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문제 정의
- 또한세포에 강력한 독성을 지니는 H2O2를 처리농도와 시간을 달리하여 hepatoma에 인위적으로 처리함으로써 각각 다른 단계의 passage에서 얼마만큼의 산화제를 수용하고 조절할 수 있는지에 대한 능력을 규명하고자 하였다.
- 본 연구에서는 간암 세포인 hepatoma를 배양하여 어린 세포와 노화된 세포를 4단계의 cell passage로 구분하였고, 항산화 효소인 Cu/Zn SOD를 mRNA level에서 규명하고자 하였다[14]. 또한세포에 강력한 독성을 지니는 H2O2를 처리농도와 시간을 달리하여 hepatoma에 인위적으로 처리함으로써 각각 다른 단계의 passage에서 얼마만큼의 산화제를 수용하고 조절할 수 있는지에 대한 능력을 규명하고자 하였다.
제안 방법
- (5, 15, 25, 35 passage) 하여 HKb를 농도별(100 ρM, 500 pM, 1 mM, 5 mM)로 처리하고, 또한 H2O2의 처리 시간(30 분, 1 시간)을 변화시킴으로써, Hepatoma 세포주에서 H2O2 처리에 의 한 Cu/Zn SOD의 발현을 Northern blot을 통하여 다음과 같이 분석하였다. l)Hepatoma 세포주에서 시간별, 농도별로 산화제를 처리 했을 때 각각의 경우에서 발현양의 차이는 적었지만, 오랜 시간동안 고농도의 산화제에 노출시켰을때 항산화 능력 이 증가한다는 것을 확인할 수 있었다.
- 80〜90%로 confluent 하개 자란 hepatoma cell 에 H2O2를 대조군과 실험군에 각각 100 I1M, 500 μM, 1 mM, 그리고 5 mM이 되게 처리하여, 30 분, 1 시간 동안 37°Cz 5% CO2 in- cubator에서 배양하였다. 또한 cell passage에 따른 양상을 보기 위해서 5 15, 25, 35 cell passage에 대해서도 H2O2를 위와 같은 시간과 양에 따라 각각 처리하였다.
- Cell passage 5, 15, 25z 35에서 각각 H2O2100 11M, 500 ρM, 1 mM, 5 mM 되도록 처리하여 30 분, 1 시간 동안 incubatoT 에서 배양한 후, 세포에서 total RNA를 분리하고, 전기 영동 하여 Immobilon-Ny+membrane (Millipore) 에 transfer한 후, Cu/Zn SOD과 p-actin의 probe로 각각 hybridization 하였다. Total RNA를 전기 영동하여 transfer한 membrane을 hy bridization buffer 30 ml을 넣은 bottle에 넣고, 60°C에서 2 시간 동안 prehybridization을 수행하였다.
- Cu/Zn SOD and β-actin의 PCR product 1.5% agarose 에서 elution하여 실온에서 30 분 반응시켜 TOPO vector (TOPO TA Cloning Kit, Invitrogen)에 삽입하였다.
- Labeling한 probe 를 첨가하여 18 시간 동안 hybridization을 수행하였다. Hybridization을끝난 membrane은 68 C 의 washing buffer I (2xSSC, 0.1% SDS)으로 5 분씩 두 번, washing buffer H (O.lx SSC, 1% SDS)로 5 분씩 두 번 수행하였고, washing buffer IU (IxSSC) 에서 wa 아dng 할 때는 방사능 측정기 (Geiger counnter)로 감지하면서 시간을 적절히 조절하였다. 세척이 끝난 membran으은 -75°C에서 약 일주일 동안 감광시킨 후에 현상하였다.
- 제공한 protocol에 따라 50 ng의 DNA를 37C에서 30 분 동안 반응시켜 labeling 하였다. Labeling이 끝난 후, 반응액 중에 labeling 되지 않은 DNA를 제거하기 위해 Qiaquick nucleotide removal kit를 이용하였다.
- Total RNA를 전기 영동하여 transfer한 membrane을 hy bridization buffer 30 ml을 넣은 bottle에 넣고, 60°C에서 2 시간 동안 prehybridization을 수행하였다. Labeling한 probe 를 첨가하여 18 시간 동안 hybridization을 수행하였다. Hybridization을끝난 membrane은 68 C 의 washing buffer I (2xSSC, 0.
- PCR product를 Ready-To-Go DNA labeling Kit (dCIF, Pharmacia Biotech, USA)을 사용하여 Cu/Zn SOD과 p^actin의 probe를 제작하였다. 제공한 protocol에 따라 50 ng의 DNA를 37C에서 30 분 동안 반응시켜 labeling 하였다.
- 1. RT-PCR products using each specific primers and di gestion of vectors contained insert using EcoRL Mz DNA weight marker; lane 1, β-actin PCR product; lane 2, β-actin-vector digestion; lane 3, Cu/Zn SOD PCR product; and lane 4, Cu/Zn SOD-vector digestion.
