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문제 정의
- 따라서 위에서도 언급하였듯이 본 연구의 목표는 기존의 많은 연구가 멜라닌 생성억제에 맞추어져 있고 멜라닌의 분해에 관하여는 거의 연구되어 있지 않은 실정이다. 따라서 연구소에서 확보한 분해능을 지닌 진균류로부터, 멜라닌 분해효소를 분리하여 피부 미백 화장품 원료를 개발함이 목표이다.
- 멜라닌 분해시 효소의 반응에 미치는 온도의 영향은 멜라닌 분해 효소의 열 안정성을 확인하기 위한 실험을 진행하였다. 10배 농축한 배양 상등액을 melanin solution에 첨가하여 각각 20°C부터 60°C에서 반응시켰다.
- 멜라닌 분해활성에 미치는 Yeast extract의 영향을 알아보기 위하여 선별된 최적 제한배지에 yeast extract를 소량첨가하여 효소 활성을 높이고자 하였다. 10배 농축 후 분해 활성을 측정 한 결과 yeast extract를 0.
가설 설정
- 이로써 멜라닌 분해효소를 생산하는 진균류의 최적 배양온도는 24-26°C 사이의 중간값이 25°C로 정하였다';
제안 방법
- 0.1 M potassium phosphate buffei를 사용하여 fraction 별로 수집하였고, 이렇게 수집한 상등액을 fraction별로 멜라닌 분해 활성을 측정하였다. 멜라닌 분해 활성이 있는가 장 좋은 fraction을 수집하여 (NH^SQ를 이용하여 단백질을 침전시킨 후 소량의 potassium phosphate buffer0]] 녹인 후 Cell-Sep사의 T1 투석막을 이용하여 overnight하여 탈염 하였다.
- 4% 100 ppm Thamine-HCl Biotin 2 ml/L이었다. 10배 농축 후 멜라닌 분해 활성을 측정하였다.
- DMSO 10 ml + DMF 10 ml + mPEG5K-PLGA25K 0.015 g + 멜라닌분해효소, 2. DMSO 10 ml + DMF 10 ml + mPEG5K-PLGA25K 0.045 g + 멜라닌분해효소, Dialysis membrane에 넣고 투석을 통해 micelle formatioii을 진행하였다.
- 2D-gel을 이용한 pl 등 멜라닌 분해효소의 특성 분석을 하였다. 정제된 sample^ 대상으로 PROTEAN IEF Cell (BIO-RAD)을 이용하여 pl 값에 의한 단백질을 분리하여 멜라닌 분해 효소의 특성을 규명한 결과 멜라닌 분해효소들을 발견할 수 있었고, 이 중 한가지멜라닌 분해효소의 pl 값은 으扌 6.
- 확인하였다. 2번 sample에서 보여지는 바와 같이 멜라닌 분해효소의 활성을 확인하면서 염석에 의한 단백질을 회수하였다.
- 5는 3 N NaOH, 3 N HC1 을이 용하여 유지하였으며, 교반속도는 100 rpm이고, 온도는 25°C에서 배양하였다. 5 L fennentei에서 최적화 된 공정을 도입하여 main fermentation^] 시작된 시점으로부터 4일 (96 시간)이 지난 시점에서 20배로 농축한 멸균 배지 15 L를 500 L fermentei■예 dump 하여 진균류의 고농도 배양을 실시하였다.
- BIO-RAD사의 readystrip 7 cm를 이용하여 50 找 sample + 75 以 rehydration buffer를 첨가하여 기포가 들어가지 않도록 주의하고, strip이 마르지 않게 충분한 양의 미네랄오일로 덮어주고 passive rehydration 방법으로 20笆에서 12 시간동안 rehydration을 시켰다. Rehydration된 strip을 BIO- RAD사의 PROTEAN IEF Cell system을 이용하여 focusing 을 행하였다.
- 4로 평형화된 CM FF column을 이용하여 유속 3 ml/min에서 정제를 수행하였다. CM column에 흡착하지 않고 흘러나온 sample에 대하여 2nd DEAE chromatography 를 수행하였다. 다음으로 Ion exchange chromatography 중 2nd DEAE Column chromatography를 진행하였다.
