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문제 정의
- 7에서 LPS(Lipopolysaccharide) 에 유도된 NF・kB의 활성화에 의해 생성되는 IL-lft TNF-a, Ⅱ.-6 의 발현도를 측정하기 위해서 본 연구에서는 RT-PCR 방법을 이용하여 溫淸飮에 대한 염증성 cytokine인 IL-ip, TNF-a, IL-6의 유전자 발현도 억제 효과를 확인하고자 하였다.
- 溫淸飮과 三黃洗劑加味方의 아토피 치료 기전을 규명하고자, NC/Nga 생쥐의 동물 병태 모델을 이용하여 다양한 면역 반응을 관찰하였던 바, 다음과 같은 결론을 얻었다.
- 천연물에서는 문 등이 230여 종의 생약에 대해 COX-2 활성 억제에 관하여 검색하였다. 본 연구에서는 溫淸飮에 대한 COX-2 억제활성 효과를 확인하고자 하였다. 항염증 효과에 대한 실험에서는 LPS(1 ㎍/ml)를 사용하여 대식세포 주인 RAW 264.
- 민20) 은 내 . 외치 병용치료가 아토피 생쥐 병태 모델에 미치는 영향에 대한 실험적 시도를 하였다.
- 서의학적 문헌 고찰을, 尹時는 아토피 피부염 환자의 한의학적인 임상 유형 분류에 대한 연구를 보고하였고, 단일 한약제에 대한 실험적 연구로 金은 桑葉이, 韓均은 牛莠子, 金町은 紫草가 아토피 피부염에 미치는 영향을 보고하였으며, 처방에 대한 연구로 金은 ”加味生料四物湯”, 朴은 "消風散”, 金은 "沆漆丹”, 朴은 "消風淸營湯加味方" 을 시료로 면역 조절작용을 통한 항 아토피 효과를 규명한 바가 있으며, 민은 내 . 외치 병용치료가 아토피 생쥐 병태 모델에 미치는 영향에 대한 연구를 하였다.
- 저자는 溫淸飮과 三黃洗劑加味方의 병용치료 연구로 NC/Nga 생쥐 병태 모델을 이용, 다양한 면역학적 기전을 관찰하였던 바, 유의한 결과를 얻었기에 보고하는 바이다.
가설 설정
-
3. 혈청 중 IL-4, IL-5 발현에 미치는 영향.
- Histologic features of skin lesion in NC/Nga mice, a : sKin tissues from Balb/c mouse. B : skin tssues from NC/Nga mouse with no treatment. C : skn tissues from NC/Nga mouse with OC and SG treatment.
- A: ear tissues from Balb/c mouse. B: ear tissues from NC/Nga mouse wth no treatment. C- ear tissues from NC/Nga mouse with OC and SG treatment.
제안 방법
- LPS(㎍/ml)를 사용하여 대식세포주인 RAW 264.7(1 xlO6 cell)의 COX-2 활성을 유도한 모델에서 溫淸飮을 50, 100, 200ppm 농도로 24시간 처리하여 COX-2 발현 정도를 Western Blot 수행하여 분석하였다. LPS 단독 처리군에 비해 溫淸飮을 농도 의존적으로 억제됨을 확인하였다.
- MTT 정량방법을 이용하여 10, 50, 100, 200, 300, 500, WOOppm 농도의 溫淸飮을 포함된 배양액에서 L929 세포를 24시간 배양 후 세포증식률을 측정하여 대조군과 비교하였다(Fig. 13). 溫淸飮이 10, 50, lOOppm농도에서는 세포증식률이 대조군에 비해 변화가 없었으며, 200ppm과 300ppm에서는 세포생존률 대조군에 비해 13, 25%이하로 감소하였다.
- Mosmann의 방법에 따라 배양한 세포주를 각각 5X103 cell/㎖이 되도록 96 well plate에 분주하여 24시간 배양 후 이들 세포를 10, 50, 100, 200, 300, 500, 1000 ppm 농도의 溫淸飮이 포함된 배양액에서 24시간 배양 후 MTT 200 ㎕/㎖ 가 포함된 배양액을 well 당 200㎕씩 넣은 후 다시 3시간 동안 배양하였다. 배양 후 배양액을 버리고 DMSO를 10 0㎕/well씩을 넣어 5분간 실온에 방치하며 Formazan을 용해한 후 microplate Reader로 흡광도 570 nm에서 측정한다.
