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문제 정의
- 상호 작용 관계를 제공할 것이다. 본 연구는 고농도 NaCl에서 발아 능력이 있는 ethyl methane sulfonate (EMS)에 의해 변이된 Arabidopsis 돌연변이체를 선발하였고, 그 돌연변이체에 대한 특성 연구를 수행하였다.
제안 방법
- SM2-U 돌연변이체에서의 고염 스트레스에 대한 내성 여부를 측정하기 위하여 175 mM NaCl의 MS 배지에서 종자 발아율을 측정하였다. 종자를 파종한 5일 후 발아율을 조사한 결과, WT 종자는 발아 및 떡잎 발달이 되지 못한 반면 sto42-14 돌연변이체는 떡잎이 발달됨을 알 수 있었다(Figure 3A).
- sto42-14 돌연변이체의 염 내성 특징 외에 다른 생장 표현형 특성을 살펴보기 위하여 glucose (Glc)가 함유된 MS 배지에서 종자 발아율 및 떡잎 생장 표현형을 관찰하였다. 4% Glc가 함유된 MS 배지에 종자를 파종한 5일 후의 종자 발아율과 15일 후의 생장 표현형을 관찰한 결과(Figure 4), WT 과 sto42-14 돌연변이체간의 5일째 종자 발아율에서는 차이를 나타내지 않았으나(Figure 4A), 15일째에서는 WT 떡잎발달이 되지 못한 반면, 돌연변이체의 떡잎이 발달되는 것으로 보아 sto42-14 돌연변이체는 Glc 비감수성을 갖고 있음을 관찰할 수 있었다.
- 왔다[5]. 고염 내성 및 당 비감수성을 갖는 SM2-14 돌연변이체가 GA 호르몬과의 연관성을 알아보기 위하여 GA가 함유된 배지에서 sto42-14 돌연변이체의 하배축과 뿌리 생장표현형을 측정 관찰하였다. 20 μM GA가 함유된 MS 배지에 종자를 파종하여 식물 배양실에서 10일 동안 키워 대조군과 sto42-14 돌연변이체의 하배축과 뿌리의 길이를 관찰 및 측정한 결과(Figure 5), 20 μM GA가 함유된 배지에서 대조군의 하 배축 길이는 4.
- 고염 스트레스에 대한 종자 발아율을 측정하기 위하여 175 mM NaCI이 함유된 MS 기본 배지에 종자 파종한 5일 후, 발아율을 조사하였다. 또한 4% glucose (Glc)가 함유된 MS 기본 배지에 종자 파종한 15일 후, 표현형을 관찰하였으며, gibberellin (GA) 호르몬에 대한 표현형을 조사하기 위하여, 20 μM GA가 함유된 MS 기본배지에 종자 파종한 10일 후, 유식물체의 하배축과 뿌리의 길이를 측정하였다.
- 다양한 염 농도에 대한 대조군 (wild-type, WT)S] 종자 발아율 감수성을 조사하기 위하여, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 225 그리고 250 mM NaCI이 첨가된 MS 기본 배지에 종자를 파종한 5일 후, 발아율을 조사하였다. 이 실험은 3회 반복 실험을 하였다.
- 발아율을 조사하였다. 또한 4% glucose (Glc)가 함유된 MS 기본 배지에 종자 파종한 15일 후, 표현형을 관찰하였으며, gibberellin (GA) 호르몬에 대한 표현형을 조사하기 위하여, 20 μM GA가 함유된 MS 기본배지에 종자 파종한 10일 후, 유식물체의 하배축과 뿌리의 길이를 측정하였다.
- 및 sto48-4) 선발하였다. 선발된 sfo 돌연변이체들의고염에 대한 내성을 재차 검정하기 위해 75 mM 및 125 mM NaCI이 함유된 MS 배지에 종자를 파종하여 식물 배양실에서 18일 동안 키운 후, 대조구 (WT)와 sto 돌연변이체들의 식물체 생장 표현형을 비교 관찰하였다. 그 결과, sto42-14, SM2-18 및 sto48-4 돌연변이체들은 75 mM 및 125 mM NaCI 농도에서 WT에 비해 식물체의 생장이 보다 잘 자라는 염 내성 표현형이 나타남을 확인하였다(Figure 2).
- 애기장대로부터 RD29A 유전자를 분리하기 위하여, Forward I primer (5'-GATAACGTTGGAGGAAGAGTCGGC-3‘) 와 Reverse I primer (5'-CAGCTCAGCTCCTGATTCACTACC -3')를 가지고 Reverse transcription PCR (RT-PCR)을 통하여 증폭된 DNA를 pGEM T-easy 벡터에 클로닝하였다.