- 4로 평형화된 HiPrep 16/10 DEAE FF colunm을 이용하여 유속 3 ml/miii에서 정제를 수행하였다. Elution buffer로 상기의 buffer0]] 0-0.3 M의 NaCl이 포함된 buffer를 농도구배 용출 buffer로 이용하였다, 0-0.3 M로 농도구배 용출하여 ABTS 산화 발색법으로 멜라닌 분해효소 활성을 측정하고 활성이 보인 faction을 수집하였다. 이렇게 얻어진 시료중의 염을 제거하기 위하여 Cell-Sep사의 T1 dialysis membrane MWCO 3, 500을 이용하여 0.
- 1% 첨가한 배지를 이용하여 여러 가지 온도에서 배양한 후 진균류의 성장을 비교하였다. Flask에서 배양 후 20, 000 xg에서 30분간 원심분리하여 균체를 회수한 후 진균류의 DCW (dry cell weight, 건조균체중량)를 측정하였다.
- 최적의 배지 조건을 선별하기 위해 균주를 여러 가지 복합배지로 배양한 후 멜라닌 분해활성을 비교하였다. Flask에서 배양 후 배양 상등액만을 취하여 10배 농축하여 melanin 분해 활성을 측정하였다.
- 멜라닌 분해활성을 측정하였다. Flask에서 배양 후 배양 상등액을 취하여 10배 농축한 후 melanin 분해 활성을 측정하였다.
- Main fermeirtation이 시작된 시점으로부터 96시간이 경과한 시점에서 20배로 농축한 멸균 배지를 5 L fermenter■에 dump하여 진균류의 고농도 배양을 실시하였고, 이때 산소공급의 효과를 알아보기 위하여 고농도 산소가스를 공급하여 배양하였다. 본 실험의 조건 및 위의 배지 조건들을 응용하여 500 L fermenter로의 Scale up 실험에 적용하였다.
- RNA prep kit 를 이용하여 파쇄된 cell에서 RNA를 얻었으며, RT-PCR kit 를 이용하여 cDNA를 합성한 후 이를 주형으로 하여 위에서 합성된 primer를 이용하여 PCR을 수행하였다. PCR의 조건은 1 X Pfu buffer, 0.2 卩M forward primer, 0.4 J1M Reverse primer, 0.2 mM dNTP, 1 成 RNA, 2.5 U Pfu를 전체 부피가 100 以가 되도록 혼합하였고, 94°C 5분, 25 cycles (94°C 1분, 50°C 1분, 72°C 2분), 72°C 5분으로 PCR을 수행하였다.
- 액체질소를 이용하여 파쇄하였다. RNA prep kit 를 이용하여 파쇄된 cell에서 RNA를 얻었으며, RT-PCR kit 를 이용하여 cDNA를 합성한 후 이를 주형으로 하여 위에서 합성된 primer를 이용하여 PCR을 수행하였다. PCR의 조건은 1 X Pfu buffer, 0.
- rehydration을 시켰다. Rehydration된 strip을 BIO- RAD사의 PROTEAN IEF Cell system을 이용하여 focusing 을 행하였다.
- Standard melanin의 종류에 따른 탈색율 비교해 본 결과 멜라닌의 탈색율을 측정하기 위한 표준물질을 결정하기 위하여 sepia melanin과 synthetic melanin-^- 기질로 하여 탈색율을 확인하였다. 두 가지 멜라닌에 대한 분해 효소의 분해 활성의 차이는 거의 없는 것으로 확인되었으며 실험에서의 표준물질은 synthetic melanin을 이용하였다.
- melan血농도를 달리하여 멜라닌 분해활성 측정 결과는 효소의 양을 고정하고 melan血의 농도를 변화시켜 탈색율을 측정하였다. melaniii의 농도 10 ppm에서 200 ppm으로 높아질수록 탈색율이 증가하였다.
- pBluescript II KS+벡터의 Sma I 제한효소를 처리하여 PCR 산물을 클로닝하였다.
- 1% 첨가한 배지를 이용하였다. pH control을 위하여 5 L fermenter에서 배양 후 배양액을 취하여 건조균체중량 (DCW)을 측정하였다,
- 4로 4°C cold chamber에서 교반 하면서 buffer를 2회 교환하여 주면서 overnight 탈염하였다. 그 후 Molecular weight cut-off membrane를 진행하였다. 탈염후 얻어진 멜라닌 분해 활성이 있는 sample을 VIVA science사의 원심형 membrane 농축기를 이용하여 3000 xg 에서 원심분리하여 농축 및 molecular weight cut-off를 수행하였다.