- 충분히 적실 정도로 분무하였다. NC/Nga 대조군은 생리식염수를 溫淸飮과 같은 용량, 용법으로 경구 투여하였으며, 외용제 또한 생리식염수를 실험군과 같은 방법으로 도포하였다.
- NC/Nga 생쥐의 얼굴과 목 부위를 제모한 뒤 피부 조직을 각각 1 g씩 떼어내어 DMEM 배양액으로 수세하여 미세조각으로 잘게 썬 후 10% FBS-DMEM으로 Petri-dish에서 7일간 배양하였다. 이후 배양 상층 액을 제거하고 다시 10% FBS-DMEM으로교체하였다.
- NC/Nga 실험군은 溫淸飮을 8주간 주 3회(월, 수, 금) 경구투여(250 ㎎/㎏) 하였으며, 三黃洗劑加味方은 매일 2회 등 부위를 충분히 적실 정도로 분무하였다. NC/Nga 대조군은 생리식염수를 溫淸飮과 같은 용량, 용법으로 경구 투여하였으며, 외용제 또한 생리식염수를 실험군과 같은 방법으로 도포하였다.
- RAW 264.7(1x106 cell)을 60mm plate에서 배양한 후 LPS(1 ㎍/ml)를 처리한 후 溫淸飮(OC) 10, 50, 100 ppm을 24시간 처리한다. 24시간 처리 후 배양액을 제거하고 세포를 lysis bufer(RIPA buffer에 protease inhibitors 처리하고, cell scraper로 세포를 모은 후, 얼음에서 30분간 반응 후, 4℃, 12000 rpm에서 원심 분리하여, 상층 액을 따서 BCA 방법으로 단백질 정량을 한다.
- 溫淸 飮을 투여 8주째 NC/Nga 생쥐를 ethyl ether로 마취한 후 심장 천자법으로 혈액을 채혈하여 혈청을 분리한 후 혈청 중 IL-4, 5, 6, INF-L IgM, IgGl 량을 ELISA kit로 정량하였다.
- 溫淸飮 7첩(350 g)에 증류수 1000 ml를 가하여 열탕 추출기에서 3시간 전탕 후 추출하여 얻은 액을 흡입 여과하여 이를 감압 증류 장치로 농축하였다.
- 18㎕ Taq polymerase (5 U/必)를 첨가한 다음 최종 부피가 40 以가 되도록 멸균증류수를 가하고 pre-denaturation; 95 ℃, 5분 denaturation; 95℃, 5분, annealing; 55℃Z 1분 elongation; 72℃, 1 분을 25 cycle한 뒤 post-elongation을 72℃에서 3분 동안의 조건으로 PCR을 수행하였다. 각 PCR product는 20 ㎕씩 1.2% agarose gel에 loading하여 120 V 조건에서 20분간 전기영동을 통하여 분석하였다.
- 유발하였다. 먼저 NC/Nga 마우스의 등부위를 깨끗이 제모한 후 피부의 미세 상처가 치유되도록 24시간 방치하였다. 실험 4일 전 1% DNCB용액(acetone:olive oil=3:l) 200 ㎕를 등 부위에도포하고 실험 시작일 부터 종료일까지 8주간 일주일에 2번 0.
- 배양 후 RNA를 분리한 후 이를 이용하여 cDNA를 합성하여 LPS에 의해 생성된 cytokine의 측정하기 위해서 RT-PCR을 수행하였다. RT-PCR 결과 IL-고은 House keeping gene인 P -actin의 양과 비교 측정시 Table 3.
- 본 실험은 溫淸飮과 三黃洗劑加味方을 이용하여 in vivo 실험으로 아토피 유발 모델인 NC/Nga mice 에 대해 아토피 유발억제 및 항염증 효능에 대한 실험(in vitro)으로, 溫淸飮을 구강 투여하고, 三黃洗劑加味方 분무를 8주령부터 일 2회 실시하여 8 주부터 16주까지 2, 3, 3주(10, 13, 16주) 간격으로 NC/Nga mice 의 피부 손상정도를 측정하였다. 그 결과 대조군은 10주에 4.
