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문제 정의
- 선행연구에서 melanoston을 배양액에 첨가하였을 경우 tyrosinase 활성이 감소하였으나 배양 후 세포파쇄액에 직접 첨가한 경우에는 tyrosinase 활성에 대한 저해를 나타내지 않는 것으로 나타났다. 따라서 melanostori 은 tyrosinase의 저해제가 아닐 것으로 판단되므로 mel- anoston에 의한 멜라닌 생성 억제는 tyrosinase 관련 효소들의 발현량 감소에 의한 것인지를 확인하고자 하였다. 먼저 tyrosinase의 mRNA 발현양을 측정하기 위하여 PCR-ELISA법으로 4회 반복 실험하여 얻은 결과는 Figure 1과 같다.
- 물질들은 피부 알러지나 독성을 나타내기도 하고, 쉽게 분해되어 안정성이 떨어지는 등 화장품 원료로서의 사용이 어려운 점이 있어 새로운 미백물질의 개발이 필요하다고 할 수 있다. 본 연구에서는 효모에서 분리한 멜라닌 생성 억제물질인 melanoston의 작용 기전을 밝히기 위한 것이다. Melanoston의 작용기전으로는 tyro- sinase의 발현 억제, glycosylation 억제, melanosome 표면에서 tyrosinase 활성화 억제, 생성멜라닌 분비 억제 등을 생각할 수 있으나 본 연구에서는 B16 melanoma 세포를 이용하여 주로 tyrosinase 발현과 활성화 및 세포 형태변화를 중점적으로 조사하였으며 그 결과 melanoston 이 B16 세포의 형태 변화와 tyrosinase 활성화를 억제 하는 것으로 나타났다.
제안 방법
- Nitrocellulose membrane을 blocking solution [PBS-T with 5% skim milk]으로 실온에서 1 h 반응시켰다. Primary antibodye mouse tyrosinase와 TRP-1, human DCT의 polyclonal antibody (from rabbit) 인 각각 <rPEP7, qPEPI, 그리고 "PEP8h를 이용하였다, Membrane을 blocking solution0!] 1:1000이 되게 희석한 각각의 primary antibody와 실온에서 2 h 반응을 실시하였다. PBS-T로 15 min씩 4회 수세하였고, anti-rabbit HRP-conjugated secondary antibody를 blocking sol'n에 1: 2000로 희석 하여 1 h 반응시켰다.
- 그 후 Anti-digoxygenin AP-conjugated antibody (Sigma)를 PBS—B에 1: 3000으로 희석시켜 첨가한 후 37℃에서 1 h 동안 반응시켰다. 1 M diethanolamine buffer에 녹인 0.1% pNPP로서 상온에서 30 min간 방치하고 405 nm에서 ELISA reader를 사용하여 optical density를 측정하였다. PCR method 2의 경우에는 denaturinge hybridization의 과정을 없애고 직접 anti-digoxygenin AP—conjugated antibody를 처리하였으며 그의 방법과 그 뒤 과정은 위에서 실행한 PCR method와 동일하였다.
- 45 Schleicher & Schuell)을 사용하여 electrotransfer (50 mA for ovemight)하였다. Electro- transfer가 끝나면 blotting하기에 앞서 Ponceau S를 사용하여 transfer가 올바르게 되었는지 확인하였다. Nitrocellulose membrane을 blocking solution [PBS-T with 5% skim milk]으로 실온에서 1 h 반응시켰다.
- Melanogenesis에 관여하는 효소인 tyrosinase, TRP-1, DCT 등의 mRNA level에서 melanoston에 의한 변화를 알아보기 위하여 RT-PCR을 수행하였다.
- Primary antibodye mouse tyrosinase와 TRP-1, human DCT의 polyclonal antibody (from rabbit) 인 각각 <rPEP7, qPEPI, 그리고 "PEP8h를 이용하였다, Membrane을 blocking solution0!] 1:1000이 되게 희석한 각각의 primary antibody와 실온에서 2 h 반응을 실시하였다. PBS-T로 15 min씩 4회 수세하였고, anti-rabbit HRP-conjugated secondary antibody를 blocking sol'n에 1: 2000로 희석 하여 1 h 반응시켰다. 반응이 끝나 후 PBS-T로 20 min씩 4회 수세하였다.