- 농축의 목적으로 원심분리하여 취한 상등액을 10, 000 molecular weight cut-off membrane을 이용하여 10배 농축하였다. 그 후 멜라닌 분해효소 정제를 위하여 Amersham bioscience사의 Sephadex G-50을 충진한 column (5 x 50 cm)을 이용하여 유속 4 5ml/h로 4°C 에서 gel filtration 사iromatography를 수행하였다. 첫 번째 단계인 gel filtration chromatography의 buffei■로는 0.
- 이렇게 수집한 fraction별로 ABTS 산화 발색법에 의해 멜라닌 분해효소의 활성을 측정하였고, 멜라닌 분해 활성이 있는 Ection 을 모두 수집하였다. 그 후 염석에의 한단 백질의 회수를 하였는데 gel filtration chromatography에서 멜라닌 분해활성이 확인된 sample을 수집하여 4°C cold chambeT에서 최종 포화 농도가 45% (27.7 g/100 ml)가 되게 Ammonium sulfate ((NHQ2SO4)를 막자사발로 곱게 분쇄시켜 Ammonium sulfate를 30분간 천천히 가하고 천천히 교반을 하면서 염석을 행하였다. 이후 1시간 동안 천천히교반하여 단백질을 침전 시킨 후 4°C 20, 000 xg에서 30분간 원심분리 하여 침전된 단백질을 제거하고 상등액을 취하여 최종 포화농도가 65%가 되게 Ammonium sulfate를 13.
- 1 M potassium phosphate buffer, pH 74로 4 °C cold chamber에서 교반 하면서 buffer를 2회 교환하여 주면서 overnight 탈염하였다. 그리고 Ion exchange chromatography를 진행하였는데 1st DEAE C 이umn chromatography 는 0.1 M potassium phosphate buffer, pH 7.4로 평형화된 HiPrep 16/10 DEAE FF column을 이용하여 유속 3 nd/min에서 정제를 수행하였다. Elution buffer로 상기의 buffer에 0.
- CM column에 흡착하지 않고 흘러나온 sample에 대하여 2nd DEAE chromatography 를 수행하였다. 다음으로 Ion exchange chromatography 중 2nd DEAE Column chromatography를 진행하였다. 0.
- 탈염후 얻어진 멜라닌 분해 활성이 있는 sample을 VIVA science사의 원심형 membrane 농축기를 이용하여 3000 xg 에서 원심분리하여 농축 및 molecular weight cut-off를 수행하였다. 다음으로 Ion exchange chromatography를 진행하였는데 CM Column chromatography를 이용하여 HiPrep 16/10 CM Column chromatography - 0.1 M potassium phosphate buffer, pH 7.4로 평형화된 CM FF column을 이용하여 유속 3 ml/min에서 정제를 수행하였다. CM column에 흡착하지 않고 흘러나온 sample에 대하여 2nd DEAE chromatography 를 수행하였다.
- 단백질 sequence에 의한 degenerate 프라이머 합성 및 유전자 확보는 정제된 멜라닌 분해 효소의 전체적인 단백질 및 유전자 서열을 분석하기 위하여 12% SDS-PAGE를 이용하여 단백질을 크기에 의해 분리한 후 Hoffei사의 탱크식 transfer system을 이용하여 PVDF membrane에 단백질을 transfer하였다, Acetic acid 가 포함되지 않은 coomassie brilliant blue (CBB) 염색을 실시하였고, Acetic acid가 포함되지 않은 50% methanol 용액으로 탈색한 후에 염색된 단백질 밴드를 잘라 분석을 의뢰하였다. 한국기초과학지원연구원에서 단백질의 N-terminal 서열 분석을 하였으며, SRFQSLLTFI의 결과를 얻을 수 있었다.
- 단백질 sequence에 의한 degenerate 프라이머 합성 및 유전자 확보는 한국기초과학지원연구원에서 단백질의 N- terminal 서열 분석의 결과를 토대로 하여 degenerate primer 를 합성하였으며, 합성한 primer의 서열은 Table 1에 나타내었다.