- xylene 처리 후 파라핀에 조직을 담아고 조직을 고정하여 파라핀이 충분히 굳은 후에 조직을 5 ㎕로 절편하여 슬라이드 글라스에 붙여서 37℃에서 24시간 동안 두어 조직이 슬라이드 글라스에 완전히 접착되도록 하였다. 슬라이드 글라스를 xylene에 담가 파라핀을 녹인 후, eth&no로재수화시켜 hematoxylin -eosin(H&E) 염색을 실시하였다.
- 먼저 NC/Nga 마우스의 등부위를 깨끗이 제모한 후 피부의 미세 상처가 치유되도록 24시간 방치하였다. 실험 4일 전 1% DNCB용액(acetone:olive oil=3:l) 200 ㎕를 등 부위에도포하고 실험 시작일 부터 종료일까지 8주간 일주일에 2번 0.2% DNCB용액 150 ㎕를 등 부위에 도포하였다.
- 아토피 피부염은 1-chloro 2, 4-dinitrobenzene(DNCB)을 이용하여 유발하였다. 먼저 NC/Nga 마우스의 등부위를 깨끗이 제모한 후 피부의 미세 상처가 치유되도록 24시간 방치하였다.
- 역전사중합연쇄반응은 역전사 kit와 중합연쇄반응 kit를 이용하여 실시하였다. 즉 rapid guanidium isothiocyanate 방법으로 마우스 대식세포주로부터 추출한 0.
- 염증반응의 중요한 cytokine들인 IL-lg, TNF-a , IL-6의 발현 도를 분석하기 위해서 마우스 대식세포주 RAW 264.7에 溫淸飮 을 10, 50, lOOppm으로 LPS(0.㎍/ml)로 자극하기 30분 전에 처리하고 20시간 배양하였다(Fig. 14).
- 평가항목은 홍반(으rythema), 찰상(Abrasion), 부종과 혈종(Edema & excoriation), 짓무름(Erosion), 그리고 태선화(Lichenification) 로 나누어진다. 이 각각의 항목은 없음(0), 약함(1), 중증도(2), 심함(3)으로 나누어서 채점하였다.
- 이후 배양 상층 액을 제거하고 다시 10% FBS-DMEM으로교체하였다. 이를 7일간 배양하여 배양 상층 액을 분리한 후 배양액 내의 IL-6 분비량을 ELISA kit로 측정하였다.
- 이후 배양 상층 액을 제거하고 다시 10% FBS-DMEM으로교체하였다. 이를 7일간 배양하여 배양 상층 액을 분리한 후 배양액 내의 IL-6 분비량을 ELISA kit로 측정하였다.
- 저자는 또한, 苦寒無毒하여 瀉火解毒, 淸熱燥濕의 효능이 있어3°如 內服藥과 外用藥으로 피부과 질환에 多用하는 大黃, 黃苓, 黃柏과 苦蔘, 金銀花, 連翹, 馬齒竟등의 淸熱解毒, 殺菌止痛 약물을 가미하여 1.5 L의 증류한약으로 만들어 분무하며 외용제로 사용하였다. 이용하여 외용제로 사용하였다.
- 실시하였다. 즉 rapid guanidium isothiocyanate 방법으로 마우스 대식세포주로부터 추출한 0.5 ug의 total RNA를 역전사반응액 과 혼합하여 42℃에서 30분간 반응시켜 cDNA를 합성하였다. 합성한 cDNA lpl(0.
- 처리농도별로 사용한다. 처리농도는 10, 50, 100, 200, 300, 500, 1000 ppm로 처리하고, 처리시간은 24시간으로 실시하였다.
- 혈청내 IgE 량은 8주, 10주, 13주, 16주에 생쥐의 눈에서 capillary tube를 이용하여 약 100ul의 혈액을 채혈한 후 원심분리기로 혈청을 분리하여 IgE 량을 ELISA Kit로 측정하였다. 溫淸 飮을 투여 8주째 NC/Nga 생쥐를 ethyl ether로 마취한 후 심장 천자법으로 혈액을 채혈하여 혈청을 분리한 후 혈청 중 IL-4, 5, 6, INF-L IgM, IgGl 량을 ELISA kit로 정량하였다.
