference, i.e. lacto-N-tetraose, which is tetrasaccharide (Galβ1,3GlcNAcβ1,3Galβ1,4Glc) was much more suitable substrate than disaccharide, Galβ1,3GlcNAc, and Galβ1,4GlcNAc was a poor substrate as compared with other two ones. On the other hand, when COOH-terminal catalytic domain of MB ST3Gal Ⅳ was expressed in COS cells no sialyltransferase activity exhibited toward any substrates tested.

목차 Contents

• 제1장 서 론...11
• 제2장 실험재료 및 방법...14
• 1. PCR에 이용되는 Oligonucleotide의 제작...14
• 2. Total RNA의 조제...15
• 3. Poly (A) RNA의 조제...16
• 4. cDNA의 합성...16
• 5. Polymerase chain reaction (PCR)...17
• 6. PCR산물의 클로닝...18
• 7. DNA염기서열의 해석...19
• 8. cDNA library의 제작...19
• 9. PCR에 의한 cDNA library의 Screening...19
• 10. Nothern blot analysis...20
• 11. 시알산전이효소 유전자의 발현방법...21
• 12. 시알산전이효소의 효소활성 측정...22
• 제3장 결 과...24
• 1. Mouse brain ST3Gal Ⅲ(MBST3Gal Ⅲ)의 cDNA의 클로닝...24
• 2. MBST3Gal Ⅲ유전자의 염기서열과 아미노산서열의 1차구조의 해석...24
• 3. Mouse brain ST3Gal Ⅳ(MBST3Gal Ⅳ)의 Sialylmotif L의 탐색...25
• 4. MBST3Gal Ⅳ의 cDNA의 클로닝...26
• 5. MBST3Gal Ⅳ유전자의 염기서열과 아미노산서열의 1차구조의 해석...27
• 6. Northern blot 해석...27
• 7. MBST3Gal Ⅲ 와 MBST3Gal Ⅳ유전자의 COS cell에서의 발현...28
• 8. MBST3Gal Ⅲ 와 MBST3Gal Ⅳ의 효소활성의 기질특이성 해석...28
• 제4장 고 찰...30
• Abbrevuations...54
• 참고문헌...56