- 단위배양 부피당 균체의 생산량을 늘리는 것에 초점을 두고 batch 방법으로 배양할 경우 단위 배양액 당 멜라닌 분해효소가 최대 활성을 보이고 균체의 농도 또한 최대값을 갖는 120시간을 최적의 배양 시간으로 구하였다.
- 1 M potassium phosphate buffei를 사용하여 fraction 별로 수집하였고, 이렇게 수집한 상등액을 fraction별로 멜라닌 분해 활성을 측정하였다. 멜라닌 분해 활성이 있는가 장 좋은 fraction을 수집하여 (NH^SQ를 이용하여 단백질을 침전시킨 후 소량의 potassium phosphate buffer0]] 녹인 후 Cell-Sep사의 T1 투석막을 이용하여 overnight하여 탈염 하였다.
- 가장 안정함을 확인하였다. 멜라닌 분해 효소의 characterizatioii은 2D-gel을 이용하여 멜라닌 분해효소 중한 가지 효소의 pl값이 으* 6.5이고 Molecular weight는 으扌 54-57 kDa임을 알 수 있었고, 정제된 멜라닌 분해 효소의 전체적인 단백질 및 유전자 서열을 분석하여 degenerate primei■를 합성하였으며, RT-PCR 법을 이용하여 유전자를 확보하였다. 멜라닌 분해효소 생산을 위한 진균류의 배양 방법 확립은 멜라닌 분해효소가 최대 활성을 갖는 배지 조건은 ammonium tartrate 0.
- 멜라닌 분해효소를 효율적으로 피부로 전달시키기 위하여 50-100 nm 크기로 encapsulation을 실시하였다.
- 멜라닌 분해효소의 분리는 멜라닌 분해효소 정제를 위하여 Amersham bioscience사의 Sephadex G-50을 충진한 column을 이용하여 gel filtration chromatography를 수행하였다. 0.
- 멜라닌 분해효소의 유전자를 얻기 위해 진균류를 배양, 수거하고 액체질소를 이용하여 파쇄하였다. RNA prep kit 를 이용하여 파쇄된 cell에서 RNA를 얻었으며, RT-PCR kit 를 이용하여 cDNA를 합성한 후 이를 주형으로 하여 위에서 합성된 primer를 이용하여 PCR을 수행하였다.
- 멜라닌 분해효소의 활성에 미치는 배양시간의 영향은 배양 시간에 따른 멜라닌 분해효소의 멜라닌 분해 활성에 대하여 알아보기 위하여 배양시간을 48-168시간동안 배양하여 멜라닌 분해활성을 측정하였다. Flask에서 배양 후 배양 상등액을 취하여 10배 농축한 후 melanin 분해 활성을 측정하였다.
- 멜라닌 분해효소의 활성에 미치는 배지종류의 영향을 알아보기 위하여 제한배지를 이용하였다. 멜라닌 분해효소의 활성 및 정제 수율을 높이기 위하여 제한배지를 이용하여 균사체를 배양하였다.
- 멜라닌 분해효소의 활성에 미치는 배지종류의 영향을 알아보기 위해 복합배지를 이용하였다. 최적의 배지 조건을 선별하기 위해 균주를 여러 가지 복합배지로 배양한 후 멜라닌 분해활성을 비교하였다.
- 멜라닌 분해효소의 효과적인 분리를 위한 분해능 테스트는 진균류 균사체의 배양시 균사체 세포내에 존재하는 효소와 배양 상등액에 존재하는 효소의 멜라닌 분해능을 확인하였다
- 반응 pH에 대한 영향은 멜라닌 분해효소의 pH의 안정성을 실험하고자 melanin solution의 pH를 5〜9로 바꾸어 효소의 활성을 측정하였다.
