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문제 정의
- mutansQ] 성장과 산 생성 억제 효과, 타액으로 도말된 hydroxyapatite bead에 대한 부착억제와 비수용성 글루칸 합성 억제를 관찰하여 보고한 바 있다. 본 연구에서는 독활의 메탄올 추출물로부터 또 다른 항치아우식 활성 물질인 stigmasterol을 분리하여 이들의 화학구조를 규명하였기에 보고하고자 한다.
제안 방법
- 1%의 glucose가 들어있는 BHI 액체배지에 시료를 첨가한 후 균을 1x10s CFU/ml이 되게 접종하였다 37℃의 항온기에서 24시간 배양한 후 BHI 액체배지를 기준으로 ELISA reader (Molecular Devices Co., CF.Z USA.)를 이용하여 550 nm에서 흡광도를 측정하였으며, pH meter (ORIONSA 720f USA.)를 이용하여 pH를 측정하여 산 생성 억제 효과를 관찰하였다 대조군은 시료를 넣지 않고 시행하였다
- 이 화합물에 대한 구조 해석을 기기분석 (MS,1H-NM& 13GNMR)을 통해 stigmasterol로 동정하였다. Stigmasterol에 대한 S. mutans의 성장과 산 생성 억제 효과, &HA에 대한 부착억제와 비수용성 글루칸 합성 억제를 측정하고 다음과 같은 결과를 얻었다.
- Stigmasterol의 S. mutans에 대한 항균 활성을 관찰하기 위하여 BHI 액체배지에 stigmasterol을 각각 1.25, 2.5, 5, 10, 20 pg/ml 의 농도로 첨가한 후, S. mutans를 접종하여 37℃ 항온기에서 24시간 배양한 후 흡광도를 측정한 결과는 Fig. 4와 같다. Stigmasterol 를 넣지 않은 대조군에서 0.
- 가장 활성이 높은 CHCh 분획물을 선택하여 silica gel (230-400 mesh, ASTM, Art. 9385, 200 g, 3x80 cm)이 충진된 컬럼에 넣어 n-hexane-EtOAc (9:1 (1 L), 5:1 (0.5 L), 2:1 (0.5 L), 1:1 (0.5 L)) 그리고 EtOAc 100%용매계로 단계적으로 극성을 높여용출시켜 50 mL씩 94개를 얻은 TLC를 실시하여 7개의 소분획으로 나누었다. 항균효과를 나타낸 fraction 3으로부터 활성 성분을규명하기 위해 계속해서 prep-LC (JAIJEL-1H column, 용매 CHCh, 유속 3 ml/min, 220 nm)를 시행하여 무색 침상의 화합물을 얻었다 (Fig.
- mutanse: lxlO7 CFU/ml이되게 넣은 다음 37℃의 흔들리는 배양기에서 90분 동안 9HA에 부착시켰다. 그 후 0.1 M KPB (pH 7.0)로 3회 세척한 후 초음파 장치 (50W, 30초)를 이용해 S-HA에 부착된 균을 떨어지도록 하였다 그 다음 균액을 희석하여 Mitis salivarius agar plate (Difco Laboratories, USA.)에 도말하여 37℃ 항온기에서 24시간 동안 배양시켜 집락수를세었다 대조군은 stigngstgl를 넣지 않고 시행하였다
- )를 이용하여 490 nm에서 흡광도를 측정하였다. 대조군은 stigma ster 이를 넣지 않은 군을 대조군으로 하였다.
- 구조동정을위해 사용된 1H 및 13C-NMR spectra는 Brukei의 (Germany) AVANCE 300과 500 MHz의 것을 사용하였다. 또한 선광도 측정은 JASCO DIP-1000 digital polarim어:er로 측정하였다.
- 본 연구에서는 앞선 연구에서 발표한 독활의 메탄을 추출물의 CHC13 분획물로부터 또 다른 항균 활성이 높은 물질을 분리하여 이 단일 화합물에 대한 구조 해석을 기기분석 (MS, 1H-NMR, ”C-NMR)을 통해서 진행한 결과 stigmasterol로 최종 동정하였다.
- 그 후 MeOH 추출물을 250 g을 증류수에 현탁시켜 CHCb, EtOAc, n-BuOH 순으로 분획 후 농축하여 CHCh 분획물 (65 g), EtOAc 분획물 (9 g), n-BuOH (75 g)및 HQ 분획물 (120 g)을 얻었다. 이 중 가장 강한 활성을 갖는 CHCh 분획 (60 g)을 취하여 활성물질 분리를 실시하였다(Fig. 1).
- 화합물을 얻었다. 이 화합물에 대한 구조 해석을 기기분석 (MS,1H-NM& 13GNMR)을 통해 stigmasterol로 동정하였다. Stigmasterol에 대한 S.