- PCR 조건은 denaturation: 95℃ 50 s, annealing- [tyrosinase와 TRP-1: 56℃, TRP-2: 64℃] 20 s, extension: 72℃ 20 s 로 총 30 cycle을 실행하였다. PCR products는 1.5% agarose geis에서 전기영동을 실시한 후 ethidium bromide (Et-Br) staining을 하여 UV illuminator (Vilber Loumart, France)로 확인하였다. RNA의 integrity는 mouse /^-actin mRNA에 대한 primer를 이용하여 확인하였다[10-11].
- USA), 100 pM oligo~dTi6가 되도록 혼합하고 총 volume 50 μL로 조정한 후 PCR system 2400 (Perkin Elmer, USA) 을 이용하여 extension: 37 ℃ 60 min, denaturation: 95 ℃ 5 min을 실행하였다. PCRe cDNA 2 juL, 1 x amplification buffer, 0.2 mM dNTP, 1 unit의 super-therm DNA polymerase (Hoffmann-La-Roche, Canada), oligonucleotides를 각각 1 μL, 총 volume 50 μL로 조정하여 실험하였다. PCR 조건은 denaturation: 95℃ 50 s, annealing- [tyrosinase와 TRP-1: 56℃, TRP-2: 64℃] 20 s, extension: 72℃ 20 s 로 총 30 cycle을 실행하였다.
- PCR에서 증폭된 cDNA 양을 정량하기 위하여 PCR- ELISA라는 방법을 개발하여 사용하였다. 이 방법은 증폭 시 5, biotinylated primers과 digoxygenin-11 -dUTP<동시에 사용하여 PCR products# 합성하였고 곧바로 항체만을 이용해서 defection하는 방법이다.
- DEPC 처리 75% ethan이로 수세를 한 다음 nuclease-free water에 peller을 녹였다. RNA의 순도와 정량은 Hitachi U-2000 Spectrophotometer (Tokyo, Japan)# 사용하여 AWAgso ratio로서 확인하였다.
- 또한 편으로 actin filament들이 재구성되면서 세포골격(cyto- 아;eleton)이 변화하게 되고 결국 세포 형태가 dendrite가, 많은 수지상세포로 변하여 생성된 멜라닌의 방출을 용이하게 한다(Figure 3). q-MSH와 달리 세포 골격 단백질의 형성에 영향을 주는 phosphatidylinositol-3 kinase (PI3~K)의 저해제인 LY와 Rho kinase의 저해제인 Y가 멜라닌 합성을 유도한다는 보고에 따라 B16 배양액에 LY 혹은 Y를 첨가한 후 tyrosinase mRNA와 효소 활성을 측정하여 보았다(Figure 4-5). LY와 Y 둘 다 B16 세포의 tyrosinase mRNA 발현에는 별다른 영향을 주지 않았으며 여기에 melanostori을 첨가하면 약 10% 정도의 발현 억제 현상을 보였다.
- 이상의 실험 결과를 종합하여 보면 B16 배양액에 melanoston을 2(1) ㎍/mL 농도로 처리할 경우 10-20% 내외의 유전자 및 단백질 발현 억제 효과가 있음을 확인할 수 있었다. 그러나 이러한 적은 양의 유전자 발현 억제가 melanin 생성을 70% 이상 억제한다고 보기 어려운 점이 있어 다음 실험을 진행하였다.
- Tyrosinase 활성은 DOPA oxidase 활성을 측정한 것으로 나타내었다. 멜라닌 함량 측정 실험과 같은 방법으로 세포를 배양한 후 trypsin으로 세포를 떼어내고 원심분리를 실시하였다. 회수한 세포를 PBS로 2회수세, 원심분리 하였다.
