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문제 정의
- 산지는 한국을 비롯한 일본, 중국 등 아시아 온대지역에 넓게 분포되어 야생 및 재배되고 있다 (Perry 1980; 대한약전, 1987). 이에 본 연구에서는 독활의 뿌리를 이용하여 항균효과를 살펴보아 생의약품 및 화장품 소재로서 개발하기 위한 기초 자료를 확립하고자 한다.
제안 방법
- CHCG분획을 column chromatogaphy 및 분취용 HPLC를 이용하여 분리한 화합물 1인 continentalic acid와 화합물 2인 stigmasterol의 미생물에 대한 항균력은 그람 양성균들에서 M1C가 7.8〜3L2"g/mC로 측정하였다. 두 물질은 모두 그람 양성균인 S.
- , 1987)과 액체배지희석법 (Amsterdam, 1996)을 이용하여 즉정하였다. Paper disc method의 항균력 측정 은 즉, 독활 뿌리 추출물 및 분리된 화합물을 0.45 ㎛ membrane filter (Millipore Co., U.S.A.)로 여과하여 제균하고, 멸균된 filter paper disc (Toyo seisakusho, 6 mm)에 일정 량씩흡수시킨 후, 추출용매를 완전히 날려 보낸 다음, 전보에서 사용한 시험용 평판배지 표면에 놓아 밀착시키고 냉장고 (4℃) 에서 1시간 동안 방치한 후, 30℃ incubatoi에서 24〜48시간 동안 배양한 다음 disc 주변의 clear zone 직경 (mm)을 측정하여 향균력을 비교하였다. 또한 액체배지의 항균력 측정은 시료를 각각 10% DMSO에 용해시킨 후, 96 well plate에 각 시료의 농도를 최고농도 100㎍/㎖에서 최저농도 3.
- 융점은 Gallenkamp melting point apparatus를 사용하였으며 온도를 보정하지 않았다. ¹H 및 13C NMR spectra는 Bruker의 AM-300 및 AMX-500를 사용하였고, 선광도 측정은 JASCO DIP-1000 digital polarimeter^ 측정하였다.
- 125 ㎍/㎖ 까지 2배씩 연속적으로 희석하였다. 각 균주는 단일 콜로니를 액체배지에 접종하고, 37℃ 배양기에서 18시간 배양한 균주 104CFU/㎖ 접종하여, 37℃ 배양기에서 2시간 배양한 후, ELISA reader로 630 nm에서 배지 탁도를 확인하였고, 순수 배양액의 흡광도 값과 같은 결과를 얻은 것을 최소억제 농도 (Minimum inhibitory concentration, MIC)로 결정하였으며 (Amsterdam, 1996), 최소억제농도 수치가 낮은 것을 항균효과가 높은 것으로 판정하였다.
- )로 여과하여 제균하고, 멸균된 filter paper disc (Toyo seisakusho, 6 mm)에 일정 량씩흡수시킨 후, 추출용매를 완전히 날려 보낸 다음, 전보에서 사용한 시험용 평판배지 표면에 놓아 밀착시키고 냉장고 (4℃) 에서 1시간 동안 방치한 후, 30℃ incubatoi에서 24〜48시간 동안 배양한 다음 disc 주변의 clear zone 직경 (mm)을 측정하여 향균력을 비교하였다. 또한 액체배지의 항균력 측정은 시료를 각각 10% DMSO에 용해시킨 후, 96 well plate에 각 시료의 농도를 최고농도 100㎍/㎖에서 최저농도 3.125 ㎍/㎖ 까지 2배씩 연속적으로 희석하였다. 각 균주는 단일 콜로니를 액체배지에 접종하고, 37℃ 배양기에서 18시간 배양한 균주 104CFU/㎖ 접종하여, 37℃ 배양기에서 2시간 배양한 후, ELISA reader로 630 nm에서 배지 탁도를 확인하였고, 순수 배양액의 흡광도 값과 같은 결과를 얻은 것을 최소억제 농도 (Minimum inhibitory concentration, MIC)로 결정하였으며 (Amsterdam, 1996), 최소억제농도 수치가 낮은 것을 항균효과가 높은 것으로 판정하였다.
- Merck)를 사용하였다. 발색시 약은 10% H2SO4 (in EtOH) 시약을 사용하였으며 , UV 254, 365 nm detection을 병 행 하였다. 분취용 HPLC는 JAL 908 model (Japan analytical instrument)로서 detector는 UV detector와 RI detector를 동시 에 사용하였고, column은 JAIGEL 1H (20x900 tntn)와 2H (20x900 tntn)를 연결하여 사용하였다.
