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문제 정의
- 두 가지 형으로 나눌 수 있다.11) 전보12)에서 한방의 치료이론인 기미론에 근거하여 분류한 한성약물들이 시험 관내 실험에서 MA0 저해활성을 나타내는 것을 확인하여 보고한 바 있으며, 본 연구는 MAO 활성 저해작용을 가진 새로운 화합물을 개발하고 이를 항우울 등의 중추신경계 질환의 치료제로 응용하기 위하여 감국의 MA0 활성을 확인하고자 하였다. 본 연구에서는 MA0 저해 활성을 나타내는 감국을 이용하여 항우울 및 파킨슨병 등의 중추신경계와 관련된 질환에 대한 치료제 개발 및 건강기능식품 소재를 개발하기 위한 연구의 일환으로 감국 메탄올 추출물의 각 용매 분획이 MAO 저해 활성을 확인하고자 하였으며, 또한 경구투여를 통한 in vivo 실험을 통해 체내 MA0 활성에 미치는 영향을 확인하였다.
- 11) 전보12)에서 한방의 치료이론인 기미론에 근거하여 분류한 한성약물들이 시험 관내 실험에서 MA0 저해활성을 나타내는 것을 확인하여 보고한 바 있으며, 본 연구는 MAO 활성 저해작용을 가진 새로운 화합물을 개발하고 이를 항우울 등의 중추신경계 질환의 치료제로 응용하기 위하여 감국의 MA0 활성을 확인하고자 하였다. 본 연구에서는 MA0 저해 활성을 나타내는 감국을 이용하여 항우울 및 파킨슨병 등의 중추신경계와 관련된 질환에 대한 치료제 개발 및 건강기능식품 소재를 개발하기 위한 연구의 일환으로 감국 메탄올 추출물의 각 용매 분획이 MAO 저해 활성을 확인하고자 하였으며, 또한 경구투여를 통한 in vivo 실험을 통해 체내 MA0 활성에 미치는 영향을 확인하였다.
제안 방법
- MAO의 활성 변화 측정 - SD계 흰쥐 7마리를 한 군으로 하여 6일동안 경구투여한 동물은 해부하여 좌심실에서 채혈하여 실혈시킨 후 뇌와 간을 적출하여 M&O-A와 MAO-B 의 활성 변화를 측정하였다. 한편 시료 대신 증류수를 투여한 동물의 효소활성을 따로 측정하여 시료에 의한 효소 활성의 변화에 대한 대조군으로 하였으며 MAO-A 및 MAO-B 의 효소원 조제 및 효소활성 측정은 앞에서 서술한 방법에 준하였다.
- 감국 메탄올 추출물이 체내 MAO 활성에 미치는 영향 - 동물 체내의 MA0 활성에 미치는 감국의 효과를 조사하기 위해 감국 추출물을 경구 투여한 흰쥐의 뇌와 간에서 MA0- A 및 MAO-B의 활성 변화를 측정하였다.
- 감국 추출물의 용매 분획물들이 시험관 내에서 효소 활성에 미치는 영향을 비교 관찰하였다. 아울러 실험 동물에게 감국 에탄올 추출물을 경구투여한 후 동물의 체내에서 일어나는 MAO의 활성변화를 관찰하였다.
- 경구투여용 시료의 조제 - 분쇄한 건조 감국 20g에 약 200 mL의 70% 에탄올 용액을 가하여 환류냉각하면서 100°C 에서6시간 동안 가열 추출하였다. NO.
- 17 kg을 얻었다. 메탄올 추출물 25 g을 상법에 따라 분획하여 헥산 분획 0.87 g, 에틸아세테이트 분획 3.14g, 부탄올 분획 1.68 g 및 물 분획 19.31 g을 각각 얻었으며, 이들의 MA0 저해활성을 측정하여 표로 정리하였다 (Table I).
- 시료의 경구투여 - 감국 추출물 10 mg을 증류수 1 mL에 녹이고 이 액을 실험 하루 전에 절식시킨 동물에게 6일 동안 하루 1회, 3 mL씩 경구 투여하였다. 대조군에는 같은 조건으로 증류수 3 mL씩을 경구투여 하였다.
- 시료의 추출 및 검액 조제 - 분쇄한 약재용 건조 감국 10 kg에 80% 메탄올 28 L를 가하여 실온에서 일주일간 추출하였다. 이 과정을 3회 반복 추출하여 그 여과액을 45°C 수욕 상에서 감압 농축하여 메탄올추출물로 얻었다.
- 미치는 영향을 비교 관찰하였다. 아울러 실험 동물에게 감국 에탄올 추출물을 경구투여한 후 동물의 체내에서 일어나는 MAO의 활성변화를 관찰하였다. 위의 실험을 통하여 다음과 같은 결론을 얻었다.
