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문제 정의
- 이에 저자는 溫淸飮의 경구투여가 상처주위 조직에서 상처부위의 신생혈관의 형성을 촉진시켜 상처회복을 촉진할 것이라는 가설을 검증하기 위하여 실험적으로 흰쥐에 피부전층 상처를 유발한 후 溫淸飮 투여에 따른 상처 크기의 변화, 상처 부위의 조직학적 변화 및 모세혈관의 생성과 VEGF 단백질의 발현변화를 관찰한바 유의한 결과를 얻었기에 이에 보고하는 바이다.
가설 설정
- 19) 시간적으로 상처발생 12∼24시간에 상처부위는 혈괴(blood clot)로 채워지고 호중구(neutrophil)가 혈괴 속으로 들어가며, 손상 후 3∼7일에는 대부분의 호중구는 자연사(apoptosis)되어 사라지고 대신 대식세포(macrophage)가 손상조직에 많아지게 된다.20, 21) 내피세포들이 혈괴 속으로 들어가서 분화하여 새로운 혈관을 생성하고, 섬유모세포들은 상처조직으로 들어가서 분화하여 세포외기질을 축적하게 된다. 이렇게 만들어진 새로운 조직을 육아조직(granular tissue)이라 부른다.
제안 방법
- 세척이 끝난 조직을 ammonia water에 4∼5회 담근 후 다시 흐르는 물로 15분간 세척하고 eosin으로 10초간 염색반응을 유도하였다. 70, 80, 90, 95, 100% alcohol 및 xylene을 이용하여 탈수한 후 canada balsam을 이용하여 봉입하였다.
- H&E 염색을 하기 위해서 조직절편을 xylene을 이용하여 paraffin을 제거한 후 100, 95, 90, 80, 70, 60% alcohol로 10분간 함수시켰으며, 증류수로 세척하였다.
- 등쪽 피부를 정사각형(15×15㎜)을 작도한 후 멸균된 수술용 가위로 피하층까지 절개하여 피하조직을 분리하여 피부전층 상처를 유발하였다.
- 약물의 투여는 상처 유발일 부터 시작하여 15일간 매일 동일한 시간에 경구투여를 통해 시행하였다. 또한 상처부위의 감염을 방지하기 위해 매일 상처부위를 소독하였다.
- 상처유발 후 3, 7, 15일에 Control군과 Sample군에서 각 4마리씩 실험동물을 희생하여 상처부 전체가 포함된 조직을 채취하였다. 조직을 4% 중성 formalin 용액에 24시간 고정한 후 상처 중앙을 통과하는 절편을 취하여 탈수시킨 후 paraffin 블록에 포매하였다.
- 등쪽 피부를 정사각형(15×15㎜)을 작도한 후 멸균된 수술용 가위로 피하층까지 절개하여 피하조직을 분리하여 피부전층 상처를 유발하였다. 상처유발 후 상처 부위의 감염을 방지하기 위해 상처부 주위를 소독하고, PBS로 상처부의 혈흔과 기타 삼출물을 정리하였다.
- 상처의 상피화율은 상처유발 후 7일 째부터 측정하였는데, 측정일별 상피화 면적은 상처의 테두리면적(Wi)에서 측정일별 상처의 면적(Ui)의 차이값의 백분율로 계산하였다.18)
- 상처의 치유율은 상처유발 첫날의 상처 테두리면적(W0)에서 각 측정일별 상처의 면적(Ui)의 차이값의 백분율로 계산하였다.
- 상처주위조직의 VEGF의 발현을 관찰하기 위하여 anti-VEGF(AB44724, 1 : 500 dilution, rabbit polyclonal ; ABCAM)를 primary antibody로 하고, biotinylated goat anti-rabbit IgG (Nichirei Co.)를 secondary antibody로 사용하여 염색한 후 변화를 관찰하였다.
- 상처테두리 면적과 상처부위의 면적은 image processing program(NIH Image, version 1.52, Public Domain Software)을 이용하여 측정하였다.
- 실험 당일 ethyl ether로 흰 쥐를 흡입 마취시키고 흰쥐의 등쪽 피부의 피모를 전기제모기를 사용하여 광범위하게 제거한 후 수술부위를 70% ethanol로 소독하였다. 등쪽 피부를 정사각형(15×15㎜)을 작도한 후 멸균된 수술용 가위로 피하층까지 절개하여 피하조직을 분리하여 피부전층 상처를 유발하였다.
