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문제 정의
- 본 연구는 돼지 난포란의 체외배양액과 배발달 배양액에 성장인자인 EGF와 IGF-Ⅰ을 각각 0, 1, 5 및 10 ng/ml 첨가배양함으로서 돼지 난포란의 체외성숙과 체외배발달에 미치는 영향을 구명하고자 실시하였다. 본 연구에서 얻어진 결과를 요약하면 다음과 같다.
- 위에서 보는 바와 같이, 난자의 성숙과 발달에는 다양한 호르몬과 성장인자가 관여한다는 사실은 밝혀졌지만, 난자의 체외배양에서 이들 물질의 첨가수준이나 첨가조합은 연구자에 따라 매우 다양한 결과들을 제시하고 있다. 이에 본 연구는 돼지 미성숙난포란의 체외성숙과 초기배발달에 유효하게 작용하는 것으로 알려진 표피성장인자 (epidermal growth factor, EGF)와 인슐린-양성장인자-Ⅰ(insulin-like growth factor-Ⅰ, IGF-Ⅰ)의 효과를 입증하고, 아울러 이들 성장인자의 적정 첨가수준을 구명하기 위하여 실시하였다.
제안 방법
- 44시간 동안 체외성숙된 돼지 난포란은 0. 1％ hya- luronidase(Sigma, USA)가 함유된 NCSU-23 용액에 넣어 연속적인 피펫팅으로난 구세포를 제거하고, 2.5 mM caffeine과 0.1％ BSA가 함유된 mTBM 용액으로 3회 세정하였다. 세정 후 미리 48시간 전배양을 실시한 90 ㎕ 수정용 배양액 소적에 30～40개의 성숙난자를 넣고 매정시까지 배양기 내에서 배양하였다.
- EGF와 IGF-Ⅰ의 첨가배양이 돼지 미성숙 난포란의 체외성숙에 미치는 영향을 구명하기 위하여 체외성숙 기본배양액인 NCSU-23에 10%의 돼지난포액(pFF), 0.9 mM의 cysteine, 10 IU/㎖ PMSG, 10 IU/㎖ hCG을 첨가하고 EGF와 IGF-1을 각각 0, 1, 5 및 10 ng/ml을 첨가하여 체외성숙에 미치는 영향을 핵성숙률, 자웅전핵형성률 및 배발달에 미치는 영향을 조사하였다. 또 한 EGF와 IGF-Ⅰ이 초기배 발달에 미치는 영향을 조사하기 위하여 체외성숙 기본배양액인 NCSU-23에 성숙을 유기한 후 체외수정용 배양액인 mTBM배양액에 정자와 같이 6시간동안 공 배양을 통하여 체외수정을 유도한 후, 생산된 수정란을 EGF와 IGF-Ⅰ이 각각 0, 1, 5 및 10 ng/ml이 첨가된 배발달배양액에 넣어 5% 탄산 가스배양기에 배양하면서 배양 2일후에 난할률을, 6일 및 7일에 배발달률 및 이중형광염색을 통한 ICM세포 및 TE세포수를 조사하였다.
- 각각의 첨가군별 5～6시간 동안 체외수정용 배양액에서 정자와 수정을 유기한 후, pipetting 및 배발달 배양액으로 3회 세척하여 잔류된 난구세포와 투명대부착정자를 제거하였다. 그리고 배발달 배양액에 옮겨 추가로 배양한 다음, 수정후 10～12시간에 1-세포기의 수정란을 Byun 등 (1991)의 방법에 따라 난자급속염색법으로 염색하여 정자의 침입과 자․웅전핵형성을 확인하여 수정여부를 판정하였다.
- 그리고 slide glass위에 난포란 30～40개를 적하한 다음, cover slip으로 덮고, 난포란의 부피로 생긴 cover slip과 slide glass의 틈으로 고정액(glacial acetic acid : absolute ethanol = 1 : 3)을 흘리는 방법으로 5분간 고정하였다. 고정이 끝난 난포란의 염색은 염색액을 고정액과 같은 방법으로 주입하여 2～3분간 염색을 실시한 후, 탈염제(glacial acetic acid : distilled water : glycerol = 1 : 3 : 1)를 흘려 난세포질 이외의 염색액을 제거시킨 다음, 위상차현미경(400～1,000×)으로 난포란의 핵성숙 단계를 판정하였다. 핵성숙단계의 판정은 Hunter와 Polge(1966)의 방법에 준하여 실시하였다.