- 세포 형태의 변화를 관찰하기 위하여 25T-flask에 5 x 104이 되게 세포를 plating하고 24 h이 경과된 후mel- anoston와 arbutin이 첨가된 배지로 교환하여 48 h 배양하였다. 배양이 끝나면 배지를 제거하고 PBS로 2회 수세한 후 현미경으로 관찰하였다[12].형광현미경 관찰을 위해서는 다음과 같이 처리하였다.
- 위에서 설명한 대로melanoston이 B16 세포의 분화를 억제하여 tyrosinase가 melanosome으로 이동하는 과정을 억제하거나 melanosome 표면에 위치한 tyrosinase 활성화(activation) 과정을 억제하고 따라서 melanin 합성을 억제하게 된다는 가설을 좀 더 구체적으로 증명해 보이기 위하여 a-MSH를 처리한 세포와 a-MSH 및 mel- anoston을 동시에 처리한 세포에서 형광현미 경을 이용하여 세포 내 tyrosinase 발현 분포의 변화를 조사하였다. 그 결과 Figure 7에서와 같이 a-MSH를 처리하지 않은 B16 세포는 tyrosinase staining시, 비교적 핵주위로 tyrosinase 가 관찰되었으며 cytosol과 세포막 부근에서는 관찰되지 않았다 (A).
- 위의 실험에서melanoston0] 세포 분화와 관련된 효소들을 억제함으로서 멜라닌 합성을 저해하는 것으로 나타났으므로 melanoston이 이러한 분화 과정에 어떠한 영향을 미치는지 보기 위해 B16을 24 h 동안 배양한 뒤 저해제가 첨가된 배지로 교환하여 48 h 동안 배양한 후 세포 형태를 관찰하였다. Control과 100 nM의 a-MSH, 그리고 저해제인 arbutin 과 melanoston 을 136 mg/mL 가 되도록 첨가한 네 가지경우의 세포 형태를 Figure 6에 나타내었다.
- 멜라닌 함량 측정 실험과 같은 방법으로 세포를 배양한 후 trypsin으로 세포를 떼어내고 원심분리를 실시하였다. 회수한 세포를 PBS로 2회수세, 원심분리 하였다. 상층액을 제거한 후 single detergent lysis buffer [50 mM Tris - CKpH 8.
대상 데이터
- Melanostone 유산균 추출물로서 조정제 과정을 거친 후 (주)참존생물소재연구소로부터 제공받았으며 6Z-MSH, arbutin, LY, Y, L-3T4_dihydroxyphenylalanin (DOPA), synthetic melanin, sodium azide, sodium dodecyl sulfate (SDS), phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF), aprotinin, Nonidet P-40 (NP-40), -nitrophenyl- a-ghicopyrano- side (PNPG), isopropanol, DMSO, NaOH, HC1 등은 Sigma (USA) 제품을 사용하였다.
- Mouse tyrosinase 와 TRPT 의 carboxy terminus 로 합성한 polyclonal antitybody “PEP7과, aPEPl 그리고 human dopachrome tautomerase (DCT, TRP-2) 의 carboxy terminus antibody 인 aPEP8h를 Dr. Vincent J. Hearing (NIH, Bethesda, MD)으로부터 제공받아 western blotting 에 사용하였다 [6].
- 실험에 사용한 melanoma 세포주 B16F10은 한국 세포주 은행으로부터 분양받았다. 세포주는 Dulbeccos modified essential medium (DMEM), 10% fetal bovine serum, penicillin (100 U/mL), streptomycin (100 jjg/mL) (Gibco BRL, USA)을 첨가한 것을 기본 배지로 하여 humidified 5% CO2, 37℃ incubator에서 계대 배양하며 실험에 사용하였다.
- 실험에 사용한 melanoma 세포주 B16F10은 한국 세포주 은행으로부터 분양받았다. 세포주는 Dulbeccos modified essential medium (DMEM), 10% fetal bovine serum, penicillin (100 U/mL), streptomycin (100 jjg/mL) (Gibco BRL, USA)을 첨가한 것을 기본 배지로 하여 humidified 5% CO2, 37℃ incubator에서 계대 배양하며 실험에 사용하였다.