- 염 내성 돌연변이체를 선발하기 위하여, ethyl methane sulfonate (EMS)로 처리된 돌연변이 종자 집단을 사용하였다. 150 mM NaCl 고염 스트레스 하에서 종자 발아 내성을 보이는 세 종류의 EMS 돌연변이체를 선발하였다.
- 염 농도에 대한 WT 종자 발아율 감수성 조사 결과를 토대로 우리는 EMS 돌연변이 종자들을 150 mM NaCI이 함유된 MS 기본 배지에 파종한 2주 후, 염해 내성 돌연변이체를 선발하였다. 이러한 선발과정을 통하여 3개의 돌연변이체를 선
- 염 처리 후, sto42-14 돌연변이체의 염 유도 유전자의 전사 양상을 알아보기 위하여 염 유도성 RD29A 유전자의 RNA 발현 양상을 확인하였다. MS 기본 배지에 종자를 파종하여 2주일 동안 키운 후 150 mM NaCl이 함유된 MS 액체 배지로 0시간, 3시간 및 6시간 동안 처리하여 각 식물체로부터 total RNA를 추출한 후, Northern을 비교 분석한 결과, sto42-14 돌연변이체의 RD29A 전사체는 대조구와 비교 했을 때 NaCl 처리 후 3시간부터 대조구보다 강하게 발현함을 확인할 수 있었다(Figure 6).
- 염해 내성 돌연변이체를 선발하기 위하여 wild-type (WT) 종자 발아에 대한 적정 염 농도를 조사하였다. 50 mM에서 250 mM 까지의 다양한 NaCI 농도 별에서 WT 종자에 대한발아율을 조사한 결과, NaCI이 함유되지 않는 MS 기본 배지에서는 종자의 발아율이 90% 이상, 50 ~ 100 mM NaCI에서는 55% 이하, 그리고 125 ~ 200 mM NaCI에서는 15% 이하의 발아율을 나타내었고, 225 mM 이상의 NaCI 농도에서는 WT 종자가 전혀 발아하지 못함을 관찰할 수 있었다(Figure 1).
- 종자는 70% 에탄올로 1분, 2% sodium hypochlorite 용액으로 10분간 살균한 다음 멸균수로 5회 충분히 세정한 후, 4C에서 암상태로 2일간 저온 처리하여 MS 기본 배지[1 이에 파종하였다. 식물 생장 조절실내의 환경조건은 16/8시간 명기/ 암기로 조절된 광주기 하에서 온도는 22℃, 습도는 70%로 유지되도록 조절하였다.
대상 데이터
- 150 mM NaCl 고염 스트레스 하에서 종자 발아 내성을 보이는 세 종류의 EMS 돌연변이체를 선발하였다. 세 종류의 EMS 돌연변이체들 중, salt tolerance 42-14 (sto42-14) 돌연변이체는 175 mM NaCl 고농도에서 종자 발아율이 대조구 (WT)에 비해 7배 이상의 높은 발아율을 보였다.
- 염해 내성 돌연변이체를 선발하기 위하여 EMS 애기장대 (ecotype Col-0) M2 종자를 구입하여 150 mM NaCI이 함유된 MS 배지에 파종한 2주 후 조사한 결과, 잠정적인 염해 내성 돌연변이체 3개의 salt tolerance (sfo) lines을 (sto42-14, sto42-18 및 sto48-4) 선발하였다. 선발된 sfo 돌연변이체들의고염에 대한 내성을 재차 검정하기 위해 75 mM 및 125 mM NaCI이 함유된 MS 배지에 종자를 파종하여 식물 배양실에서 18일 동안 키운 후, 대조구 (WT)와 sto 돌연변이체들의 식물체 생장 표현형을 비교 관찰하였다.
- 염해 내성 돌연변이체를 선발하기 위하여, 애기장대(Arabidopsis thaliana, ecotype Col-O) 종자에 ethyl methane sulfonate (EMS)로 처리된 M2 세대 종자(50, 000 종자)를 Lehle Seeds (Round Rock, TX) 회사로부터 구입하였다. 종자는 70% 에탄올로 1분, 2% sodium hypochlorite 용액으로 10분간 살균한 다음 멸균수로 5회 충분히 세정한 후, 4C에서 암상태로 2일간 저온 처리하여 MS 기본 배지[1 이에 파종하였다.