- 공시난포란의 채란은 18-gauge 주사침이 장착된 10 ml 주사기로 직경이 2～5 mm의 포상난포로 부터 난포액과 함께 난포란을 흡인하여 15 ml 원심분리관에 옮겨 38℃로 조정된 정온대(multi-block, USA)에 10분간 정치, 난포란의 침전을 유도한 다음, 상층액을 버리고 pellet만을 취하여 1.5 cm 간격으로 방안을 표시한 87×15 mm 페트리접시에 넣고 1 mg/ml PVA(Sigma, USA)가 첨가된 TL-Hepes와 희석하여 실체현미 경하에서 난구세포가 2～3층 이상 치밀하게 붙어 있고 세포질이 균일한 난포란만을 선별·회수하여 체외성숙 실험에 공시하였다.
- 3% hyaluronidase(Sigma, USA)용 액에 성숙이 유기된 난자난구세포복합체(Oocytecummulus complexes)를 옮겨 1분간 vortexing하 여 난구세포를 완전히 제거한 다음 1% BSA가 함유된 TL-Hepes로 3회 세척하였다. 그리고 slide glass위에 난포란 30～40개를 적하한 다음, cover slip으로 덮고, 난포란의 부피로 생긴 cover slip과 slide glass의 틈으로 고정액(glacial acetic acid : absolute ethanol = 1 : 3)을 흘리는 방법으로 5분간 고정하였다. 고정이 끝난 난포란의 염색은 염색액을 고정액과 같은 방법으로 주입하여 2～3분간 염색을 실시한 후, 탈염제(glacial acetic acid : distilled water : glycerol = 1 : 3 : 1)를 흘려 난세포질 이외의 염색액을 제거시킨 다음, 위상차현미경(400～1,000×)으로 난포란의 핵성숙 단계를 판정하였다.
- 각각의 첨가군별 5～6시간 동안 체외수정용 배양액에서 정자와 수정을 유기한 후, pipetting 및 배발달 배양액으로 3회 세척하여 잔류된 난구세포와 투명대부착정자를 제거하였다. 그리고 배발달 배양액에 옮겨 추가로 배양한 다음, 수정후 10～12시간에 1-세포기의 수정란을 Byun 등 (1991)의 방법에 따라 난자급속염색법으로 염색하여 정자의 침입과 자․웅전핵형성을 확인하여 수정여부를 판정하였다.
- 9 mM의 cysteine, 10 IU/㎖ PMSG, 10 IU/㎖ hCG을 첨가하고 EGF와 IGF-1을 각각 0, 1, 5 및 10 ng/ml을 첨가하여 체외성숙에 미치는 영향을 핵성숙률, 자웅전핵형성률 및 배발달에 미치는 영향을 조사하였다. 또 한 EGF와 IGF-Ⅰ이 초기배 발달에 미치는 영향을 조사하기 위하여 체외성숙 기본배양액인 NCSU-23에 성숙을 유기한 후 체외수정용 배양액인 mTBM배양액에 정자와 같이 6시간동안 공 배양을 통하여 체외수정을 유도한 후, 생산된 수정란을 EGF와 IGF-Ⅰ이 각각 0, 1, 5 및 10 ng/ml이 첨가된 배발달배양액에 넣어 5% 탄산 가스배양기에 배양하면서 배양 2일후에 난할률을, 6일 및 7일에 배발달률 및 이중형광염색을 통한 ICM세포 및 TE세포수를 조사하였다.
- 정액은 인공수정용 액상정액으로 사용 직전까지 17℃ 항온고에서 최대 4일간 보존하면서 사용하였다. 보존된 정액은 사용직전에 정액세정액 (DPBS)과 함께 1 : 1 비율로 15 ㎖ falcon tube 에 넣고 450g에서 3분간 원심분리를 실시하여 상층액을 제거하는 세정과정을 3회 실시하였다. 마지막으로 하단에 남은 정자 침전물에 정자 세정 용배양액을 넣어 39℃, 5％ CO2및 포화습도의 CO2배양기 내에서 10분간 정치하였다.