- 실험동물에 피부 전층 상처유발 후 15일간 매일 같은 시간에 각 군의 동물들의 상처부위를 촬영하였다. 상처의 연축율은 상처유발 직후의 최초의 상처 테두리면적(W0)에서 측정일별 연축된 상처의 테두리면적(Wi)의 차이값의 백분률로 계산하였다.
- 피부전층 상처를 유발 시킨 후 실험동물을 무작위로 나누어 溫淸飮을 투여한 Sample군(n=12)과 동일량의 생리식염수를 투여한 Control 군(n=12)으로 분리하였다. 약물의 투여는 상처 유발일 부터 시작하여 15일간 매일 동일한 시간에 경구투여를 통해 시행하였다. 또한 상처부위의 감염을 방지하기 위해 매일 상처부위를 소독하였다.
- 조직을 5㎛두께로 조직절편기를 사용하여 절단한 다음 gelatin으로 코팅된 slide에 붙여 paraffin 제거 및 함수과정을 거친 후 Hematoxylin-Eosin (H&E) 염색을 하였다.
- 2g을 얻었다. 투여량은 체중 60kg인 사람의 하루 1첩 복용량에 비례하여 흰쥐 체중 100g 당 물추출엑기스 193.9mg을 음용수에 녹여 피부 상처를 유발시킨 후 매일 정해진 시간에 경구투여 하였다.
- 피부손상에 溫淸飮이 미치는 영향을 검증하기 위하여 흰쥐의 등에 인위적으로 전층피부손상을 일으켜 육안적인 상처부위의 변화와 상처연축률, 상처치유율, 상피화율을 측정하고 피부의 해부조직학적 변화와 VEGF 단백질의 발현을 관찰한바 다음과 같은 결론을 얻었다.
- 피부전층 상처를 유발 시킨 후 실험동물을 무작위로 나누어 溫淸飮을 투여한 Sample군(n=12)과 동일량의 생리식염수를 투여한 Control 군(n=12)으로 분리하였다. 약물의 투여는 상처 유발일 부터 시작하여 15일간 매일 동일한 시간에 경구투여를 통해 시행하였다.
대상 데이터
- 실험동물은 샘타코(주)에서 구입한 9주령, 약 250g 전후의 Sprague-Dawley계 수컷 흰 쥐를 사용하였다. 흰쥐는 온도 21∼23℃, 습도 40∼ 60%, 조명 12시간 명/암을 유지하는 사육실에서 무균음료와 사료가 자유롭게 공급되었으며, 실험실 환경에 1주 이상 적응시킨 후 사용하였다.
데이터처리
- 실험동물에 피부 전층 상처유발 후 15일간 매일 같은 시간에 각 군의 동물들의 상처부위를 촬영하였다. 상처의 연축율은 상처유발 직후의 최초의 상처 테두리면적(W0)에서 측정일별 연축된 상처의 테두리면적(Wi)의 차이값의 백분률로 계산하였다.
- 실험결과의 분석은 Microsoft Office Excel 2007 프로그램을 통한 Student T-test 통계처리법을 이용하여 위험도 P<0.05 및 P<0.01로 유의성을 검증하였다.
성능/효과
- 1) 상처치유는 여러 단계를 거치며 매우 순차적이고 효율적인 방법으로 진행된다. 상처치유에 있어 상피조직과 결합조직은 광범위하게 재생되나 대부분의 조직은 그 재생능력이 한정되어 있어서 척추동물에서의 상처치유는 주로 염증반응 말기에 새로운 모세혈관의 형성, 섬유증식, 상피조직재생을 동반하는 것으로 알려져 있다.
- 16) 또한, 紫雲膏와 gentamicin의 병용사용이 피부상처 치유와 상처감염에 유의한 효과가 있는 것으로 밝혀졌다.17) 본 실험에서는 온청음의 경구투여가 피부손상의 치유에 미치는 영향을 관찰하기 위해서 흰쥐에 인위적인 피부손상을 일으킨 후 15일간의 변화를 육안으로 관찰한 결과 Control군과 Sample에서 모두 정상적인 상처회복의 과정을 확인할 수 있었는데, 상처유발 후 溫淸飮을 투여한 Sample군의 상처회복의 과정을 육안으로 관찰한 결과 Control군에 비해 상처의 회복속도가 빠른 것을 관찰할 수 있었다.
- 19) 시간적으로 상처발생 12∼24시간에 상처부위는 혈괴(blood clot)로 채워지고 호중구(neutrophil)가 혈괴 속으로 들어가며, 손상 후 3∼7일에는 대부분의 호중구는 자연사(apoptosis)되어 사라지고 대신 대식세포(macrophage)가 손상조직에 많아지게 된다.