대상 데이터
- Ⅳ., RPMI-1640, isopropanol, 적혈구용혈액, EtBr, D-PBSZ DMEM, MgCh/ agarosez FBS, RNase inhibitor, Taq polymerase, random primer, dNTP, Moloney murine leukemia virus reverse transcriptase, IL-4, 5, 6, IFN-r의 ELISA kit, IgE, IgM, IgGl의 ELISA kit RNAzolB는 invitrogen을 사용하였고, 그 외 사용된 시약은 Duksan(korea)에서 구입하여 사용하였다.
- 본 실험에 사용된 시약으로 DEPC, NHYl, KHCO3/ Na2 EDTA, complete adjuvant chloroform, collagenas 은 Ⅳ., RPMI-1640, isopropanol, 적혈구용혈액, EtBr, D-PBSZ DMEM, MgCh/ agarosez FBS, RNase inhibitor, Taq polymerase, random primer, dNTP, Moloney murine leukemia virus reverse transcriptase, IL-4, 5, 6, IFN-r의 ELISA kit, IgE, IgM, IgGl의 ELISA kit RNAzolB는 invitrogen을 사용하였고, 그 외 사용된 시약은 Duksan(korea)에서 구입하여 사용하였다.
- 본 실험에 사용한 溫淸飮(OQ과 三黃洗劑加味方(SG)의 약제는 원광대 한방병원에서 구입한 후 정선하여 사용하였고, 溫淸飮 1첩 및 三黃洗劑加味方의 내용과 구성은 다음과 같다(Table L 2).
- 응성(雄性) 6주령의 Balb/cz NC/Nga mouse를 중앙실험동물에서 공급받아 실험당일까지 고형사료와 물을 공급하고 실온 22±2℃, 상대습도 50-65%, 조도 200 lux(8시 점등, 20시 소등)를계속 유지하면서 2주일간 실험실 환경에 적응시킨 후 실험에 사용하였다.
데이터처리
- 통계학적 유의성 검정은 one-way ANOVA (Analysis of Variance) 방법을 사용하였으며, 유의수준 p<0.01의 범위 내에서 그 결과들은 평균에 대한 표준 편차로 나타낸다.
이론/모형
- NC/Nga 마우스의 피부염은 아토피성 피부염에서 일반적으로 사용되는 임상적 육안 평가법을 이용하였다. 육안평가 결과는 다음의 5가지 항목을 각각 평가한 점수의 총 합으로 나타낸다.
- PCRe GeneAmp PCR system 2400을 이용하여 수행하였다. 반응은 이미 합성된 3 ㎕의 cDNA를 주형으로 사용하고, 주형에 대한 primer는 P-actin, IL-4Z IL-5, IL-6, IL-13, CCR3, IFN-y 유전자를 증폭하기 위하여 sense primer (20 pmol/㎕와 antisense primer (20 pmol/㎕를 혼합하여 1 ㎕를 가하고, 다시 3 ㎕ 2.
성능/효과
- Chemokine 인 CCR3 mRNA 발현은 정상군이 1 (IF), NC/Nga 대조군이 1.92 (IF)로 나타났고, 실험군이 0.60 (IF) 으로나타나 대조군에 비하여 현저히 감소하였다(Fig. 11).
- Conventional 조건에서는 8주부터 16주까지 2, 3, 3주(10, 13, 16주) 간격으로 피부 손상정도를 측정한 결과 대조군은 10주에 4.71+0.80, 13주에 7.28±0.78로 급격한 증가를 나타내었으며, 실험종료 전 16 주령은 9.40±0.83로 나타났다. 이에 반해 실험군은 10 주까지는 대조군과 약간 감소한 3.
- LPS 단독 처리군에 비해 溫淸飮을 농도 의존적으로 억제됨을 확인하였다. Fig. 15.에서 같이 10, 50ppm을 처리한 군에서 33, 40% 정도 발현 억제 효과가 나타남을 확인하였고, lOOppm에서는 55%정도의 COX-2 발현 억제 효과가 있는 것으로 나타냈었다(Fig. 15).