이론/모형
- cells 이 되게 plating하고 48 h 경과 후 아무것도 첨가하지 않은 것을 (-) control로, melanogenesis stimulating agent인 q-MSH를 처리한 것을 (+) control로 하고 측정하고자 하는 저해제를 처리하여 24 h 더 배양하였다. Total RNA 분리는 RNA gents® total RNA isolation system kit (Promega, USA)를 이용하여 제조사의 방법에 따라 실시하였다.즉, 세포배양을 마친 다음 PBS로 수세하고 denaturing soln 400 μL를 첨가하여 세포를 용해시킨 후 L5 mL tube에 옮겨 2 M sodium acetate (pH 4.
- Cell scraper로 완전히 lysis되도록 하여 L5 mL tube로 옮긴 다음, 12,000 rpm에서 5 min 동안 원심분리를 실시해 cell debris 등을 제거하였다. 시료내 단백질의 정량은 bicinchoninic acid (BCA) 방법으로 실시하였으며, 총 단백질 50 μg을 이용하여 10% SDS- PAGE를 실시하였다. 전기영동이 끝난 후 nitrocellulose membrane (0.
성능/효과
- q-MSH와 달리 세포 골격 단백질의 형성에 영향을 주는 phosphatidylinositol-3 kinase (PI3~K)의 저해제인 LY와 Rho kinase의 저해제인 Y가 멜라닌 합성을 유도한다는 보고에 따라 B16 배양액에 LY 혹은 Y를 첨가한 후 tyrosinase mRNA와 효소 활성을 측정하여 보았다(Figure 4-5). LY와 Y 둘 다 B16 세포의 tyrosinase mRNA 발현에는 별다른 영향을 주지 않았으며 여기에 melanostori을 첨가하면 약 10% 정도의 발현 억제 현상을 보였다. 반면에 LY를 첨가한 배양액에서 측정한 tyrosinase의 활성은 2.
- B16 세포배양에서 기본 배지만을 사용한 것을 control 로 하고 100 nM의 a-MSH만을 첨가한 것, 그리고 α- MSH를 첨가한 배지에 arbutin, melanoston을 농도별로 첨가하였을 때 멜라닌 합성 저해 정도를 측정하여 Table 1에 나타내었다. Melanogenesis stimulating agent인 tz-MSH 를 처리한 경우 B16에 의해 생성된 멜라닌 농도는 con- trol에 비해 80 μg/mL에서 304 #g/mL로 증가하였으며 여기에 저해제인 arbutin과 melanoston을 배양액에 첨가하였을 경우 1.36 mg/mL의 농도에서 각각 130 μg/mL과 111 μg/mL으로 나타나 a-MSH에 의해 증가된 멜라닌 양의 70% 정도가 감소할 정도로 멜라닌 합성 저해능이 우수한 것으로 나타났다,
- 본 연구에서는 효모에서 분리한 멜라닌 생성 억제물질인 melanoston의 작용 기전을 밝히기 위한 것이다. Melanoston의 작용기전으로는 tyro- sinase의 발현 억제, glycosylation 억제, melanosome 표면에서 tyrosinase 활성화 억제, 생성멜라닌 분비 억제 등을 생각할 수 있으나 본 연구에서는 B16 melanoma 세포를 이용하여 주로 tyrosinase 발현과 활성화 및 세포 형태변화를 중점적으로 조사하였으며 그 결과 melanoston 이 B16 세포의 형태 변화와 tyrosinase 활성화를 억제 하는 것으로 나타났다. 따라서 melanostone q-MSH에 의한 B16 세포분화 억제와 melanosome에서의 tyrosinase 활성화를 억제함으로써 결과적으로 멜라닌 생성을 억제하는 것으로 보인다.
