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제안 방법
- 본 실험에서는 단삼 에탄올추출물의 유방암 예방 및 전이억제 효과를 살펴보기 위해 cytochrome P450 1A1, aromatase, ornithine decarboxylase (ODC) 및 matrix metalloproteinase(MMP)-9 활성에 미치는 효과를 측정하였다.
- 분리는 Phol과 Fouts의 방법 을 참고하여 실시하였다. Cytochrome P450 1A1 은 ethoxyresorufin-0-deethylase(EROD) 활성으로 측정하였다.D)즉, 흰쥐로부터 분리한microsomal protein (2 mg/mZ)200#에 640#의 0.
- 모든 시약들을 잘 섞은 후 37°C에서 4분간 반응시키고, 2#의 methanol로 반응을 종결시켰다. 2, 000 x g에서 20분 동안 원심분리하여 상층액을 취하고, 형광분광광도계 (BIO-TEK SFM25, USA)로 측정 (550 nm excitation and 585 nm emission) 하였다. 양성대조군은 resveratrol을 사용하였고, 음성대조군으로는 증류수를 사용하였다.
- Aromatase 활성 측정 - Aromatase 활성은 Thompson과 Siiteri의 방법3)을 변형하여 실시하였다. 즉, 기질 [10-3h(N)]androst-4-ene-3, 17-dione (specific activity 24.
- 방법3)을 변형하여 실시하였다. 즉, 기질 [10-3h(N)]androst-4-ene-3, 17-dione (specific activity 24.7 Ci/mmol) (100 nM), 태반 마이크로좀 (40mg), progesterone (10 gM), bovine serum albumin (0.1%), potassium phosphate (67 mM,pH 7.4)와 시료를 포함한 반응액 500 #를 상온에서 10분간 반응시켰다. 그리고 12 mM NADPH를 반응액에 넣고 37°C 에서 10분간 다시 반응시킨 후 5% TCA로 반응을 중단시켰다.
- 그리고 12 mM NADPH를 반응액에 넣고 37°C 에서 10분간 다시 반응시킨 후 5% TCA로 반응을 중단시켰다. 100 X g에서 10분간 원심분리 후 동량의 chlorofbrm으로 반응시킨 후 그 상층액은 dextran-charcoal 혼합액에 옮긴 후 원심분리하고 상층액의 radioactivity를 측정하였다.
- Ornithine decarboxylase (ODC) assay - MCF-7 cell 을 6-well tissue culture plate 에 well 당 4 x 10, cells/mZ 세포를 접종시키고, 18시간 후에 TPA와 시료 또는 양성대조군인 0.01 mM DFMOS- 처리하여 6시간 동안 배양하였다. 배양한 세포를 용해하여 Nam 등의 방법 '4)으로 ODC 활성을 즉정하였다.
- MCF-7 cells을 5 x 105 cells의 농도로 6 well plate에 분주하고 24시간 후 단삼 에탄올 추출물을 농도별로 처리하였다. 24시간 동안 배양시킨 후 상층 액을 취하여, 0.1% (w/v) gelatin이 포함된 SDS-PAGE를 이용하여 단백질을 전기영동하였다. 전기영동 후 gel을 2.
- 5% Triton X-100 용액에서 1시간 동안 씻어낸 다음 developing buffer에서 37°C로 24시간 배양시켰다. Coomassie 염색과 탈색을 통해 MMP-9 활성 정도를 확인하였다.
- Aromatase의 활성 저해효과 - 사람의 태반에서 분리한 aromatase의 활성에 단삼 에탄올추출물이 미치는 효과를 측정하였다. 그리고 aromatase 저해제의 양성대조군으로는 1 uM aminoglutethimide를 사용하였다.
대상 데이터
- 시약 - RPMI-1640 medium, antibiotics, 7, 12-dimethyl- benz[cc]-anthracene (DMBA), potassium phosphate buffer, ethoxyresorufin-O-deethylase (EROD), glucose-6-phosphate dehydrogenase, ethoxyresorufin, resveratrol, ip-3H(N)] androst-4-ene-3, 17-dione, progesterone, NADPH, difluoro methylornithine (DFMO), L-[1-14C] ornithine, EDTA, dithiothreitol, triton X-100, bovine serum albumin (BSA), epigallocatechin gallate (EGCG), Tris-HCl, bicinchoninic acid protein kit는 Sigma (St. Louis, MO, USA)에서 구입하였고, fetal bovine serum (FBS)은 JBI사 (Daegu, Korea)제품을 사용하였다. 기타 세포 배양용 시약 및 추출용 유기용매는 특급시약을 사용하였다.
- 에탄올추출물의 제조 - 실험에 사용한 국내산 단삼은 경주시 소재 건재상에서 구입하였으며, 단삼 1.2 kg은 상온에서 70% 에탄올 (2#)로 3일간 3회 추출하여 그 추출액을 여과 농축하여 에탄올추출물 222.1 g을 얻었다. 그리고 실험조건에서 사용되는 배지 및 증류수에 희석시켜 실험에 사용하였다.
- 2, 000 x g에서 20분 동안 원심분리하여 상층액을 취하고, 형광분광광도계 (BIO-TEK SFM25, USA)로 측정 (550 nm excitation and 585 nm emission) 하였다. 양성대조군은 resveratrol을 사용하였고, 음성대조군으로는 증류수를 사용하였다. 이 실험은 3회 반복 실험으로 수행하였으며, 각각의 결과는 control에 대한각 시료들의 저해도 정도를 %로 나타내었다.
- 그리고 aromatase 저해제의 양성대조군으로는 1 uM aminoglutethimide를 사용하였다. 그 결과, 단삼 에탄올 추출물은 농도의존적으로 aromatase 활성을 저해 하였으며, 300 ng/m? 이상의 농도 (p<0.
데이터처리
- 통계학적 처리 - 실험결과는 평균土표준편차(standard deviation, SD)로 나타내었으며, 실험에 대한 유의성 검정을 위해 student's /-test를 수행하여 결과치는 p 값이 0.05 미만을 통계학적으로 의미있는 것으로 간주하였다.
이론/모형
- 세포는 액체질소에 보존해 두었다가 같은 passage 번호를 가진 세포를 녹여서 사용하였으며, 세포의 생존은 trypan blue dye exclusion 방법으로 확인하였다.
- Cytochrome P450 1A1 의 활성 저해 측정 -DMBA (30mg/마리)를 처리한 흰쥐의 간조직으로부터 마이크로 좀의 분리는 Phol과 Fouts의 방법 을 참고하여 실시하였다. Cytochrome P450 1A1 은 ethoxyresorufin-0-deethylase(EROD) 활성으로 측정하였다.
- 01 mM DFMOS- 처리하여 6시간 동안 배양하였다. 배양한 세포를 용해하여 Nam 등의 방법 '4)으로 ODC 활성을 즉정하였다. ODC specific activity 는 pmol 14CO2/h/mg protein으로 나타내며, ODC 활성 억제는 TPA만 처리한 조절 군에 대한 각 시료들의 저해도 정도를 %로 나타내었다.
- Gelatin zymography - TPA에서 유도되어진 MmEP-9 활성을 알아보기 위하여 Overall 등"의 방법을 이용하여 gelatin zymography를 실시하였다. MCF-7 cells을 5 x 105 cells의 농도로 6 well plate에 분주하고 24시간 후 단삼 에탄올 추출물을 농도별로 처리하였다.
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