- 07 프로그램을 사용하여 gene spesific하게 디자인 하였다(Cu/Zn SOD RS-1 primer: sense 5YCGTGTG CGTGCTGAAG-3; RS-2 primer: antisense ^-GGCAATCCC AATCACACCA-37 p-actin MP-1 primer: sense 5'-GGCTG TATTCCCCTCCAT-3, , MP-2 primer: antisense 5Z-TGCTGG AAGGTCGACAGTGA- 3Z). Total RNA 15 ㎕을 DEPC로 처 리한 ddHQ로 10 pl 되 게 첨 가한 후, lOxRT-amplification buf fer 2 ㎕, dNTPs (2.5 mM) 1 ㎕, MgCh (25 mM) 1 pl, reverse primer (10 pmol) 1 plz RNase inhibitor 40 unit, AMV reverse transcriptase 5 unitz DEPC로 처리한 ddHjO 3 ㎕를 첨가하여 39, C에서 60 분 동안 반응시켜 cDNA를 합성하였다.
- B-actin)의 cDNA를 합성하였다. 각각의 primer들은 pri merfinder v0.07 프로그램을 사용하여 gene spesific하게 디자인 하였다(Cu/Zn SOD RS-1 primer: sense 5YCGTGTG CGTGCTGAAG-3; RS-2 primer: antisense ^-GGCAATCCC AATCACACCA-37 p-actin MP-1 primer: sense 5'-GGCTG TATTCCCCTCCAT-3, , MP-2 primer: antisense 5Z-TGCTGG AAGGTCGACAGTGA- 3Z). Total RNA 15 ㎕을 DEPC로 처 리한 ddHQ로 10 pl 되 게 첨 가한 후, lOxRT-amplification buf fer 2 ㎕, dNTPs (2.
- 03% EDTA solution 3 ml을 넣고, 37°C, 5% CO2 incubator에서 3 분 동안 배양하여 세포를 culture flask에서 분리 한 후, MEM-a 5 ml을 첨 가하여 세포를 회수하였다. 각각의 농도, 시간, cell passage의 조건에서 세포를 모은 다음/ 다시 PBS로 두 번 washing 하였다. Trizol Reagent (Life Technologies, Glasgow, United Kingdom) 1 ml을 첨가하여 vortexing 한 후, 세포를 완전히 resuspension 하여 total RNA를 추출하였으며, 사용 전까지 -70C 에 보관하였다
- 배양하였다. 또한 cell passage에 따른 양상을 보기 위해서 5 15, 25, 35 cell passage에 대해서도 H2O2를 위와 같은 시간과 양에 따라 각각 처리하였다.
- 배양한 세포에서 추출한 total RNA 15//g을 이용하여 합성한 first cDNA를 template로 하여 RS-1, RS-2 primers를 어용하여 RT-PCR을 수행하고 1% agarose g신에서 전기 영동하였다. 그 결과 Cu/Zn SOD은 446 bp, 은 1 kb의 밴드로 확인되었다.
- 유전자의 발현 정도를 비교하기 위하여 housekeeping 유전자인 B-actin을 선택하여 동일한 조건으로 Northern blot 분석을 수행하였다. Cu/Zn SOD는 600 bp의 위치에서 밴드가 확인돠었다.
- 제작하였다. 제공한 protocol에 따라 50 ng의 DNA를 37C에서 30 분 동안 반응시켜 labeling 하였다. Labeling이 끝난 후, 반응액 중에 labeling 되지 않은 DNA를 제거하기 위해 Qiaquick nucleotide removal kit를 이용하였다.
- 추출한 total RNA를 template로 하여 각각(Cu/Zn SOD 와 B-actin)의 cDNA를 합성하였다. 각각의 primer들은 pri merfinder v0.
- 합성된 Cu/Zn SOD와 B-actin의 cDNA를 이용하여 PCR (Polymerase Chain Reaction, Perkin Elmer 480, USA) 을 수행하였다. 각각을 L5% agarose ge상에서 분리 한 후, G이 ex traction kit (Qiagen, Germany)를 이용하여 ehition하였다.
대상 데이터
- Hepa-lclc7 cell은 Mus musculus (mouse) 의 hepatoma cell로서 American Type Tissue Culture (ATCC)에서 분양받았다. 이 세포주에 streptomycin과 penicilin을 각각 100 unit /ml의 농도로 첨가하고, FBS는 10%가 되도록 첨가하여 사용 전까지 4°C에서 보관하였다.