- 9%가 감소하였다. PQQ란 화학물질은 tyrosinase 유전자 발현을 억제하는 물질로 알려져 있으며 본 실험에서 100 ㎍/mL의 농도로 배양액에 첨가했을 경우 tyrosinase mRNA의 발현량이 약 44% 감소했고 이러한 감소 현상은 a-MSH를 처리하지 않은 경우에도 나타났으며 100 ㎍/mL의 농도로 배양액에 첨가했을 경우 역시 44%의 발현 양 감소가 나타났다. Figure 2는 B16에 a-MSH를 처리하였을 때 멜라닌 합성에 관련된 효소인 tyrosinase, tyrosinase related protein-1 (TRP-1) 및 dopachrome tautomerase (DCT, TRP-2)의 단백질 발 현량 변화를 알아보기 위하여 세포파쇄액을 western blotting한 후 protein band를 Bio-Rad Fluor-S system을 이용하여 정량화한 것이다.
- Rho kinase의 저해제인Y의 경우에는 이러한 현상이 나타나지 않았다. Tabel 2는 이 결과들을 정리한 것으로, a-MSH를 처리한 B16 세포배양액에 melano- ston을 첨가할 경우 tyrosinase나 관련 효소들의 발현양 에는 별다른 영향을 미치지 못하지만 tyrosinase 활성을 현저히 억제하여 결과적으로 멜라닌 생성을 억제한다는 것을 보여주고 있다.
- Figure 2는 B16에 a-MSH를 처리하였을 때 멜라닌 합성에 관련된 효소인 tyrosinase, tyrosinase related protein-1 (TRP-1) 및 dopachrome tautomerase (DCT, TRP-2)의 단백질 발 현량 변화를 알아보기 위하여 세포파쇄액을 western blotting한 후 protein band를 Bio-Rad Fluor-S system을 이용하여 정량화한 것이다. Tyrosinase와 DCT의 경우는 a-MSH에 의해 발현량이 증가하였으며 TRPTe control과 큰 차이를 나타내지 않음을 알 수 있었다. Melanoston의 경우, 첨가한 양에 따라 a-MSH에 의해 증가된 tyrosinase 발 현량이 15% 정도 감소하는 것으로 나타났으며, TRP-1은 육안상으로 보는 것과 달리 melanoston에 의해 발현량이 감소하는 것처럼 나타났으나 a-MSH에 의해 증가된 수치가 적기 때문에 그저해효과는 낮았다.
- Arbutin을 처리한 경우(B)의 경우와 마찬가지로 B16 세포의 dendrite 형성에는 변함이 없고 tyrosinase 발현에도 변함이 없었으며 따라서 arbutine B16 세포의 형태 변화와 tyrosinase 발현에 별다른 영향을 주지 않음을 알 수 있다. si러나 melanoston 200 ㎍/mL를 처리한 경우(B)의 경우에 비해 B16 세포의 dendrite 형성을 억제함을 알 수 있었다. 이때 증가된 tyrosinase 발 현양은 (B)의 경우에 비해 크게 감소하지 않는 것으로 나타나 위에서 수행한 western blotting을 이용한 단백질 발 현 실험 결과와 일치함을 알 수 있었다.
- Melanoston의 작용기전으로는 tyro- sinase의 발현 억제, glycosylation 억제, melanosome 표면에서 tyrosinase 활성화 억제, 생성멜라닌 분비 억제 등을 생각할 수 있으나 본 연구에서는 B16 melanoma 세포를 이용하여 주로 tyrosinase 발현과 활성화 및 세포 형태변화를 중점적으로 조사하였으며 그 결과 melanoston 이 B16 세포의 형태 변화와 tyrosinase 활성화를 억제 하는 것으로 나타났다. 따라서 melanostone q-MSH에 의한 B16 세포분화 억제와 melanosome에서의 tyrosinase 활성화를 억제함으로써 결과적으로 멜라닌 생성을 억제하는 것으로 보인다.