- 상처치유에 있어 상피조직과 결합조직은 광범위하게 재생되나 대부분의 조직은 그 재생능력이 한정되어 있어서 척추동물에서의 상처치유는 주로 염증반응 말기에 새로운 모세혈관의 형성, 섬유증식, 상피조직재생을 동반하는 것으로 알려져 있다.2) 정상적인 상처치유의 과정은 염증기(inflammation), 육아기(granulation), 상피화기(epithelialization), 섬유증식기(fibroplasia), 수축기(contraction) 등을 포함한다.3)
- 5일째에는 Control군이 34.5±3.6%, Sample군이 44.2±1.9%의 치유율을 보였고(P<0.05), 7일째에는 Control군이 42.7±2.9%인 반면, Sample군은 53.6±2.5%로 나타나 연축율의 유의성 있는 증가가 관찰되었다(P<0.01).
- 상처 유발 7일째에는 염증반응에 따른 부종과 울혈이 관찰되었는데, 특히 Control군에서의 염증반응이 뚜렷하여 진피의 부종형성이 관찰되었으며, Sample군의 경우는 Control군에 비해 부종의 형성이 감소되었음이 확인되었다. 또한, Control군과 Sample군 모두 표피세포의 재생이 일어나 혈괴아래로 표피층이 형성되고, 혈관형성이 활발히 진행됨이 관찰되었는데, 특히 Sample군에서 Control군에 비해 혈관증식이 뚜렷이 관찰되었다(Fig. 5 C, D). 상처유발 15일째에는 상피화와 더불어 표피의 각질화가 일어났는데 Sample군이 Control군에 비해 각질이 더 두껍게 형성되었음이 관찰되었다(Fig.
- 본 실험에서 피부전층 상처를 유발시킨 후 3일째에 Control군과 Sample군에서 가피형성과 섬유모세포 증식에 있어 차이점은 발견할 수는 없었지만, 상처 유발 7일째에 Control군에서의 염증반응이 뚜렷하여 진피의 부종형성과 울혈혈관이 뚜렷이 관찰된 반면, Sample군에서는 Control군에 비해 부종과 울혈이 감소되었음이 관찰되었다. 또한, Control군과 Sample군 모두 표피층이 형성되고, 혈관형성이 활발히 진행됨이 관찰되었는데, 특히 Sample군에서 Control군에 비해 혈관증식이 뚜렷이 관찰되었다. 위의 결과로 보아 상처유발 후 溫淸飮의 경구투여가 신생혈관의 형성을 촉진시켜 상처부위의 회복을 빠르게 하는 것으로 사료된다.
- 본 실험에서 전층 피부상처 유발 3일째 Control군과 Sample군 사이에 VEGF의 발현은 뚜렷한 차이가 없었으나 상처유발 7일째와 14일째에는 Control군과 Sample군 모두에 VEGF의 양성반응이 관찰되었다. 특히 7일째에 Sample군에서 Control군에 비해 현저한 양성반응이 나타났는데 이것은 정상적인 상처치유과정에서 1일과 7일 사이에 VEGF의 발현이 증가한다는 이전 연구와 일치하는 결과이다.
- 본 실험에서 피부전층 상처를 유발시킨 후 3일째에 Control군과 Sample군에서 가피형성과 섬유모세포 증식에 있어 차이점은 발견할 수는 없었지만, 상처 유발 7일째에 Control군에서의 염증반응이 뚜렷하여 진피의 부종형성과 울혈혈관이 뚜렷이 관찰된 반면, Sample군에서는 Control군에 비해 부종과 울혈이 감소되었음이 관찰되었다. 또한, Control군과 Sample군 모두 표피층이 형성되고, 혈관형성이 활발히 진행됨이 관찰되었는데, 특히 Sample군에서 Control군에 비해 혈관증식이 뚜렷이 관찰되었다.
- 혈괴형성과 섬유모세포 증식에 있어 Control군과 Sample군 간의 뚜렷한 차이점은 발견할 수 없었다. 상처 유발 7일째에는 염증반응에 따른 부종과 울혈이 관찰되었는데, 특히 Control군에서의 염증반응이 뚜렷하여 진피의 부종형성이 관찰되었으며, Sample군의 경우는 Control군에 비해 부종의 형성이 감소되었음이 확인되었다. 또한, Control군과 Sample군 모두 표피세포의 재생이 일어나 혈괴아래로 표피층이 형성되고, 혈관형성이 활발히 진행됨이 관찰되었는데, 특히 Sample군에서 Control군에 비해 혈관증식이 뚜렷이 관찰되었다(Fig.