- 이 과정을 3회 반복 추출하여 그 여과액을 45°C 수욕 상에서 감압 농축하여 메탄올추출물로 얻었다. 이 추출물을 상법에 따라 분획하여 헥산 분획, 에틸아세테이트 분획, 부탄을 분획, 물 분획을 각각 얻었다. 각 분획을 1 mg/ mL 용액이 되도록 증류수로 녹이고, 이 액을 원액으로 1/ 2(0.
- 활성 변화를 측정하였다. 한편 시료 대신 증류수를 투여한 동물의 효소활성을 따로 측정하여 시료에 의한 효소 활성의 변화에 대한 대조군으로 하였으며 MAO-A 및 MAO-B 의 효소원 조제 및 효소활성 측정은 앞에서 서술한 방법에 준하였다.
- 효소원의 조제 - 흰쥐의 뇌 조직을 이용하여 전보'3에 보고한 방법대로 조제한 단백질을 희석하여 효소원으로 사용하였다.
- 효소활성 측정 - 조제 한 효소원을 사용하여 문헌의 방법 12, 13)에 준하여 효소활성을 측정하고 각 실험군의 대조군을 기준으로 하여 효소 활성의 변화를 정해진 수식에 따라 계산하였다.
대상 데이터
- 감국 추출 및 용매 분획 - 건조한 감국 10kg을 정량하여 80% 메탄올을 가하여 실온에서 추출하였다. 이 추출 과정을 3회 반복하여 얻은 추출액을 여과하고 45°C 수욕 상에서 감압 농축하여 메탄올 추출물 2.
- 실험동물 -5주령의 Sprague Dawley계 웅성 흰쥐를 (주) 오리엔트바이오사에서 공급받아 온도 23 ± 3°C, 습도 50 ± 10%, 12시간 주기로 조명을 조절하는 동물 사육실에서 일반 고형 사료와 물을 자유롭게 공급하면서 1주간 적응시킨 후 실험에 이용하였다.
- 실험재료 및 시약 -실험에 사용한 감국은 서울시 소재 경동시장 대덕한의원에서 건조시킨 한약재를 구입하여 사용하였고, 시료의 일부는 표준품(NP20-062)으로 보관하고 있다. 효소활성 측정에 사용한 세로토닌, 벤질아민, 이온교환수지 Amberlite CG-50 등은 Sigma사 제품을 사용하였고 기타 컬럼 크로마토그라피용 용매 및 시료 추출용 용매는 국산 특급 시약을 사용하였다.
- 효소활성 측정에 사용한 세로토닌, 벤질아민, 이온교환수지 Amberlite CG-50 등은 Sigma사 제품을 사용하였고 기타 컬럼 크로마토그라피용 용매 및 시료 추출용 용매는 국산 특급 시약을 사용하였다.
데이터처리
- 통계처리 - 실험 결과는 SAS 통계프로그램을 이용하였으며 '6)Student t-test* 사용하여 유의차 검정을 하였다. 모든 통계는 5% 수준에서 유의성을 검정하였다.
이론/모형
- The reaction mixture for MAO-B assay(final volume 1 mL) contained appropriate amount of the crude enzyme, and substrate (benzylamine). The enzymatic activity was measured according to the spectrophotometric procedure as described in the experimental method. Values are expressed as mean±S.
- 단백질 정량 - 단백질 함량은 bovine serum albumin을 표준물질로 하고 Bradford's 방법 17)을 이용하여 측정하였다.
- 효소원의 조제 - 흰쥐의 간 미토콘드리아 분획을 상법에 따라 분리하여 효소원으로 사용하였다.
- 효소활성 측정 -McEwen 등의 방법'14)에 준하여 효소 활성을 측정하고 각 실험군의 대조군을 기준으로 하여 효소 활성의 변화를 정해진 수식에 따라 계산하였다.
성능/효과
- MAO-A와 MAO-B의 효소활성 변화 - 증류수를 투여한대 조 군의 효소활성을 기준으로 positive control인 iproniazid 의 효소활성은 MA0-A는 186%로 증가하였고, MAO-B는 53%로 감소하였다 (p<0.05) (Fig. 1). 감국 추출물에 의한 MA0 효소 활성은 대조군에 비해 통계적으로 유의한 차이는 없었지만 MAQ-A의 효소 활성은 105%로 약간 증가하는 경향을 나타냈고, MAO-B의 효소활성은 97%로 다소 감소하는 경향을 나타내었다.
- 위의 실험을 통하여 다음과 같은 결론을 얻었다. 감국 메탄올 추출물은 시험관내에서 MAQ-A의 효소활성을 현저히 저해하는 것으로 나타났으나, MAO-B에 대한 저해활성은 미미하였다. 메탄올 추출물의 MAO-A에 대한 IC50 값은 0.