- 이러한 억제 효과는 또한 10~20% 정도의 적은 양의 tyrosinase 발현도 억제하는 결과로 나타났으며 따라서 전반적으로는 멜라닌 합성 억제라는 현상으로 나타나게 된 것이다. 또 본 연구 결과에는 나타내지 않았으나 m이- anoston0] 생성된 멜라닌 분비에 미치는 효과를 조사하기 위하여 Cion M3 melanocyte cell에 melanostori으로 처리하고 5일이 경과한 후 세포 내 남아있는 melanin의 양을 Fontana-Mason staining으로 관찰하여 본 결과 세 포내 멜라닌 분비가 melanoston을 처리하였을 때 현저하게 억제됨을 알 수 있었다.
- LY와 Y 둘 다 B16 세포의 tyrosinase mRNA 발현에는 별다른 영향을 주지 않았으며 여기에 melanostori을 첨가하면 약 10% 정도의 발현 억제 현상을 보였다. 반면에 LY를 첨가한 배양액에서 측정한 tyrosinase의 활성은 2.9배, 멜라닌 생성은 3.1배로 증가하였으며 여기에 melanoston을 200 ㎍/mL 농도로 처리할 경우 tyrosinase 활성이 40% 이상 감소하였고 생성된 벤다닌의앙도 60% 정도 감소하는 것으로 나타났다(Table 2). Rho kinase의 저해제인Y의 경우에는 이러한 현상이 나타나지 않았다.
- 이때 증가된 tyrosinase 발 현양은 (B)의 경우에 비해 크게 감소하지 않는 것으로 나타나 위에서 수행한 western blotting을 이용한 단백질 발 현 실험 결과와 일치함을 알 수 있었다. 이러한 결과들을 종합해 볼 때 melanostone 현재 그 기전을 명확히 설명하기는 어렵지만 B16 세포의 분화 과정에 어떤 식으로든 개입하여 MSH에 의해 생성이 증가된 tyrosinasee}- melanosome으 로 이동하는 단계나 melanosome에서 마지막으로 tyro- sinase가 활성화하는 단계를 방해하는 것으로 보인다. 이러한 억제 효과는 또한 10~20% 정도의 적은 양의 tyrosinase 발현도 억제하는 결과로 나타났으며 따라서 전반적으로는 멜라닌 합성 억제라는 현상으로 나타나게 된 것이다.
- 이러한 결과들을 종합해 볼 때 melanostone 현재 그 기전을 명확히 설명하기는 어렵지만 B16 세포의 분화 과정에 어떤 식으로든 개입하여 MSH에 의해 생성이 증가된 tyrosinasee}- melanosome으 로 이동하는 단계나 melanosome에서 마지막으로 tyro- sinase가 활성화하는 단계를 방해하는 것으로 보인다. 이러한 억제 효과는 또한 10~20% 정도의 적은 양의 tyrosinase 발현도 억제하는 결과로 나타났으며 따라서 전반적으로는 멜라닌 합성 억제라는 현상으로 나타나게 된 것이다. 또 본 연구 결과에는 나타내지 않았으나 m이- anoston0] 생성된 멜라닌 분비에 미치는 효과를 조사하기 위하여 Cion M3 melanocyte cell에 melanostori으로 처리하고 5일이 경과한 후 세포 내 남아있는 melanin의 양을 Fontana-Mason staining으로 관찰하여 본 결과 세 포내 멜라닌 분비가 melanoston을 처리하였을 때 현저하게 억제됨을 알 수 있었다.
- Arbutin의 경우는 관련 효소의 발현과 상관없는 tyrosinase competitive inmbitor이기 때문에 세효소들에 대하여 유의성 있는 발현량의 감소를 찾아볼 수 없었다. 이상의 실험 결과를 종합하여 보면 B16 배양액에 melanoston을 2(1) ㎍/mL 농도로 처리할 경우 10-20% 내외의 유전자 및 단백질 발현 억제 효과가 있음을 확인할 수 있었다. 그러나 이러한 적은 양의 유전자 발현 억제가 melanin 생성을 70% 이상 억제한다고 보기 어려운 점이 있어 다음 실험을 진행하였다.
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