- 회수한 양질의 미성숙난자는 TL-Hepes 배양액으로 3회 세정하고, 곧바로 체외성숙용 배양액으로 3회 세정하였다. 세정된 미성숙 난자는 각 well당 40～50개씩 넣어 39℃, 5％ CO2, 포화습도 조건의 배양기 내에서 호르몬이 첨가된 배양액에서 22시간, 호르몬이 첨가되지 않은 체외성숙용 배양액에서 22시간, 총 44시간 동안 배양하여 체외성숙을 유도하였다.
- 이들 수정란은 rabbit anti-pig whole serum이 1 : 5로 희석된 TL-Hepes용액에 서 1시간 처리한 후, TL-Hepes-PVA 용액으로 5분간 3회 세척하였으며, 10 ug/ml Hoechest 33342와 10 ug/ml propidium iodide(1 : 1)이 함유된 Guinea pig complement가 함유된 TLHepes(1 : 10)-PVA에서 1시간 처리하였다. 위의 방법에 의해 면역 외과적인 처리가 끝난 수정란을 slide glass위에 3 ㎕ mounting 용액을 떨어뜨려 소적을 만들고, 이곳에 수정란을 넣은 다음, cover glass를 덮고 매니큐어로 밀봉하여 형광현 미경하(200×)에서 세포수를 조사하였다.
- 5% pronase에 처리하여 용해시킨 후, TL-Hepes-PVA 배양액에서 3회 세척하였다. 이들 수정란은 rabbit anti-pig whole serum이 1 : 5로 희석된 TL-Hepes용액에 서 1시간 처리한 후, TL-Hepes-PVA 용액으로 5분간 3회 세척하였으며, 10 ug/ml Hoechest 33342와 10 ug/ml propidium iodide(1 : 1)이 함유된 Guinea pig complement가 함유된 TLHepes(1 : 10)-PVA에서 1시간 처리하였다. 위의 방법에 의해 면역 외과적인 처리가 끝난 수정란을 slide glass위에 3 ㎕ mounting 용액을 떨어뜨려 소적을 만들고, 이곳에 수정란을 넣은 다음, cover glass를 덮고 매니큐어로 밀봉하여 형광현 미경하(200×)에서 세포수를 조사하였다.
- 체외수정이 완료된 수정란은 pipetting 및 배발달 배양액으로 3회 세척하여 잔류된 난구 세포와 투명대부착정자를 제거한 후, 각각의 첨가군별로 4-well dish(Nunc, Denmark)에 500 ㎕ /well의 배발달 배양액을 넣고 well당 40～50개의 수정란을 넣어 39℃, 5％ CO₂및 포화습도의 탄산가스배양기 내에서 각각 배양하여 체외배발달을 유도하였다. 체외배양 2일째에 난할률을 조사하였고, 6일 및 7일째 배반포 발달률을 조사하였다. 이상과 같은 모든 실험은 37℃로 조정된 현미경가온판 위에서 실시하였다.
- 체외성숙 기본배양액인 NCSU-23에 EGF를 각각 1, 5 및 10 ng/ml을 첨가한 배양액에 돼지 난포란을 44시간동안 배양한 후에 체외성숙률을 조사하였고, 이어서 수정배양액인 mTBM에 6시간동안 정자와 함께 배양하여 체외수정을 유도하고, 이에 따른 핵성숙률, 자웅전핵형성률, 다정자 침입률 및 난자당 침투정자수를 조사한 결과는 Table 1과 같다.
- 체외성숙 기본배양액인 NCSU-23에 IGF-Ⅰ을 각각 1, 5 및 10 ng/ml을 첨가한 배양액에 돼지 난포란을 44시간동안 배양한 후에 체외성숙률을 조사하였고, 이어서 수정배양액인 mTBM에 6시간동안 정자와 함께 배양하여 체외수정을 유도하고, 이에 따른 핵성숙률, 자웅전핵형성률, 다정자 침입률 및 침투정자수를 조사한 결과는 Table 6 과 같다.