- 건조균체중량을 비교하였다. 배지의 조성은 질소 원과 탄소 원은 ammonium tartrate 0.4%: glucose 2% 사용하였고, 미 량원소 (KH2PO4 0.1%, MgSO4 - 7H2O 0.05%, CaCl2 - 2H2O 0.01%, FeSO4 . 7H2O 0.01%, CuSO4 . 5H2O 0.002%, ZnSO4 . 7H2O 0.001%, MnSO4 . 4H2O 0.001%, 2, 2, -Dimethylsuccinate 0.4% 100 ppm Thamine-HCl Biotin 2 ml/L) 를 첨가하고 여기에 yeast extract를 0.1% 첨가한 배지를 이용하였다. pH control을 위하여 5 L fermenter에서 배양 후 배양액을 취하여 건조균체중량 (DCW)을 측정하였다,
- 배지의 조성은 질소원과 탄소원은 ammonium tartrate 0.4%: glucose 2% 사용하였고, 미량원소 (KH2PO4 0.1%, MgSO4 - 7H2O 0.05%, CaCl2 - 2H2O 0.01%, FeSO4 - 7H2O 0.01%, CuSO4 - 5H2O 0, 002%, ZnSO4 - 7H2O 0.001%, MnSO4 . 4H2O 0.001%, 2, 2, -Dimethylsuccinate 0.4% 100 ppm Thamine-HCl Biotin 2 ml/L) 를 첨가하고 여기에 yeast extract를 0.1%첨가한 배지를 5 L fermenter에 적용하여 멜라닌 분해효소의 활성을 보고자 하였다. 최적배지를 working volume 3 L로 배양하였으며, 플라스크에서 5일간 배양 후 seed접종하였다.
- 500 L fermentei■의 배양은 (주)대덕바이오 (장버]: ko biotech, 500 L)에서 실험을 하였으며 기본적인 배지조건 및 배양조건은 5 L fermemter 배양을 통해 최적화된 data를 사용하여 진행하였다. 배지의 조성은 질소원과 탄소원은 ammonium tartrate 0.4%: glucose 2% 사용하였고, 미량원소 (KH2PO4 0.1%, MgSO4 - 7H2O 0.05%, CaCl2 - 2H2O 0.01%, FeSO4 - 7H2O 0.01%, CuSO4 - 5H2O 0.002%, ZnSO4 - 7H2O 0.001%, M11SO4 - 4H2O 0.001%, 2, 2, -Dimethylsuccinate 0.4% 100 ppm Thamine-HCl Biotin 2 ml/L) 를 첨가하고 여기에 yeast extract# 0.1% 첨가한 배지를 500 L fennenter에 적용하여 멜라닌 분해효소의 대량 생산을 도모하고자 하였다. 최적 배지로 working volume 300 L로 배양하였으며, 50 L fermeirter에서 working volume 30 L로 5일간 배양 후 seed 접종하였다.
- 배지로 배양하였다. 배지의 조성은 질소원과 탄소원은 ammonium tartrate 0.4%: glucose 2% 사용하였고, 미량원소 (KH2PO4 0.1%, MgSO4.7H2O 0.05%, CaCl2 - 2H2O 0.01%, FeSO4 . 7H2O 0.01%, CuSO4 . 5H2O 0.002%, ZnSO4 - 7H2O 0.001%, M11SO4 . 4H2O 0.001%, 2, 2, -Dimethylsuccinate 0.4% 100 ppm Thamine-HCl Biotin 2 ml/L)를 첨가하고 여기에 yeast extract# 0.1% 첨가한 배지를 이용하여 여러 가지 온도에서 배양한 후 진균류의 성장을 비교하였다. Flask에서 배양 후 20, 000 xg에서 30분간 원심분리하여 균체를 회수한 후 진균류의 DCW (dry cell weight, 건조균체중량)를 측정하였다.
- 멜라닌 분해효소의 활성 및 정제 수율을 높이기 위하여 제한배지를 이용하여 균사체를 배양하였다. 여러 가지 조건 중 질소원 & 탄소 원의 비율을 바꾸어 배지 최적화를 하였으며, 질소원으로는 ammonium tartrate를, 탄소원으로는 glucose를 사용하였다. 공통적으로 첨가해준 미 량원소들은 KH2PO4 0.
- 위의 조건으로 IPG strip을 이용하여 pl값의 차이에 의한 단백질의 1차원 분리를 끝낸 후에 12% SDS-PAGE를 이용하여 단백질 크기에 의한 2차원 분리를 실시하였다,
- 4를 사용하여 fraction 별로 수집하였다. 이렇게 수집한 fraction별로 ABTS 산화 발색법에 의해 멜라닌 분해효소의 활성을 측정하였고, 멜라닌 분해 활성이 있는 Ection 을 모두 수집하였다. 그 후 염석에의 한단 백질의 회수를 하였는데 gel filtration chromatography에서 멜라닌 분해활성이 확인된 sample을 수집하여 4°C cold chambeT에서 최종 포화 농도가 45% (27.