성능/효과
- l)Hepatoma 세포주에서 시간별, 농도별로 산화제를 처리 했을 때 각각의 경우에서 발현양의 차이는 적었지만, 오랜 시간동안 고농도의 산화제에 노출시켰을때 항산화 능력 이 증가한다는 것을 확인할 수 있었다. 2)계대배양을 증가시키는 것은 노화가 진행된다는 것을 의미하므로, 산화제를 처리 했을 때 25 passage에서 35 passage 단계에서 항산화 효소의 발현 정도가 급격히 감소되는 것으로 미루어 보아 이 단계에서 노화가 진행되었음을 추측할 수 있었다. 3)동일한 시간과 농도로 처리했을 때 각각의 passage의 발현 level에서 보이는 양상과는 다르게 35 passage에서는 50011M이상의 농도를 1 시간동안 노출시켰을 경우에 Cu/Zn SOD가 거의 발현되지 않았으며, 30 분 동안 노출시켰을 때에는 500 11M의 농도까지 방어 할 수 있는 능력을 가진 것으로 보인다.
- 2)계대배양을 증가시키는 것은 노화가 진행된다는 것을 의미하므로, 산화제를 처리 했을 때 25 passage에서 35 passage 단계에서 항산화 효소의 발현 정도가 급격히 감소되는 것으로 미루어 보아 이 단계에서 노화가 진행되었음을 추측할 수 있었다. 3)동일한 시간과 농도로 처리했을 때 각각의 passage의 발현 level에서 보이는 양상과는 다르게 35 passage에서는 50011M이상의 농도를 1 시간동안 노출시켰을 경우에 Cu/Zn SOD가 거의 발현되지 않았으며, 30 분 동안 노출시켰을 때에는 500 11M의 농도까지 방어 할 수 있는 능력을 가진 것으로 보인다.
- H2O2를 30 분과 1 시간 동안 각각 처리했을 경우에 전반적인 발현양을 비교했을 때, 30분 동안 처리한 세포에서 발현이 더 높은 것으로 나타났다. 즉 5 passage는 유아기 상태로 강력한 산화제에 대하여 방어할 수 있는 능력이 부족한 것으로 보이며, 15, 25 passage는 중, 장년층으로 환경에 대해 적응할 수 있는 능력이 갖추었기 때문에 항산화력도 증가한 것으로 보인다.
- 같이 분석하였다. l)Hepatoma 세포주에서 시간별, 농도별로 산화제를 처리 했을 때 각각의 경우에서 발현양의 차이는 적었지만, 오랜 시간동안 고농도의 산화제에 노출시켰을때 항산화 능력 이 증가한다는 것을 확인할 수 있었다. 2)계대배양을 증가시키는 것은 노화가 진행된다는 것을 의미하므로, 산화제를 처리 했을 때 25 passage에서 35 passage 단계에서 항산화 효소의 발현 정도가 급격히 감소되는 것으로 미루어 보아 이 단계에서 노화가 진행되었음을 추측할 수 있었다.
- 이러한 PCR product# TOPO vector에 삽입하여 transformation 시킨 후, 플라스미드를 추출하여 EcoRI으로 digestion하여 1% agarose gel에 전기 영동하였다. 그 결과 3.9 kb의 TOPO vector0]) 446 bp의 Cu/Zn SOD in sert DNA가 transformation 되었음을 확인하였다(Fig. 1).
- 그 결과 Cu/Zn SOD은 446 bp, 은 1 kb의 밴드로 확인되었다. 이러한 PCR product# TOPO vector에 삽입하여 transformation 시킨 후, 플라스미드를 추출하여 EcoRI으로 digestion하여 1% agarose gel에 전기 영동하였다.
- 그러나 많은 다른 연구들의 결과를 보면, 산화제를 농도와 시간별로 처리했을 때 다른 항산화 효소보다 Cu/Zn SOD의 발현정도는 거의 비슷한 것으로 나타났다. 본 연구의 결과도 농도와 시간이 증가하여도 그 발현 정도에서 미미한 차이가 나타남을 알 수 있었다. 이것은 투여한 산화제의 농도가 배양한 세포에서 물로 전환시킬 수 있을 정도의 농도이기 때문에 산화제의 농도가 증가하여도 항산화 효소의 발현양은 미미하지만 증가한 것으로 보인다.
- 위와 동일한 농도의 H2O2를 각각 1 시간 동안 처리했을경우, 5 passage에서 25 passage까지의 세포에서 산화제 처리를 하지 않은 control에서의 발현이 점차 증가하는 양상과 같이 각각의 산화제 농도에서도 Cu/Zn SOD의 발현양이 점차 증가하였으나 30 분 동안 H2O2를 처리 했을 때와 같이 35 passage에서는 발현 정도의 차이가 거의 나타나지 않았다(Fig. 3).
후속연구
- 또한 산화제로써 H2O2를 A549 cell (human lung adenocarcinoma)에서 짧은 시 간동안 고농도로 처리했을 때 cell death와 apoptosis가 나타나는 것으로 보고되었다[8, 10]. 따라서 인위적으로 산화제를 투여하여 항산화 효소의 발현양을 측정하고, 산화제와 항산화제를 함께 투여했을 때 항산화 능력이 어떻게 변화되는지를 알 수 있다면 노화와 관련된 만성 질환을 치료하고 더 나아가 장수와도 연관을 지을 수 있을 것으로 보인다.
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