- 4% BSA(A0281, Sigma)가 함유된 NCSU-23을 기본배양액으로 사용하였다. 체외수정이 완료된 수정란은 pipetting 및 배발달 배양액으로 3회 세척하여 잔류된 난구 세포와 투명대부착정자를 제거한 후, 각각의 첨가군별로 4-well dish(Nunc, Denmark)에 500 ㎕ /well의 배발달 배양액을 넣고 well당 40～50개의 수정란을 넣어 39℃, 5％ CO₂및 포화습도의 탄산가스배양기 내에서 각각 배양하여 체외배발달을 유도하였다. 체외배양 2일째에 난할률을 조사하였고, 6일 및 7일째 배반포 발달률을 조사하였다.
- 운동성을 가진 부유된 정자들을 회수하여 450g에서 3분간 원심분리를 실시한 다음, 침전된 정자를 체외 수정용 배양액으로 재차 희석하였다. 희석된 정자는 성숙난자가 들어 있는 소적에 최종농도가 1.5 × 105 sperm/ml이 되도록 각각 10 ㎕씩 주입한 후 39℃, 5％ CO2및 포화습도의 CO2배양기 내에서 5～6시간 동안 체외 수정을 실시하였다.
대상 데이터
- 난포란의 채취를 위한 난소는 도축 직후의 미경산돈(체중 120 ㎏내외)으로부터 적출하여 75 ㎍/㎖ penicillin G와 50 ㎍/㎖ streptomycin sulfate(Sigma, USA)를 첨가한 38℃의 멸균생리 식염수로 2회 세척한 후, 멸균생리식염수가 충만된 보온병에 침지하여 60분 이내에 실험실로 운반하였다. 그리고 재차 신선 멸균생리식염수로 2～3회 세척한 다음, 100 ml 비이커에 담아 38℃로 조정되어 있는 온수조에 넣어 실험에 공시하였다.
- 돼지 체외수정란의 배양은 0.4% BSA(A0281, Sigma)가 함유된 NCSU-23을 기본배양액으로 사용하였다. 체외수정이 완료된 수정란은 pipetting 및 배발달 배양액으로 3회 세척하여 잔류된 난구 세포와 투명대부착정자를 제거한 후, 각각의 첨가군별로 4-well dish(Nunc, Denmark)에 500 ㎕ /well의 배발달 배양액을 넣고 well당 40～50개의 수정란을 넣어 39℃, 5％ CO₂및 포화습도의 탄산가스배양기 내에서 각각 배양하여 체외배발달을 유도하였다.
- 체외성숙용 배양액은 North Carolina State University(NCSU)-23 (Petters 등, 1993)을 기본 배양액으로 하여 돼지난포액 10%, Pregnant Mare`s Serum Gonadotropin(PMSG) 10 IU/㎖, Human Chorionic Gonadotropin(hCG) 10 IU/㎖ 를 첨가하여 사용하였다. 돼지 난포액은 6 ㎜ 이상 크기의 난포에서 난포액을 채취하여 3,000rpm, 4℃의 저온하에서 30분간 원심분리하고, 0.
- 체외수정용 배양액은 modified Tris-buffered medium(mTBM)을 기본 배양액으로 2.5 mM caffeine(Sigma, USA)과 0.1％ BSA(A7888, Sigma, USA)가 함유된 mTBM용액을 사용하였고 (Abeydeera와 Day, 1997), 정액의 세정액으로는 Dulbecco`s Phosphate-Buffered Saline(DPBS; Gibco, Life Technologies Inc., Grand Island, NY, USA)에 0.1％ BSA가 첨가된 배양액을 사용하였다. 44시간 동안 체외성숙된 돼지 난포란은 0.
데이터처리
- 본 연구에서는 각 첨가군에 대하여 4회이상 반복실험을 실시하였으며, 얻어진 모든 실험결과의 통계처리는 SAS/STAT 6.03 package를 이용하 여 분산분석(ANOVA)을 실시한 후, Duncan`s 다중검정(DMRT)에 의하여 첨가군간 유의성을 검정하였으며, P<0.05 이하의 유의성만을 통계학적 차이가 있는 것으로 인정하였다.