- IFN-Y mRNA 발현은 정상군이 1 (IF), NC/Nga 대조군이 1.10 (IF)로 나타났고, 실험군이 4.11 (IF)으로 나타나 대조군에 비하여 현저히 증가하였다(Fig. 9).
- IL-5와 더불어, 피부 염증 부위에 만성으로 침윤이 일어나는 Th2, 호산구, 중성구 및 mast 세포 등에서 발현되는 CCR3 발현 또한 대조군에 비하여 3배 정도 발현이 감소하였다(Fig. 11).
- 7(1 xlO6 cell)의 COX-2 활성을 유도한 모델에서 溫淸飮을 50, 100, 200ppm 농도로 24시간 처리하여 COX-2 발현 정도를 Western Blot 수행하여 분석하였다. LPS 단독 처리군에 비해 溫淸飮을 농도 의존적으로 억제됨을 확인하였다. Fig.
- NC/Nga 생쥐 16주령 후 비장을 적출하여 무게를 측정한 결과, 정상군은 0.156+0.017 g, NC/Nga 대조군은 0.162±0.029 g, 실험군은 0.137±0.027 g로 유의성 있는 (p<0.05) 감소를 나타냈다 (Fig- 7).
- 가하였다. NC/Nga 생쥐의 귀등 피부 조직 변화에서는 표피와 진피의 염증 정도와 침윤된 염증 면역 세포 등은 실험군이 대조군에 비해 현저하게 감소되었다. RAW 264.
- NC/Nga 생쥐의 피부 손상 정도는 13주와 16주에 실험군 이대 조 군에 비해 각각 37.2%, 46.8% 감소하였다. NC/Nga 생쥐의 혈중 IgE, IL-4, IL-5, IL-6, IgM 및 IgGl 수준은 실험군이 대조군에 비하여 유의성 있게 감소하였고, IFN-r 수준은 실험군이 대조군에 비해 유의성 있게 증가하였다.
- NC/Nga 생쥐의 비장 무게는 실험군이 대조군에 비해 유의성 있게 감소하였다. NC/Nga 생쥐의 피부 조직 배양에서 IL4, IL-5, CCR3 유전자 발현은 실험군이 대조군에 비하여 현저히 감소하였고, IL-6 발현량은 유의성 있게 감소하였으며, IFN-y의 유전자 발현은 실험군이 대조군에 비해 증.가하였다.
- 8% 감소하였다. NC/Nga 생쥐의 혈중 IgE, IL-4, IL-5, IL-6, IgM 및 IgGl 수준은 실험군이 대조군에 비하여 유의성 있게 감소하였고, IFN-r 수준은 실험군이 대조군에 비해 유의성 있게 증가하였다. NC/Nga 생쥐의 비장 무게는 실험군이 대조군에 비해 유의성 있게 감소하였다.
- NC/Nga 생쥐의 귀등 피부 조직 변화에서는 표피와 진피의 염증 정도와 침윤된 염증 면역 세포 등은 실험군이 대조군에 비해 현저하게 감소되었다. RAW 264.7에서 염증성 Cytokines 발현도에 대한 효과는 IL-ip, TNF-a, IL-6 유전자 발현은 실험군이 대조군에 비해 유의성 있게 감소하였다. RAW 264.
- 7에서 염증성 Cytokines 발현도에 대한 효과는 IL-ip, TNF-a, IL-6 유전자 발현은 실험군이 대조군에 비해 유의성 있게 감소하였다. RAW 264.7에서 항염증 효과는 COX-2 활성을 유도한 모델에서 실험군이 대조군예 비해 농도 의존적으로 억제되었다. 세포독성평가는 L929 세포에서 10, 50, 100 ppm농도에서는 세포증식률은 실험군이 대조군에 비해 변화가 없었으며, 200 ppm 농도 이상에서 세포 독성을 유발됨을 확인하였다.