대상 데이터
- 9385, Merck, Germany)을 사용하였다. TLC plate는 Kiselgel 60F254 precoated plate (Art. 5552 Merck)를 사용하였다. 분취 용 LC는 JAI 908 model (Japan Analytical Instrument) 로서 UV 및 RI 검출기를 동시에 사용하였고, columne JAIGEL 1H (20 x 900mm)와 2H (20 x 900mm)를 연결하여 사용하였다.
- 융점은 Gallenkamp melting point apparatus를 사용하였으며 온도는 보정하지 않았다. 구조동정을위해 사용된 1H 및 13C-NMR spectra는 Brukei의 (Germany) AVANCE 300과 500 MHz의 것을 사용하였다. 또한 선광도 측정은 JASCO DIP-1000 digital polarim어:er로 측정하였다.
- 본 실험에 사용한 균주는 Streptococcus mutans ATCC 25175로 Brain heart infusion (BHI, Difcoz USA) 액체배지에 1-2 차 계대배양 후 같은 배지에 식균하여 37℃의 항온기에서 24시간 배양하여 사용하였다.
- 5552 Merck)를 사용하였다. 분취 용 LC는 JAI 908 model (Japan Analytical Instrument) 로서 UV 및 RI 검출기를 동시에 사용하였고, columne JAIGEL 1H (20 x 900mm)와 2H (20 x 900mm)를 연결하여 사용하였다. 융점은 Gallenkamp melting point apparatus를 사용하였으며 온도는 보정하지 않았다.
- 같다. 즉, 독활은 익산시 대학한약국에서 구입한 후 냉암소에 보관하여 사용하였다. 건조하여 세절한 독활 5 kg을 MeOH에 침지하여 상온에서 7일간 3회 추출하였다.
- 추출 및 open column용 용매는 1급 시약을 정제 없이 사용하였고, column용 지지체인 silica g이은 Kiselg이 60 (230-400 mesh, ASTM, Art. 9385, Merck, Germany)을 사용하였다. TLC plate는 Kiselgel 60F254 precoated plate (Art.
- 타액은 건강한 성인 남자로부터 파라핀왁스로 자극하여 분비된 것을 냉각된 비이커에 채취한 다음, 채취된 타액은 원심분리 (12, 000 rpm, 4℃, 15분)하여 상청액을 취한 다음, 분해효소를 불활성화시키기 위하여 60℃에서 30분간 처리한 후, -20℃에 보관하면서 사용하였다.
데이터처리
- 1x100의 식을 이용하여 계산하였다. 얻은 결과는 통계프로그램인 SPSS (ver 10.0)을 사용하여, 평균과 표준편차로 제시하였으며, a=0.05 수준에서 실험군과 대조군의 평균치를 independent sample t-test로 유의성을 검증하였다.
성능/효과
- 29에서 관측되어 sterol임을 예측할 수 있었다. 13C-NMR spectrum에서 29개의 탄소의 signalO] 관측되었으며, 6c 138, 7 맟 129.7에서 olefine methine signal로 한 쌍의 이중결합이 있는 것을 확인할 수 있었고, 또한 6c 72.2에서 oxygenated methine signaL도 관측되었다. 그리고 methyl의 signale] (8c 14.
- 05). 9HA에 S. mutans 부착율이 stigmasterol 1.25, 2.5, 5, 10, 20 pg/ml 농도에서 대조군에 비해 각각 3%, 17%, 31%, 52%, 54%의 부착억제율을보여 2.5 μg/ml이상 농도에서 대조군에 비하여 유의한 차이가 있었다 (p<0.05). GTFase에 의한 비수용성 글루칸 정량 실험을 한결과 대조군에 비해 stigmasterol 1.
- Column chromatography와 prep-HPLC로 분리한 화합물은 mp가 164-1650인 무색 침상1H-NMR spectrum에서 olefine methine signal이 6 537에서 관찰되었고, 8 3.53에서 oxygenated methine signal이 나타내었으며 또한' 많은 methylene signal proton들이 8 2.78J.29에서 관측되어 sterol임을 예측할 수 있었다. 13C-NMR spectrum에서 29개의 탄소의 signalO] 관측되었으며, 6c 138, 7 맟 129.
- 05). GTFase에 의한 비수용성 글루칸 정량 실험을 한결과 대조군에 비해 stigmasterol 1.25, 2.5, 5, 10, 20 μg/ml 농도에서 각각 98.00+1.00%, 90.00±1.00%7 75.67±2.08%, 67.00±2.00%, 54.00±1.00%의 생성율을 보여, 2.5 μg/rrd이상 농도에서 대조군에비하여 유의한 차이가 있었다 (p<0.05).
- 05). S. mutans$] 산 생성량은 대조군에서 pH는 5.22±0.08이었고, stigmasterol 1.25, 2.5, 5, 10, 20 pg/ml 농도에서, 각각 5.22+0.07, 5.30+0.10, 5.94+0.04, 6.98+0.11, 7.14±0.11으로 5 μg/ml 이상 농도에서 우식 임계 pH 5.5보다 높았으며, 대조군에비하여 통계적으로 유의한 차이를 나타내었다 (p<0.05). 9HA에 S.