- 3 M로 농도구배 용출하여 ABTS 산화 발색법으로 멜라닌 분해효소 활성을 측정하고 활성이 보인 faction을 수집하였다. 이렇게 얻어진 시료중의 염을 제거하기 위하여 Cell-Sep사의 T1 dialysis membrane MWCO 3, 500을 이용하여 0.1 M potassium phosphate, pH 7.4 로 4 °C cold chamber에서 교반하면서 buffei를 2회 교환하여 주면서 overnight 탈염하였다,
- 분해 활성이 3〜5배 더 좋음을 확인하였다. 이를 재확인 하고자 샘플을 동결 건조하여 10배 농축한 후 탈색 정도를 더 높여 테스트하였다. 이 결과도 균사체 파쇄의 경우보다 배양 상등액에서 약 5배 높은 탈색율을 보였다.
- 7 g/100 ml)가 되게 Ammonium sulfate ((NHQ2SO4)를 막자사발로 곱게 분쇄시켜 Ammonium sulfate를 30분간 천천히 가하고 천천히 교반을 하면서 염석을 행하였다. 이후 1시간 동안 천천히교반하여 단백질을 침전 시킨 후 4°C 20, 000 xg에서 30분간 원심분리 하여 침전된 단백질을 제거하고 상등액을 취하여 최종 포화농도가 65%가 되게 Ammonium sulfate를 13.4 g/100 ml의 비율로 30분간 천천히 첨가하였다. 이후 1 시간 동안 천천히 교반하여 단백질을 침전시킨 후 4°C 20, 000 xg에서 30분간 원심분리 하여 침전된 단백질을 수거하였다.
- 정제된 sample을 대상으로 PROTEAN IEF Cell (BIO-RAD) 을 이용하여 pl 값에 의한 단백질을 분리하여 멜라닌 분해효소의 특성을 규명하였다.
- 진균류의 성장에 미치는 배양배지의 pH 영향에 대하여 알아보기 위하여 균사체를 여러 가지 pH에서 배양한 후 진균류의 건조균체중량을 비교하였다. 배지의 조성은 질소 원과 탄소 원은 ammonium tartrate 0.
- 위해 복합배지를 이용하였다. 최적의 배지 조건을 선별하기 위해 균주를 여러 가지 복합배지로 배양한 후 멜라닌 분해활성을 비교하였다. Flask에서 배양 후 배양 상등액만을 취하여 10배 농축하여 melanin 분해 활성을 측정하였다.
- 그 후 Molecular weight cut-off membrane를 진행하였다. 탈염후 얻어진 멜라닌 분해 활성이 있는 sample을 VIVA science사의 원심형 membrane 농축기를 이용하여 3000 xg 에서 원심분리하여 농축 및 molecular weight cut-off를 수행하였다. 다음으로 Ion exchange chromatography를 진행하였는데 CM Column chromatography를 이용하여 HiPrep 16/10 CM Column chromatography - 0.
- 한국기초과학지원연구원에서 단백질의 N-terminal 서열 분석을 하였으며, SRFQSLLTFI의 결과를 얻을 수 있었다.
- 확인돤 멜라닌 분해효소의 sequence 확보를 위하여 클로닝 된 벡터를 T7 primer binding site 와 KS primer binding site의 unverisal primer를 이용하여 유전자 서열을 분석하였으며, 이 결과로 단백질의 서열을 알 수 있었다. 분석된 유전자 서열과 단백질 서열을 Table 2, 3에 나타내었다.
대상 데이터
- 멜라닌 분해효소의 Solubility test 및 Micelle Formation 결과 Size (PCS)는 1. 70 nm, 2. 100 nm를 측정하였다. 이러한 실험으로 현재 70-100 nm size의 멜라닌 분해효소 encaps血tion된 bead를 얻을 수 있었다.