이론/모형
- 2% form- aldehyde-agarose gel에서 전기 영동한 후, nylon membrane (Roche, Indianapolis, IN)으로 옮겨졌다. Hybridization과 membrane wash 과정eSambrook 등[14]의 방법으로 수행하였다.
- Total RNA는 MS 기본 배지에 종자를 파종하여 2주 동안 자란 식물체를 150 mM NaCI이 함유된 MS 액체 배지에 옮긴 후, 0, 3, 및 6시간 동안 처리한 식물체로부터 aurintricarboxylic acid (ATA) 방법에 의하여 추출하였다[9]. Northern 분석을 위해 total RNA (20 μg)는 1.
성능/효과
- 고염 내성 및 당 비감수성을 갖는 SM2-14 돌연변이체가 GA 호르몬과의 연관성을 알아보기 위하여 GA가 함유된 배지에서 sto42-14 돌연변이체의 하배축과 뿌리 생장표현형을 측정 관찰하였다. 20 μM GA가 함유된 MS 배지에 종자를 파종하여 식물 배양실에서 10일 동안 키워 대조군과 sto42-14 돌연변이체의 하배축과 뿌리의 길이를 관찰 및 측정한 결과(Figure 5), 20 μM GA가 함유된 배지에서 대조군의 하 배축 길이는 4.5 mm, 뿌리 길이는 7 mm인데 반해, sto42- 14 돌연변이체의 하배축 길이는 L5 mm, 뿌리 길이는 1.2 mm임을 관찰할 수 있었다(Figure 5B 및 5C). GA가 함유된 배지에서 sto42-14 돌연변이체는 대조군에 비해 하배축과 뿌리 생장이 현저히 억제됨을 알 수 있었다.
- 4% Glc가 함유된 MS 배지에 종자를 파종한 5일 후의 종자 발아율과 15일 후의 생장 표현형을 관찰한 결과(Figure 4), WT 과 sto42-14 돌연변이체간의 5일째 종자 발아율에서는 차이를 나타내지 않았으나(Figure 4A), 15일째에서는 WT 떡잎발달이 되지 못한 반면, 돌연변이체의 떡잎이 발달되는 것으로 보아 sto42-14 돌연변이체는 Glc 비감수성을 갖고 있음을 관찰할 수 있었다. 이러한 결과는 STO42-14 유전자가 Glc 하에서 떡잎 발달에 중요한 유전자임을 나타낸다.
- 발아에 대한 적정 염 농도를 조사하였다. 50 mM에서 250 mM 까지의 다양한 NaCI 농도 별에서 WT 종자에 대한발아율을 조사한 결과, NaCI이 함유되지 않는 MS 기본 배지에서는 종자의 발아율이 90% 이상, 50 ~ 100 mM NaCI에서는 55% 이하, 그리고 125 ~ 200 mM NaCI에서는 15% 이하의 발아율을 나타내었고, 225 mM 이상의 NaCI 농도에서는 WT 종자가 전혀 발아하지 못함을 관찰할 수 있었다(Figure 1). 이러한 결과에서, 125 mM NaCI 농도는 종자 발아하는데 있어서 아주 커다란 영향을 미치는 농도임을 알 수 있었다.
- 2 mm임을 관찰할 수 있었다(Figure 5B 및 5C). GA가 함유된 배지에서 sto42-14 돌연변이체는 대조군에 비해 하배축과 뿌리 생장이 현저히 억제됨을 알 수 있었다. 이러한 결과는 STO42-14 유전자가 GA 호르몬에 반응하는 뿌리 및 하배축길이 조절에 관여함을 알 수 있다.
- 양상을 확인하였다. MS 기본 배지에 종자를 파종하여 2주일 동안 키운 후 150 mM NaCl이 함유된 MS 액체 배지로 0시간, 3시간 및 6시간 동안 처리하여 각 식물체로부터 total RNA를 추출한 후, Northern을 비교 분석한 결과, sto42-14 돌연변이체의 RD29A 전사체는 대조구와 비교 했을 때 NaCl 처리 후 3시간부터 대조구보다 강하게 발현함을 확인할 수 있었다(Figure 6). 이러한 결과는 염 스트레스 하에서, RD29A 전사체는 STO42-14 유전자에 의해 직접 또는 간접적으로 조절됨을 알 수 있다.