- 상처유발 후 3일째부터 관찰되는 상처부위의 충혈상태가 Sample군이 Control군에 비해 현저히 감소되었으며, 7일째에는 Control군이 아직 혈괴로 덮여있는 반면, Sample군에서는 상피화가 시작되고 있음이 관찰되었고, 15일째에는 Control군에 비해 Sample군에서 상처부위의 수축이 뚜렷이 증가되었다. 상처 유발 후 15일 동안의 상처의 테두리면적의 변화를 수치화한 연축율의 비교에 있어서 Sample군이 Control군에 비해 전반적으로 높은 연축률을 나타내었으며, 상처의 면적의 변화를 수치화한 상처 치유율의 비교에 있어서도 Sample군이 Control군에 비해 상처유발 후 15일 동안 전반적으로 상처 치유율을 증가를 나타내었다. 특히, 연축율과 치유율에 있어서 모두 상처유발 후 3일, 5일, 7일째에 유의성 있는 증가가 나타났다.
- 상처 치유율의 비교에 있어서도 溫淸飮 추출물을 투여한 Sample군이 Control군에 비해 상처유발 후 15일 동안 전반적으로 높은 상처 치유율을 나타내었다(Fig. 3).
- 상처유발 후 3일째부터 Control군과 Sample군 모두에서 혈괴(blood clot)가 형성되고 바깥쪽 부분에 육아조직(granulation tissue)이 관찰되었다. 상처부위에 충혈상태를 관찰한 결과 Contrl군에 비해 Sample군에서 혈종이 상당히 감소된 것을 확인할 수 있었다(Fig. 1 C, D). 상처유발 후 7일째에 Control군은 대부분 아직 혈괴로 덮여있는 반면, Sample군에서는 분홍빛의 상피화가 일어난 것을 확인할 수 있었으며(Fig.
- 상피화율는 Sample군이 Control군에 비해 상피화가 빠른 편이었으나 통계적 유의성은 없었다. 상처부위의 조직학적 변화를 관찰한 결과 Sample군이 Control군에 비해 섬유모세포의 증식과 부종감소 및 활발한 신생혈관생성이 뚜렷이 관찰되었으며, VEGF 단백질의 발현에 있어서는 7일째와 15일째 Sample군이 Control군에 비해 현저한 증가를 나타내었다.
- 상처유발 3일째에 Control군이 18.6±3.0%의 치유율을 보인 반면 Sample군이 26.8±1.7%로 치유율의 유의성 있는 증가가 나타났으며(P<0.05), 5일째에는 Control군과 Sample군이 각각 34.5±3.6%, 44.2±1.9%로 관찰되었고(P<0.05), 7일째에는 Control군과 Sample군이 각각 34.5±3.6%, 44.2±1.9%로 관찰되어(P<0.01) Sample군이 Control군에 비해 유의성 있는 증가를 나타내었다.
- 상처유발 후 15일 동안의 연축율의 비교에 있어서 溫淸飮 추출물을 경구투여한 Sample군이 Control군에 비해 전반적으로 높은 연축률을 나타내었다(Fig. 2).
- 상처유발 후 3일째 Control군은 18.6±3.0%의 연축율을 보인 반면, Sample군에서는 26.8±1.7%의 연축율을 나타내어 Control군에 비해 유의성 있는 증가를 보였다(P<0.05).
- 상처유발 후 각 군에 대하여 상처부위를 육안으로 관찰한 결과 전반적으로 온청음 추출물을 투여한 Sample군이 Control군에 비해 빠른 상처치유가 관찰되었다. 상처유발 후 3일째부터 Control군과 Sample군 모두에서 혈괴(blood clot)가 형성되고 바깥쪽 부분에 육아조직(granulation tissue)이 관찰되었다. 상처부위에 충혈상태를 관찰한 결과 Contrl군에 비해 Sample군에서 혈종이 상당히 감소된 것을 확인할 수 있었다(Fig.
- 상처유발 후 3일째부터 관찰되는 상처부위의 충혈상태가 Sample군이 Control군에 비해 현저히 감소되었으며, 7일째에는 Control군이 아직 혈괴로 덮여있는 반면, Sample군에서는 상피화가 시작되고 있음이 관찰되었고, 15일째에는 Control군에 비해 Sample군에서 상처부위의 수축이 뚜렷이 증가되었다. 상처 유발 후 15일 동안의 상처의 테두리면적의 변화를 수치화한 연축율의 비교에 있어서 Sample군이 Control군에 비해 전반적으로 높은 연축률을 나타내었으며, 상처의 면적의 변화를 수치화한 상처 치유율의 비교에 있어서도 Sample군이 Control군에 비해 상처유발 후 15일 동안 전반적으로 상처 치유율을 증가를 나타내었다.