이론/모형
- 각각의 첨가군별로 44시간 동안 성숙배양시킨 난포란의 일부를 Byun 등(1991)의 방법에 따라 난자급속염색법(Rapid Staining Method)으로 염색하여 핵성숙단계를 비교 판정하였다. 염색방법을 요약하면 0.
- 체외수정을 실시하여 생산한 돼지 수정란은 Machaty 등(1998)의 이중형광염색방법으로 내부 세포괴(inner cell mass, ICM)세포와 영양배엽 (trophectoderm, TE)세포를 구별하였다. 간단히 요약하면, 수정란의 투명대를 0.
- 고정이 끝난 난포란의 염색은 염색액을 고정액과 같은 방법으로 주입하여 2～3분간 염색을 실시한 후, 탈염제(glacial acetic acid : distilled water : glycerol = 1 : 3 : 1)를 흘려 난세포질 이외의 염색액을 제거시킨 다음, 위상차현미경(400～1,000×)으로 난포란의 핵성숙 단계를 판정하였다. 핵성숙단계의 판정은 Hunter와 Polge(1966)의 방법에 준하여 실시하였다.
성능/효과
- 1. 돼지 난포란을 체외성숙배양액인 NCSU-23 배양액에 EGF와 IGF-Ⅰ을 각각 0, 1, 5 및 10 ng/ml 첨가배양하여 성숙을 유기한 다음, 체외수정을 실시한 결과, 모든 처리구에서 핵 성숙률, 정자침투율, 웅성전핵형성률, 다정자 침입률 및 평균침입정자수에서 유의적인 차이가 인정되지 않았다.
- 2. 체외수정을 실시한 후, 배발달배양액인 NCSU-23에 7일간 배양한 결과, 배반포형성률은 EGF첨가군이 각각 11.2±1.5%, 15.0±0.8%, 16.8±2.8% 및 21.4±2.0%로서 10 ng/ml의 첨가군이 유의적(P<0.05)으로 높은 결과를 나타냈으며, IGF-Ⅰ첨가군도 10.7±1.4%, 12.8±2.0%, 16.0±2.5% 및 21.9±2.4%로서 10 ng/ml의 첨가군이 유의적으로 높은 결과를 나타냈다. 또 한, 총세포수에 있어서도 EGF첨가군이 22.
- 3. 돼지 난포란을 체외성숙 기본배양액인 함유된 NCSU-23 배양액에 44시간동안 체외성숙을 유기한 다음, 체외 수정용배양액인 mTBM에 정자와 같이 6시간동안 공배양함으로서 체외 수정을 유기한 후, 배발달배양액인 NCSU-23 에 EGF와 IGF-Ⅰ을 각각 0, 1, 5 및 10 ng/ml 첨가하여 7일간 배양한 결과, 배반포기 도달률은 EGF첨가군에서 각각 14.0±1.7 개, 16.2±1.4개, 16.9±1.2개, 23.1±1.6개로서 10 ng/ml 첨가군이 유의적으로 높은 결과를 나타냈고, IGF-Ⅰ첨가군도 각각 13.6±1.7개, 15.7±4.5개, 16.0±0.2개 및 25.0±0.8개로 10 ng/ml군이 유의적(P<0.05)으로 높은 결과를 나타냈으며, 총세포수에 있어서는 EGF첨가 군이 각각 21.8±2.9개, 25.2±2.8개, 39.7±2.7개 및 46.2±3.6개로 10 ng/ml첨가군이 유의적으로 높은 결과를 나타냈고, IGF-Ⅰ첨가군도 20.7±2.9개, 26.2±2.9개, 24.6±2.4개 및 46.1±3.5 개로 10 ng/ml 첨가군이 유의적(P<0.05)으로 높은 결과를 나타냈다.
- EGF처리에 따른 돼지난포란의 체외성숙률은 10 ng/ml 첨가군에서 97.2±3.4%로 가장 높은 수치를 나타냈지만, 무첨가 대조군이 93.5±3.2%에 비하여 유의성이 인정되지 않았으며, 첨가군 상호간에도 유의성이 인정되지 않았다.