- 5%로 나타나 溫淸飮의 농도 의존적으로 억제됨을 확인하였다. TNF-ae House keeping gene인 0-actin의 양과 비교 측정 시 Table 4에서 같이 溫淸飮을 10, 50, lOOppm의 처리하였을 때 TNF・ci의 발현량이 LPS에 비해 78.6%, 72.1%, 67.6%로 나타나 溫淸飮의 농도 의존적으로 억제됨을 확인하였다. IL-6은 House keeping gene인 P-actin의 양과 비교 측정시 Table 5.
- Thl 세포는 IFN-y와 같은 Th type 1 사이토카인(Thl cytokine ; proinflammatory cytokine)을 생산하여 박테리아 감염과 같은 intracellular pathogen에 대항하는 면역 반응에 관여한다 특히 Thl 세포에서 분비되는 IFN-y는 알레르기 반응을 일으키는 Th2 세포를 억제하는 것으로 알려져 있는데, 본 실험에서 혈청 중 IFN-x 수준은 대조군에 비하여 약 1.7배 로 유의성 있는 (p<0.01) 증가를 나타냈고(Fig. 4), skin lesion의 발현 결과에서는, IL-4 발현은 대조군에 비하여 약 1.5배(Fig. 8) 감소, IFN-y 발현은 NC/Nga 대조군에 비하여 3.7배 증가(Fig. 9), IL-5은 대조군에 비하여 약 L6배 감소(Fig. 10)하였으며, 역시 혈청 결과와 부합된 결과가 도출되었다.
- 溫淸飮과 三黃洗劑加味方을 처리한 NC/Nga mice의 혈액에서 IgE 수치는 13주와 16주에서 대조군에 비하여 약 64%와 65.3%의 유의성 있게(pO.Ol) 감소를 나타내었고(Fig. 2A), 혈중 IL-6 수치 역시 대조군에 비하여 16주에서 63.3%의 유의성 있는 (p<0.01) 감소를 나타냈다(Fig. 2B)
- 溫淸飮을 구강 투여하고, 三黃洗劑加味方 분무를 8주령부터 일 2회 실시하여 NC/Nga mice의 피부손상정도를 관찰한 결과, NC/Nga 생쥐가 자연적으로 피부염으로 유발된 conventional 조건에서는 10주 이후 피부 발진이 유발된 것을 알 수 있었다(Fig. 1A).
- 溫淸飮의 안전성을 확인한 실험으로 세포독성평가는 溫淸飮 이 10, 50, lOOppm농도에서는 세포증식률이 대조군에 비해 변화가 없었으며, 200ppm과 300ppm에서는 세포생존률 대조군에 비해 13, 25%이하로 감소하였다. 이는 溫淸飮이 L929 세포에 200ppm 농도 이상에서 세포 독성을 유발됨을 알 수 있었다.
- 결과적으로 본 시료가 Thl 세포의 IFN-r 생성 증가와 더불어 관련 면역세포 활성화를 통해 Th2 세포를 억제함으로써 IL-4, 5 등의 염증 관련 사이토카인 생성을 억제하고 이로 인해 IgE 생성 역시 억제됨으로써 조직 사진에서 나타난 바와 같은 유의성 있는 결과가 도출된 것으로 사료된다. 이 같은 결과는 기존의 면역학적 작용 기전과 부합됨으로써, 본 시료의 면역 조절 작용을 통한 항알러지 효과가 인정되며, 향후 약물 독성 평가(in vivo) 등의 안정성에 관한 연구가 필요하다 사료 된다.
- 피부 손상정도를 측정하였다. 그 결과 대조군은 10주에 4.71±0.80z 13주에 7.28±0.78로 급격한 증가를 나타내었으며, 실험종료 전 16 주령은 9.40±0.83로 나타났다. 이에 반해 실험군은 10 주까지는 대조군과 약간 감소한 3.
- 또한 혈중 IL-4 수치는 최종 16주령에서 NC/Nga 대조군에 비하여 49%(Fig. 3A), IL-5 수치는 46.3%(Fig. 3B)의 유의성 있는 (p<0.01) 감소를 나타냄으로써, 溫淸飮이 B 세포 분화에 수반되는 IgE, IL-6 발현과 Th2에서 분비되는 IL-4, IL-5 발현을 억제함을 확인하였다.