- 1 C, D). 상처유발 후 7일째에 Control군은 대부분 아직 혈괴로 덮여있는 반면, Sample군에서는 분홍빛의 상피화가 일어난 것을 확인할 수 있었으며(Fig. 1 E, F), 11일째에는 Control군과 Sample군 모두에서 혈괴가 탈락되었고 15일째에는 Sample군의 상처수축이 거의 완성되어 육안으로도 상처부위의 크기가 Sample군이 Control군에 비해 현저히 감소된 것을 확인할 수 있었다(Fig. 1 I, J).
- 상처유발 후 각 군에 대하여 상처부위를 육안으로 관찰한 결과 전반적으로 온청음 추출물을 투여한 Sample군이 Control군에 비해 빠른 상처치유가 관찰되었다. 상처유발 후 3일째부터 Control군과 Sample군 모두에서 혈괴(blood clot)가 형성되고 바깥쪽 부분에 육아조직(granulation tissue)이 관찰되었다.
- 또한, Control군과 Sample군 모두 표피층이 형성되고, 혈관형성이 활발히 진행됨이 관찰되었는데, 특히 Sample군에서 Control군에 비해 혈관증식이 뚜렷이 관찰되었다. 위의 결과로 보아 상처유발 후 溫淸飮의 경구투여가 신생혈관의 형성을 촉진시켜 상처부위의 회복을 빠르게 하는 것으로 사료된다.
- 상처유발 7일째와 14일째에는 Control군과 Sample군 모두에 VEGF의 양성반응이 관찰되었다. 특히 7일째에 Sample군에서 Control군에 비해 현저한 양성반응이 나타났으며(Fig. 6 C, D arrows), 15일째에도 비록 7일째보다는 감소하였으나 Sample군이 Control군에 비해 뚜렷한 양성 반응이 관찰되었다(Fig. 6 E, F).
- 피부손상 후 15일간 온청음을 투여한 Sample군이 생리식염수를 투여한 Control군에 비해 육안적으로 상처부위의 회복이 빠른 편이었고, 상처연축률, 상처치유율에 있어서도 Sample군이 Control군에 비해 증가한 것으로 관찰되었다. 특히 상처유발 후 7일째에 상처연축률과 상처치유율의 비교에 있어 유의성 있는 증가를 나타내었다. 상피화율는 Sample군이 Control군에 비해 상피화가 빠른 편이었으나 통계적 유의성은 없었다.
- 특히 처음 7일 동안의 상처 치유율의 비교에 있어서 Sample군이 Control군에 비해 유의성 있는 증가를 나타내었다. 상처유발 3일째에 Control군이 18.
- 상처 유발 후 15일 동안의 상처의 테두리면적의 변화를 수치화한 연축율의 비교에 있어서 Sample군이 Control군에 비해 전반적으로 높은 연축률을 나타내었으며, 상처의 면적의 변화를 수치화한 상처 치유율의 비교에 있어서도 Sample군이 Control군에 비해 상처유발 후 15일 동안 전반적으로 상처 치유율을 증가를 나타내었다. 특히, 연축율과 치유율에 있어서 모두 상처유발 후 3일, 5일, 7일째에 유의성 있는 증가가 나타났다. 이러한 결과를 통해 상처유발 후 溫淸飮이 투여가 상처의 빠른 회복을 돕는 것으로 사료된다.
- 피부손상 후 15일간 온청음을 투여한 Sample군이 생리식염수를 투여한 Control군에 비해 육안적으로 상처부위의 회복이 빠른 편이었고, 상처연축률, 상처치유율에 있어서도 Sample군이 Control군에 비해 증가한 것으로 관찰되었다. 특히 상처유발 후 7일째에 상처연축률과 상처치유율의 비교에 있어 유의성 있는 증가를 나타내었다.
후속연구
- 피부의 물리적인 손상 및 수술적 치료에 의한 상처부위의 치유지연이 치사율을 증가시키고 상처감염 등의 합병증을 발생시킨다는 점에서 피부손상 환자의 상처치유에 溫淸飮을 활용하는 것이 상처의 빠른 회복과 합병증을 예방할 수 있는 좋은 치료법이 될 것이라 사료된다.
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