- 24 mg/mL이었다. 감국 용매분획을 대상으로 MA0 효소활성에 대한 저해 효과를 측정한 결과 에틸아세테이트 분획에서 가장 강력한 MAO-AU] 대한 저해활성이 확인되었으며, 에틸아세테이트 분획의 MAO] 대한 IC50 값은 0.05 mg/mL이었다. MAO- B에 대한 저해활성은 비교적 낮았으며, MAO-B에 대한 IC50 값은 0.
- 1). 감국 추출물에 의한 MA0 효소 활성은 대조군에 비해 통계적으로 유의한 차이는 없었지만 MAQ-A의 효소 활성은 105%로 약간 증가하는 경향을 나타냈고, MAO-B의 효소활성은 97%로 다소 감소하는 경향을 나타내었다. 이는 positive control인 iproniazid 의 MAO 저해활성과 유사한 경향을 나타내는 것이다.
- 부탄올 분획의 MAO 저해활성은 약하게 나타났으며, 물 분획의 경우에는 MAO에 대한 저해활성이 나타나지 않았다. 동물에게 감국 추출물을 경구 투여했을 때 MAO의 활성 변화에 크게 영향을 나타내지 않으며, MAO-A는 활성이 감소되고 MAO-B는 활성이 증가하는 경향이 관찰되었다.
- 모든 통계는 5% 수준에서 유의성을 검정하였다.
- 98mg/mL이었다. 물 분획물의 경우는 MAO-A에 대해 저해활성을 나타내지 않는 것으로 확인되었다 (Table I). MAO-A 저해제는 주로 정신과 질병 특히 우울증 치료 약물로 널리 이용되고 있다.
- 26 mg/mL이었다. 부탄올 분획의 MAO 저해활성은 약하게 나타났으며, 물 분획의 경우에는 MAO에 대한 저해활성이 나타나지 않았다. 동물에게 감국 추출물을 경구 투여했을 때 MAO의 활성 변화에 크게 영향을 나타내지 않으며, MAO-A는 활성이 감소되고 MAO-B는 활성이 증가하는 경향이 관찰되었다.
- 5 mg/mL이었다. 에틸아세테이트 분획에서 가장 강한 MAO-B에 대한 저해활성이 확인되었으며, 에틸아세테이트 분획의 MAO-B에 대한 IC50 값은 0.75 mg/mL이었다. 헥산 분획 및 부탄올 분획의 MAO-B에 대해 IC50 값은 각각 4.
- 24 mg/mL이었다. 용매 분획물 중에서 에틸아세테이트 분획이 가장 강한 MAO-A에 대한 저해 활성이 확인되었으며 에틸아세테이트 분획의 MAO-A에 대한 IC50 값은 0.05 mg/mL이었다. 헥산 분획의 경우도 MAO-A에 대한 저해활성을 나타내 IC50 값이 0.
- 용매분획의 시험관내 MAO-A 저해 활성 - 감국의 메탄올 추출물은 시험관내에서 MAO-A의 효소 활성을 현저히 저해하는 것으로 나타났다. 메탄올 추출물의 MAQ-A에 대한 IC50 값은 0.
- 용매분획의 시험관내 MAO-B 저해 활성 - 감국 추출물은 MAO-B에 대한 저해활성이 MAO-A에 대한 저해 활성에 비해 약하게 나타나는 특징을 나타냈다. 메탄올 추출물의 MAO-B에 대한 IC50 값은 9.
- 이상의 결론으로부터 in vitro 실험에서 감국이 MAO 저해 활성을 나타내는 식물로 확인되어 우울증 및 정신분열증과 같은 정신장애를 개선시킬 수 있는 건강기능식품 소재로서의 활용 가능성을 확인하였다.
- 75 mg/mL이었다. 헥산 분획 및 부탄올 분획의 MAO-B에 대해 IC50 값은 각각 4.0 mg/mL과 3.0 mg/mL으로 MAO-B에 대한 저해활성이 약하게 나타났고, 물 분획은 MAO-B에 대한 저해활성이 나타나지 않는 것으로 확인되었다 (Table I).
후속연구
- MAO-A 저해제는 주로 정신과 질병 특히 우울증 치료 약물로 널리 이용되고 있다.18)감국의 경우MAO-A에 대한 저해활성이 특징적으로 나타나며 식품공전에 식용으로 사용할 수 있는 식물로 등재되어 있는 독성이 없는 식물로 강한 생리활성을 나타내므로 훌륭한 건강기능식품 소재로 활용할 수 있을 것으로 생각된다.
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