- Stigmasterol 1.25, 2.5, 5, 10, 20 iig/r이의 농도별 시료에 대한 S. mutanso]] 대한 성장억제 율이 5%, 18%, 77%, 100%, 100%의 성장억제 효과를 나타내 1-25 μg/ml 이상 농도에서 대조군에 비하여 통계적으로 유의한 차이를 나타내었는데 (p<0.05)f 특히 10ug/ml 과, 20 pg/ml 농도에서는 100%의 성장억제 효과를 나타내었다. Continentalic acid가 0.
- Stigmasterol?} S-HA에 S. mutans 부착 억제 효과가 있는지알아본 결과 (Fig. 5) 대조군은 135.33+2.08 (xlO5) CFU/ml이었으며, stigmasterol 125 pg/ml 농도에서는 131.67H.53 (xlO5) CFU/ml, 2.5 ng/ml 농도에서는 113.00+2.00 (xlO4 5) CFU/ml, 5 p g/ml 농도에서는 93.67±4.01 (xlO5) CFU/ml, 10 pg/ml 농도에서는 6433±2.08 (xlO5) CFU/ml, 20 pg/ml 농도에서 62.67±1.58 (xlO5) CFU/ml로 2.5 ug/ml이상 농도에서 대조군에 비하여 부착하는 균수가 유의하게 낮았다 (P<0.05).
- 각 농도별 stigmasterol가 치아표면의 세균 부착을 억제하는지 알아보기 위해 S-HAd] 대한 부착 억제 효과를 확인한 결과 대조군에서는 135.33+2.08 (xlO5) CFU/mlO] 부착한 반면, 1.25, 2.5, 5, 10, 20 ug/ml 각각의 농도에서는 131.67±1.53 (시05) CFU/ml, 113.00±2.00 (xlO5) CFU/ml, 93.67±4.01 (xlO5) CFU/ml, 64.33±2.08 (xlO5) CFU/ml, 62.67±1.58 (xlO5) CFU/ml의 부착을 보여, 대조군에 비해 각각 3%, 17%, 31%, 52%, 54%의 부착 억제율을 보였으며, 그리고 비수용성 글루칸 합성 실험을 한 결과를 보면 stigwsterol는 1.25, 2.5, 5, 10, 20 pg/ml 농도에서 대조군에 비해 각각 98.00±1.00%, 90.00±1.00%, 75.67±2.08%, 67.00±2.00%, 54.00±1.00%의 생성율을 보여, S-HA 부착억제와, 비수용성 글루칸 합성은 2.5 pg/ml이상 농도에서 대조군에 비하여 유의한 차이가 있었다 (p<0.05).
- 05). 대조군에 비하여 각각 5%, 18%, 77%, 100%, 100%의 성장억제 효과를 나타내었다.
- 독활에서 항치아우식 활성 물질을 분리하기 위해 독활을 메탄올로 추출하고 계통분획을 실시하여 하여 CHCL, EtOAc, n-BuOH 및 HQ의 4가지 분획으로 나누어 항균 활성을 측정한 결과 CHCh 분획의 활성이 가장 높아 silica gel column chromatography, recycling preparative HPLC를 이용한 결과 단일 화합물을 얻었다. 이 화합물에 대한 구조 해석을 기기분석 (MS,1H-NM& 13GNMR)을 통해 stigmasterol로 동정하였다.
- 이상의 결과를 종합해 보면, 독활로부터 분리한 stigmasterol 은 S. mutansSI 성장 억제, 유기산의 생성 억제, &HA에 대한 부착억제, 비수용성 글루칸 합성 억제에 효과가 있음을 알 수 있었다. 이어), stigmasterol의 의학적, 산업적으로 유용한 소재로의 연구와 독활의 다른 구성성분의 항치아우식 효과에 대해서 순수정제 과정을 거쳐 연구가 더욱 진행되어야 할 것으로 사료된다.
- 그리고 고 자장 영역에서 quaternary 3개, methine 11개, methylene 9개, methyl 6개의 signal이 관찰되었다. 이와 같은 결과들을 종합하고, 기존의 문헌의15) spectral data들과 비교하여 (24E)-stigmasta-5z22-diene-3p-ol 즉, stigmasterol으로 동정하였다.(Table L Fig.
- mutanso]\ 의한 유기산 생성을 농도 의존적으로 억제하였음을 보여주었다. 특히 5 pg/ml이상 농도에서는대조군에 비해 유의적으로 유기산 생성을 억제하였으며 (p<0.05), 우식 임계 pH를 넘어 효과적이었다.
후속연구
- mutansSI 성장 억제, 유기산의 생성 억제, &HA에 대한 부착억제, 비수용성 글루칸 합성 억제에 효과가 있음을 알 수 있었다. 이어), stigmasterol의 의학적, 산업적으로 유용한 소재로의 연구와 독활의 다른 구성성분의 항치아우식 효과에 대해서 순수정제 과정을 거쳐 연구가 더욱 진행되어야 할 것으로 사료된다.
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