- 종자를 파종한 5일 후 발아율을 조사한 결과, WT 종자는 발아 및 떡잎 발달이 되지 못한 반면 sto42-14 돌연변이체는 떡잎이 발달됨을 알 수 있었다(Figure 3A). NaCl이 함유되지 않은 MS 배지에서는 대조구와 sto42- 14 돌연변이체의 종자 발아율이 90% 이상으로 서로 비슷함을 나타내었고, 175 mM NaCl이 함유된 MS 배지에서는 대조구 (WT)는 종자 발아율이 10% 이하인데 반해, SM2-14 돌연변이체는 75%의 발아율을 관찰할 수 있었다(Figure 3B). 이러한 결과를 통하여 sto42-14 돌연변이체는 고염 스트레스 하에서도 내성임을 재확인할 수 있었다.
- 선발된 sfo 돌연변이체들의고염에 대한 내성을 재차 검정하기 위해 75 mM 및 125 mM NaCI이 함유된 MS 배지에 종자를 파종하여 식물 배양실에서 18일 동안 키운 후, 대조구 (WT)와 sto 돌연변이체들의 식물체 생장 표현형을 비교 관찰하였다. 그 결과, sto42-14, SM2-18 및 sto48-4 돌연변이체들은 75 mM 및 125 mM NaCI 농도에서 WT에 비해 식물체의 생장이 보다 잘 자라는 염 내성 표현형이 나타남을 확인하였다(Figure 2). 또한, 75 mM NaCI 농도의 염해 스트레스 하에서 sto42-14는 sto42-18및 sto48-4 돌연변이체와의 잎 생장 차이가 보임으로써 (Figure 2A), 최소한 STO42-14 유전자는 STO42-18 또는 STO48-4 유전자와 다름을 알 수 있었다.
- 세 종류의 EMS 돌연변이체들 중, salt tolerance 42-14 (sto42-14) 돌연변이체는 175 mM NaCl 고농도에서 종자 발아율이 대조구 (WT)에 비해 7배 이상의 높은 발아율을 보였다. 또한 내염성 sto42-14 돌연변이체는 glucose (Glc)에 대해서도 비감수성을 갖고 있음을 관찰되었고, 흥미롭게도 sto42-14 돌연변이체에 20 gM gibberellin (GA)을 처리한 결과, 대조구에 비해 하 배축과 뿌리의 생장이 억제됨을 관찰할 수 있었다. 이러한 결과를 바탕으로, 고염 내성 sto42-14 돌연변이체는 Glc 뿐만 아니라 GA 호르몬 반응에도 관련되어져 있음을 알 수 있다.
- 확보하였다. 또한 이들 3개의 돌연변이체들ewild-type과 교잡 후 얻어진 종자를 가지고 (F1 및 F2), 150 mM NaCI이 함유된 MS 배 지에 파종하여 발아 실험한 결과, 열성 돌연변이체임을 확인할 수 있었다.
- 그 결과, sto42-14, SM2-18 및 sto48-4 돌연변이체들은 75 mM 및 125 mM NaCI 농도에서 WT에 비해 식물체의 생장이 보다 잘 자라는 염 내성 표현형이 나타남을 확인하였다(Figure 2). 또한, 75 mM NaCI 농도의 염해 스트레스 하에서 sto42-14는 sto42-18및 sto48-4 돌연변이체와의 잎 생장 차이가 보임으로써 (Figure 2A), 최소한 STO42-14 유전자는 STO42-18 또는 STO48-4 유전자와 다름을 알 수 있었다.
- 발하였으며 (salt tolerance; sto42-14, sM2-18, sto48-4로 명 명), 선발된 3개의 돌연변이체들은 M3 세대에서 150 mM NaCI 농도에 대해 single locus로 분리됨을 알 수 있었고 M4 세대를-거쳐 안정된 homozygous 돌연변이체들을 확보하였다. 또한 이들 3개의 돌연변이체들ewild-type과 교잡 후 얻어진 종자를 가지고 (F1 및 F2), 150 mM NaCI이 함유된 MS 배 지에 파종하여 발아 실험한 결과, 열성 돌연변이체임을 확인할 수 있었다.
- 150 mM NaCl 고염 스트레스 하에서 종자 발아 내성을 보이는 세 종류의 EMS 돌연변이체를 선발하였다. 세 종류의 EMS 돌연변이체들 중, salt tolerance 42-14 (sto42-14) 돌연변이체는 175 mM NaCl 고농도에서 종자 발아율이 대조구 (WT)에 비해 7배 이상의 높은 발아율을 보였다. 또한 내염성 sto42-14 돌연변이체는 glucose (Glc)에 대해서도 비감수성을 갖고 있음을 관찰되었고, 흥미롭게도 sto42-14 돌연변이체에 20 gM gibberellin (GA)을 처리한 결과, 대조구에 비해 하 배축과 뿌리의 생장이 억제됨을 관찰할 수 있었다.