- IGF-Ⅰ처리에 따른 돼지난포란의 체외성숙률은 10 ng/ml 첨가군에서 95.3±2.7%로 가장 높은 수치를 나타냈지만, 무첨가 대조군이 93.0±3.9% 에 비하여 유의성이 인정되지 않았으며, 첨가군 상호간에도 유의성이 인정되지 않았다.
- 4%의 범위에 있어 유의적인 차이가 인정되지 않았다. 그러나 초기배발달에 있어서는 체외배발달 6일째 배반포기 도달률은 대조군이 13.8±0.6% 처리군은 각각 14.4±2.4%, 15.5±0.8% 및 20.3±1.1%를 나타냈는데 10 ng/ml 첨가군이 유의적(P<0.05)으로 높았으며, 배발달 7일째에도 대조군 14.0±1.7%에 대하여 EGF첨가군은 각각 16.2±1.4%, 16.9±1.2%, 23.1±1.6%로서 6일째와 마찬가지로 10 ng/ml 첨가군에서 유의성(P<0.05)이 인정되었다.
- 2%로서 유의적인 차이가 인정되지 않았다. 그러나, 초기배발달에 있어서는 체외배발달 6일째 배반포기 도달률은 대조군이 8.6±0.4% 처리군은 각각 9.7±1.9%, 13.4±2.4% 및 19.9±1.7%를 나타냈는데 10 ng/ml 첨가군이 유의적(P<0.05)으로 높았으며, 배발달 7일째에도 대조군 10.7±1.4%에 대하여 IGF-Ⅰ첨가군은 각각 12.8±2.0%, 16.0±2.5%, 21.9±2.4%로서 6일째와 마찬가지로 10 ng/ml 첨가군에서 유의성(P<0.05)이 인정되었다.
- 따라서 돼지 체외수정란을 체외배양할 때 IGF-Ⅰ 10 ng/ml첨가배양은 배반포에 이르는 초기배발달 및 세포수에 효과적으로 작용하는 것으로 조사되었다.
- 05)으로 높은 배반포 도달률을 나타냈다. 또한, 배발달 7일째의 배반포기 수정란의 내부세포괴(inner cell mass, ICM)세포, 영양배엽 (trophctoderm, TE)세포 및 총세포수를 조사한 결과, 내부세포괴세포는 10.0±5.0개에서 13.2±2.4 개로서 유의성이 인정되지 않았으나, 영양배엽세포는 대조군 11.5±2.5개에 대하여 첨가군은 각각 13.5±2.8개, 11.9±2.4개, 20.0±3.5개로서 10ng/ml 첨가군이 유의적(P<0.05)으로 높은 수를 나타냈다. 또한 총세포수에 있어서도 첨가군이 각각 25.
- 05)이 인정 되었다. 또한, 배발달 7일째의 배반포기 수정란의 내부세포괴(inner cell mass, ICM)세포, 영양배엽 (trophctoderm, TE)세포 및 총세포수를 조사한 결과, 내부세포괴세포는 모든 첨가군간 12.6±1.8 개부터 13.8±1.6개의 범위내에 있으면서 유의성이 인정되지 않았으나, 영양배엽세포는 대조군 11.3±2.2개에 대하여 첨가군은 각각 13.1±4.5개, 12.6±3.9개, 21.3±4.0개로서, 10 ng/ml 첨가군이 유의적(P<0.05)으로 높은 수를 나타냈다. 또한 총세포수에 있어서 첨가군이 각각 25.
- 수정후 48시간째 난할률은 첨가군간 68.2±5.3% 에서 71.4±6.8%로서 유의성이 인정되지 않았으나, 배반포기 도달률에 있어서는 배발달 6일째 대조군의 경우에는 8.9±1.2%, EGF의 첨가군은 각각 12.9±0.9, 14.3±2.6% 및 20.3±1.3%이었고, 배발달 7일째에는 대조군 11.2±1.5%에 비하여 EGF첨가군은 각각 15.0±0.8%, 16.8±2.8% 및 21.4±2.0%로서 높은 배반포도달률을 나타냈는데, 10 ng/ml 첨가군에서는 유의성(P<0.05)이 인정 되었다. 또한, 배발달 7일째의 배반포기 수정란의 내부세포괴(inner cell mass, ICM)세포, 영양배엽 (trophctoderm, TE)세포 및 총세포수를 조사한 결과, 내부세포괴세포는 모든 첨가군간 12.