- 다음으로는 500 L fennenter 실험을 진행하였다. 500 L fermentei■의 배양은 (주)대덕바이오 (장버]: ko biotech, 500 L)에서 실험을 하였으며 기본적인 배지조건 및 배양조건은 5 L fermemter 배양을 통해 최적화된 data를 사용하여 진행하였다. 배지의 조성은 질소원과 탄소원은 ammonium tartrate 0.
- 확인하였다. 두 가지 멜라닌에 대한 분해 효소의 분해 활성의 차이는 거의 없는 것으로 확인되었으며 실험에서의 표준물질은 synthetic melanin을 이용하였다.
이론/모형
- MC나 DMSO에 녹였을 때도 불순물이 많이 보였다. MC와 DMSO에 녹으므로 유화 확산법과 micelle formatioii을 이용해서 Encapsulation 진행하였다. 유화확산법은 1%의 mPEG5K-PLGA2K 20 ml을 water phase 로 사용하고 PLGA 0.
성능/효과
- 효소 활성을 높이고자 하였다. 10배 농축 후 분해 활성을 측정 한 결과 yeast extract를 0.1%첨가한 배양검]] 지의 경우가 첨가하지 않은 배지보다 약 280%의 활성 증가를 보였고, malt extract 30 g/L 배지 (상기 M배지) 에서배양한 것에 비해 활성이 약 150% 높았다.
- 24-26°C에서는 진균류의 DCW가 차이가 거의 없음을 확인하였으며 24°C 이하에서 배양하거나 26°C 이상에서 배양한 경우에는 24~26°C에서 배양한 경우에 비해 진균류 의성장이 늦어지는 것을 확인할 수 있었다.
- 멜라닌 분해능을 확인하기 위하여 탈색율을 비교하였을 때 균사체를 파쇄 하여 얻은 효소에 비해 상등액의 멜라닌 분해 활성이 3〜5배 더 좋음을 확인하였다. 이를 재확인 하고자 샘플을 동결 건조하여 10배 농축한 후 탈색 정도를 더 높여 테스트하였다.
- 멜라닌 분해시 효소의 반응에 미치는 온도의 영향은 멜라닌 분해효소는 30°C에서 가장 안정하였고, 40°C 이상부터는 분해능이 감소하기 시작하여 60°C에서는 30°C에서반응시킨 경우의 15% 수준까지 급격하게 감소함을 확인하였다. 이 결과로 진균류 배양을 통하여 상등액으로부터 분리된 멜라닌 분해효소는 열에 약함을 알 수 있다.
- 5이고 Molecular weight는 으扌 54-57 kDa임을 알 수 있었고, 정제된 멜라닌 분해 효소의 전체적인 단백질 및 유전자 서열을 분석하여 degenerate primei■를 합성하였으며, RT-PCR 법을 이용하여 유전자를 확보하였다. 멜라닌 분해효소 생산을 위한 진균류의 배양 방법 확립은 멜라닌 분해효소가 최대 활성을 갖는 배지 조건은 ammonium tartrate 0.4% : glucose 2% 배지에 yeast extract# 0.1%를 첨가한 배지임을 확인하였고, 진균류의 최적 배양온도는 24-26C였으며, 이 때 건조 균체 중량으로 약 6 g/L의 균체를 얻을 수 있었다. 또한 진균류 성장의 최적 pH는 약 5.
- 멜라닌 분해효소의 유전자 획득을 위한 PCR 산물을 1% agarose gel에 전기영동 결과 유전자를 획득할 수 있었다,
- 멜라닌 분해효소의 활성에 미치는 배양시간의 영향은 48-120시간 동안의 배양에는 멜라닌 분해활성이 균체의 DCW (dry cell weight, 건조균체중량)에 비례하게 증가하여 cell의 농도에 비례하게 활성이 보였으나 120시간 이후에는 오히려 단위 DCW대 멜라닌 분해 활성의 비가 감소함을 알 수 있었다. 멜라닌 분해효소의 활성에 미치는 최적의 배양 시간의 영향을 실험한 결과 단위 배양액의 멜라닌 분해 활성은 120시간에서 멜라닌 분해활성이 가장 좋은 것으로 나타났다.
- 멜라닌 분해효소의 활성에 미치는 배지종류 중 복합 배지 영향에 대한 실험 결과 복합배지 중 malt extract 3% 배지 (M 배지)에서 분해효소활성이 가장 좋은 것으로 나타났다.