- 7에서 항염증 효과는 COX-2 활성을 유도한 모델에서 실험군이 대조군예 비해 농도 의존적으로 억제되었다. 세포독성평가는 L929 세포에서 10, 50, 100 ppm농도에서는 세포증식률은 실험군이 대조군에 비해 변화가 없었으며, 200 ppm 농도 이상에서 세포 독성을 유발됨을 확인하였다.
- 확장이 관찰되었다. 실험군에서는 대조군에 비하여 표피와 진피의 두께가 다소 줄어들었고, 표피의 각질화도 심하지 않은 것으로 관찰되었다(Fig. 16).
- 알레르기는 항체의 기준 표본을 IgM 또는 IgG에서 IgE로 바꾸어주는 Th2 세포가 활성화되면서 시작되는데, 본 실험에서 IgE의 생산과 관련되는 IgM과 B세포 분화 중에 비례적으로 증가되는 IgGl 등 치환된 면역 글로불린의 변화에서 모두 대조군에 비하여 유의성 있는 감소로(Fig. 5, 6), IgE 발현 결과와 부합됨으토써, 溫淸飮와 三黃洗劑加味方 시료가 Th2 세포 활성화 억제와 더불어 IgE 생산에 관련된 B 세포 분화를 억제하는 작용에 대한 연구 결과를 얻을 수 있었다.
- IL-6은 House keeping gene인 P-actin의 양과 비교 측정시 Table 5. 에서 같이 溫淸飮을 10, 50, lOOppmS] 처리하였을 때 IL-6의 발현량이 LPS 에 비해 69.6%, 66%, 65%로 나타나 溫淸飮 농도 의존적으로 억제됨을 확인하였다.
- RT-PCR 결과 IL-고은 House keeping gene인 P -actin의 양과 비교 측정시 Table 3. 에서 같이 溫淸飮을 10, 50, lOOppm의 처리하였을 때 IL-10의 발현량이 LPS에 비해 60.7%, 53%, 40.5%로 나타나 溫淸飮의 농도 의존적으로 억제됨을 확인하였다. TNF-ae House keeping gene인 0-actin의 양과 비교 측정 시 Table 4에서 같이 溫淸飮을 10, 50, lOOppm의 처리하였을 때 TNF・ci의 발현량이 LPS에 비해 78.
- 83로 나타났다. 이에 반해 실험군은 10 주까지는 대조군과 약간 감소한 3.14±0.77로 관찰되었고, 13주와 16주에는 각각 4.57±0.74와 5.00±0.76으로 나타나 대조군에 비하여 현저한 피부손상정도지표(Clinical skin severity score) 감소를 나타냈다(Fig. IB).
- 정상 Balb/c 생쥐의 귀 조직에서는 표피, 진피, 그리고 연골이 뚜렷하게 관찰되었으나, NC/Nga 대조군은 표피층이 두꺼워져 있고, 진피층은 콜라겐의 부종이 있고, Fibroblast의 증식 및 혈관의 확장이 관찰되었다. 실험군에서는 대조군에 비하여 표피와 진피의 두께가 다소 줄어들었고, 표피의 각질화도 심하지 않은 것으로 관찰되었다(Fig.
- 본 연구에서는 溫淸飮에 대한 COX-2 억제활성 효과를 확인하고자 하였다. 항염증 효과에 대한 실험에서는 LPS(1 ㎍/ml)를 사용하여 대식세포 주인 RAW 264.7(1 xlO6 cell)의 COX-2 활성을 유도한 모델에서 溫淸飮은 LPS 단독 처리군에 비해 溫淸飮의 농도 의존적으로 억제됨을 확인하였다. Fig.
후속연구
- 결과가 도출된 것으로 사료된다. 이 같은 결과는 기존의 면역학적 작용 기전과 부합됨으로써, 본 시료의 면역 조절 작용을 통한 항알러지 효과가 인정되며, 향후 약물 독성 평가(in vivo) 등의 안정성에 관한 연구가 필요하다 사료 된다.
- 이는 溫淸飮이 L929 세포에 200ppm 농도 이상에서 세포 독성을 유발됨을 알 수 있었다. 좀 더 안전성을 확인하기 위해서는 경구 아급성 독성, 급성 독성 등의 in vivo 실험을 수행해야 할 것으로 사료된다.
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