- 수정후 48시간째 난할률은 첨가군간 69.2±5.4% 에서 72.4±7.7%로서 유의성이 인정되지 않았으나, 배반포기 도달률에 있어서는 배발달 6일째 대조군의 경우에는 8.6±0.4%, 첨가군이 각각 9.7±1.9%, 13.4±0.9%, 및 19.9±1.7%, 배발달 7일 째에는 대조군의 경우에는 10.7±1.4%으로 나타났고, 첨가군은 각각 12.8±2.0%, 16.8±2.5% 및 21.9±2.4%으로서 모두 10 ng/ml 첨가군이 유의적(P<0.05)으로 높은 배반포 도달률을 나타냈다. 또한, 배발달 7일째의 배반포기 수정란의 내부세포괴(inner cell mass, ICM)세포, 영양배엽 (trophctoderm, TE)세포 및 총세포수를 조사한 결과, 내부세포괴세포는 10.
- 6개를 나타냈다. 이러한 결과들을 통계분석한 결과는 ICM세포, TE 세포 및 총세포수 모두에서 EGF 10 ng/ml첨가군이 유의적(P<0.05)으로 높은 세포수를 갖는 것으로 나타났다.
- 5개를 나타냈다. 이러한 결과들을 통계분석한 결과는 ICM세포, TE 세포 및 총세포수 모두에서 IGF-Ⅰ 10 ng/ml 첨가군이 유의적(P<0.05)으로 높은 세포수를 갖는 것으로 나타났다.
- 이러한 결과를 보면, 돼지 난포란을 체외성숙 시 IGF-Ⅰ의 첨가배양은 핵성숙률이나 자ㆍ웅전핵 형성율에는 영향을 미치지 않았으나, 6～7일 동안 배발달을 유기한 결과 10 ng/ml 첨가군에 서 배반포 도달률 및 총세포수에서 유의적 (P<0.05)으로 높은 결과를 나타내어 체외성숙시에 첨가배양하는 것이 적합한 것으로 조사되었는데, 이러한 결과는 Rieger 등(1998)이 소체외성숙 배양액에 IGF-Ⅰ을 첨가시 높은 배발육을 보였다는 보고와 합치점을 찾을 수 있는 결과라고 사료된다.
- 이러한 결과를 종합하면, 돼지 난포란을 체외 성숙시킬 때 EGF의 첨가배양은 핵성숙률이나 자ㆍ웅전핵 형성률에는 영향을 미치지 않았으나, 6～7일동안 배발달을 유기한 결과 10 ng/ml 첨가군에서 배반포 도달률 및 총세포수에서 유의적 (P<0.05)으로 높은 결과를 나타내어 체외성숙시 에 EGF를 첨가배양하는 것이 배발달에 효과적인 것으로 확인되었는데, 이러한 결과는 사람 미성숙 난포란의 체외배양에서 EGF를 첨가한 첨가군이 무첨가군에 비하여 높은 배발달률을 나타냈다고 한 보고(Gomez 등, 1993)나 돼지에서 EGF에 의하여 난자핵 성숙이 촉진된다는 보고 (Sommer, 1992)와 합치점을 찾을 수 있는 결과라고 생각된다.
- 체외수정 후 48시간 째 난할률을 조사한 결과 대조군을 포함한 모든 처리군에서 74.0±7.8%에서 78.9±2.2%로서 유의적인 차이가 인정되지 않았다. 그러나, 초기배발달에 있어서는 체외배발달 6일째 배반포기 도달률은 대조군이 8.
- 체외수정 후 48시간째에 난할률을 조사한 결과 대조군을 포함한 모든 처리군에서 73.0±7.2%로 부터 79.0±2.4%의 범위에 있어 유의적인 차이가 인정되지 않았다. 그러나 초기배발달에 있어서는 체외배발달 6일째 배반포기 도달률은 대조군이 13.
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