- 위의 실험 결과들을 바탕으로, SM2-14 유전자는 고염 및 Glc 내성에 관련된 유전자임을 알 수 있었으며, 또한 GA 호르몬에 대해 식물체의 뿌리 및 하배축 길이 조절에 관여함을 알 수 있었다. 앞으로의 최우선적인 연구로는 SM2-14 돌연변이체로부터 변이 유전자를 분리하기 위해 map-base cloning 방법을 수행해야 할 것이며, 특히 sto42-14 돌연변이 체는 염, Glc 및 GA에 대한 복합 연관 관계의 기전을 규명할 수 있는 좋은 재료가 되리라 생각한다.
- 또한 내염성 sto42-14 돌연변이체는 glucose (Glc)에 대해서도 비감수성을 갖고 있음을 관찰되었고, 흥미롭게도 sto42-14 돌연변이체에 20 gM gibberellin (GA)을 처리한 결과, 대조구에 비해 하 배축과 뿌리의 생장이 억제됨을 관찰할 수 있었다. 이러한 결과를 바탕으로, 고염 내성 sto42-14 돌연변이체는 Glc 뿐만 아니라 GA 호르몬 반응에도 관련되어져 있음을 알 수 있다.
- NaCl이 함유되지 않은 MS 배지에서는 대조구와 sto42- 14 돌연변이체의 종자 발아율이 90% 이상으로 서로 비슷함을 나타내었고, 175 mM NaCl이 함유된 MS 배지에서는 대조구 (WT)는 종자 발아율이 10% 이하인데 반해, SM2-14 돌연변이체는 75%의 발아율을 관찰할 수 있었다(Figure 3B). 이러한 결과를 통하여 sto42-14 돌연변이체는 고염 스트레스 하에서도 내성임을 재확인할 수 있었다.
- 50 mM에서 250 mM 까지의 다양한 NaCI 농도 별에서 WT 종자에 대한발아율을 조사한 결과, NaCI이 함유되지 않는 MS 기본 배지에서는 종자의 발아율이 90% 이상, 50 ~ 100 mM NaCI에서는 55% 이하, 그리고 125 ~ 200 mM NaCI에서는 15% 이하의 발아율을 나타내었고, 225 mM 이상의 NaCI 농도에서는 WT 종자가 전혀 발아하지 못함을 관찰할 수 있었다(Figure 1). 이러한 결과에서, 125 mM NaCI 농도는 종자 발아하는데 있어서 아주 커다란 영향을 미치는 농도임을 알 수 있었다.
- 측정하였다. 종자를 파종한 5일 후 발아율을 조사한 결과, WT 종자는 발아 및 떡잎 발달이 되지 못한 반면 sto42-14 돌연변이체는 떡잎이 발달됨을 알 수 있었다(Figure 3A). NaCl이 함유되지 않은 MS 배지에서는 대조구와 sto42- 14 돌연변이체의 종자 발아율이 90% 이상으로 서로 비슷함을 나타내었고, 175 mM NaCl이 함유된 MS 배지에서는 대조구 (WT)는 종자 발아율이 10% 이하인데 반해, SM2-14 돌연변이체는 75%의 발아율을 관찰할 수 있었다(Figure 3B).
후속연구
- 고염 스트레스에 대한 종자 발아율 측정 연구는 종자의 수분 흡수 저해와 이온 독성에 의한 발아율 영향[11] 등에 대한 유용한 정보를 제공해 줄 수 있으며, 또한 그와 관련된 유전자들의 상호 작용 관계를 제공할 것이다. 본 연구는 고농도 NaCl에서 발아 능력이 있는 ethyl methane sulfonate (EMS)에 의해 변이된 Arabidopsis 돌연변이체를 선발하였고, 그 돌연변이체에 대한 특성 연구를 수행하였다.
- 수 있었다. 앞으로의 최우선적인 연구로는 SM2-14 돌연변이체로부터 변이 유전자를 분리하기 위해 map-base cloning 방법을 수행해야 할 것이며, 특히 sto42-14 돌연변이 체는 염, Glc 및 GA에 대한 복합 연관 관계의 기전을 규명할 수 있는 좋은 재료가 되리라 생각한다.
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