- 멜라닌 분해효소의 활성에 미치는 배지종류 중 제한 배지 영향에 대한 실험 결과 ammonium tartrate 0.4% : glucose 2%에서 가장 분해 활성이 높았고 malt extract 30 g/L에서 배양한 것에 비해 약 60%의 활성을 보였다.
- 수 있었다. 멜라닌 분해효소의 활성에 미치는 최적의 배양 시간의 영향을 실험한 결과 단위 배양액의 멜라닌 분해 활성은 120시간에서 멜라닌 분해활성이 가장 좋은 것으로 나타났다. 120시간에서는 건조균체농도가 최대값인 6 g/L을 나타내었고, 이때 효소의 활성 또한 최대값을 나타내었다.
- 26笆에서 배양한 경우에는 24°C에서 배양한 경우와 거의 비슷한 경향을 보였다. 반면 20°C에서 배양한 경우는 4.7 g/L의 건조 균체 중량을 보이며 24-26C에서 보인 최대 건조 균체 중량의 약 78% 수준이었고, 3(TC에서 배양한 경우는 약 4 g/L의 건조 균체 중량을 보이며 24-26C 에서 보인 최대 건조 균체 중량의 약 67% 수준이었다.
- 이 결과 배양 배지의 pH가 5.0 ~ 55의 경우에서 배양한 경우 진균류 성장에 최적의 배양조건임을 확인할 수 있었다.
- 이 결과로 진균류 배양을 통하여 상등액으로부터 분리된 멜라닌 분해효소는 열에 약함을 알 수 있다.
- 6 g/L였다. 정제공정은 최적화를 통하여 멜라닌 분해효소의 정제 순도 90% 이상의 정제공정을 확립하였다. Scale-up은 5 L fermenter> 이용한 기초 배양공정을 확립하여 500 L fermenter로의 경제성 있는 scale up에 성공하였고, 이 때 건조 균체 중량 약 14.
- 정제된 sample^ 대상으로 PROTEAN IEF Cell (BIO-RAD)을 이용하여 pl 값에 의한 단백질을 분리하여 멜라닌 분해 효소의 특성을 규명한 결과 멜라닌 분해효소들을 발견할 수 있었고, 이 중 한가지멜라닌 분해효소의 pl 값은 으扌 6.5 어고 Molecular weight 은 으¥ 54-57 kDa 임을 확인할 수 있었다.
- 정제된 멜라닌 분해효소를 이용하여 멜라닌 분해속도를 측정한 결과 최대 7 mg/h의 속도로 멜라닌이 분해됨을 알 수 있었다.
- 진균류 추출물로부터 신규 멜라닌 분해효소의 분리 및 분해능 test는 멜라닌 분해효소의 균사체 배양 상등액으로 분비 생산됨을 분해능 테스트를 통하여 확인하였고, 이 분해효소에 의한 멜라닌 분해반응은 pH 7에서 가장 높고, 30°C 에서 가장 안정함을 확인하였다. 멜라닌 분해 효소의 characterizatioii은 2D-gel을 이용하여 멜라닌 분해효소 중한 가지 효소의 pl값이 으* 6.
후속연구
- 첫째는 멜라닌 생성의 원인이 되는 자외선을 차단하는 물질을 미용용품에 첨가하는 것이다. 둘째는 멜라닌의 생합성을 차단하는 것으로, 멜라닌의 합성에 가장 중요한 역할을 하는 tyrosinase의 활성을 저해하는 물질을 개발하는 방향으로 연구가 집중된다. 하지만 tyrosinase 저해제들의 문제점으로는, 멜라닌 생성 억제 작용 외어〕, 원하지 않는 심각한 부작용들을 유발하는 것임.
- 본 연구는 tyrosinase 저해제가 갖는 부작용이 없어 생체친화적 물질에 의한 부작용 감소 효과가 기대되며, 독자적 기술에 의한 고부가 미백용 화장품 원료 확보로 새로운 기능에 의한 신규시장 창출이 가능하여 미백용 기능성 화장품 원료로서 고부가 화장품에 사용되어 수입대체효과 및 기업의 매출증대 효과가 있을 것으로 기대되어진다.
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