- 2 g를 각각 얻었다. 분획물 중 가장 우수한 생리활성 효과를 나타낸클로로포름 62.4 g를 silica gel (230-400 mesh, ASTM, Art. 9385, 200g, 3x80cm)이 충진된 컬럼에 넣어 n-hexane : EtOAc (9 : 1 → 1 : 1) 그리고 EtOAc로 단계적으로 극성을 높인 전개용매를 이용하여 column chromatography를 실시하여 50㎖씩 94개를 얻어 TLC를 실시하여 6개의 소분획 (AC- 1〜6)2로 나누었다. 항균효과를 나타낸 fraction 3으로부터 활성 주성분을 규명하기 위해 계속해서 recycling prep-HPLC [JAIGEL-1H (column); 유속 3.
- 가지의 새로운 문제점에 직면하게 되었다. 안전성이 있는 새로운 항균물질의 개발 목적으로 예비 검색 결과 선택된 독활을 추출하여 컬럼 크로마토그래피를 반복 수행한 결과 2 종의 항균 효과를 보여주는 화합물을 분리하였다. 이들 화합물은 물리 .
- 이들 화합물은 물리 . 화학적 성질 및 분광학적 분석을 통하여 화합물은 mp가 166-167℃인 백색침상, C20H30O2의 분자식을 갖는 (-)-pimara-8(14), 15-dien-19-oic acid 즉, continentalic acid 으로 동정하였으며, 화합물 2는 mp가 164-165℃인 백색침상, C29H4Q의 분자식을 갖는 (24E)-stigmasta-5, 22-dien-3/?-ol, 즉 stigmasterol으로 동정하였으며 항균효과를 측정한 결과 두 화합물 모두 유의성 있는 결과를 나타내었으며, 이 중 화합물 1인 continentalic acid이 더욱 우수한 활성을 나타내었다. 특히 그람 양성균인 S.
대상 데이터
- 9385, Merck, Germany)을 사용하였다. TLC plate는 Kieselgel 60F254 precoated plate (Art. 5552. Merck)를 사용하였다. 발색시 약은 10% H2SO4 (in EtOH) 시약을 사용하였으며 , UV 254, 365 nm detection을 병 행 하였다.
- 대학 본초학.교실 주영승 교수로부터 정확한 감정을 받아 실험에 사용하였다.
- 균주의 배양에 사용된 배지는 Staphylococcus ai/reus와 Staphylococcus epidermidis는 Brain heart inflision를 사용하였고, Escherichia coil, Pseudomonas aeruginosa 그리고 Samonella typhimurium은 Nutrient broth (Difco, US A)를 사용하였다.
- 본 실험에 사용된 독활 뿌리는 전라북도 임실군 칠보면의 재배 농가에서 3년생을 2004년 12월에 채집하여 우석대 학교한의과 대학 본초학.교실 주영승 교수로부터 정확한 감정을 받아 실험에 사용하였다.
- 발색시 약은 10% H2SO4 (in EtOH) 시약을 사용하였으며 , UV 254, 365 nm detection을 병 행 하였다. 분취용 HPLC는 JAL 908 model (Japan analytical instrument)로서 detector는 UV detector와 RI detector를 동시 에 사용하였고, column은 JAIGEL 1H (20x900 tntn)와 2H (20x900 tntn)를 연결하여 사용하였다. 융점은 Gallenkamp melting point apparatus를 사용하였으며 온도를 보정하지 않았다.
- 항균력 시험용으로 사용된 균주는 그람 양성균으로 Staphylococcus aureus ATCC 25923, Staphylococcus epidermidis ATCC 12228, Staphylococcus pyogenes ATCC 19615, Enterococcus faecalis ATCC 25922를 사용하였고, 그람 음성균으로는 Actinobacillus actinomycetemcomitans ATCC 43717, Escherichia coil ATCC 25922, Enterbacter cloacae ATCC 23350, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27983, Citrobacter freundii ATCC 8090, Samonella typhimurium ATCC 14028을 사용하였다.
이론/모형
- 항균성물질을 검색하기 위해 본 실험에서는 paper disc method (James et al., 1987)과 액체배지희석법 (Amsterdam, 1996)을 이용하여 즉정하였다. Paper disc method의 항균력 측정 은 즉, 독활 뿌리 추출물 및 분리된 화합물을 0.
성능/효과
- 이들 화합물은 물리 . 화학적 성질 및 분광학적 분석을 통하여 화합물은 mp가 166-167℃인 백색침상, C20H30O2의 분자식을 갖는 (-)-pimara-8(14), 15-dien-19-oic acid 즉, continentalic acid 으로 동정하였으며, 화합물 2는 mp가 164-165℃인 백색침상, C29H4Q의 분자식을 갖는 (24E)-stigmasta-5, 22-dien-3/?-ol, 즉 stigmasterol으로 동정하였으며 항균효과를 측정한 결과 두 화합물 모두 유의성 있는 결과를 나타내었으며, 이 중 화합물 1인 continentalic acid이 더욱 우수한 활성을 나타내었다. 특히 그람 양성균인 S.
- CHC13 분획을 column chromatography 및 prep-HPLC 등을 이용하여 분리한 화합물 1은 mp가 166-167℃인 무색 침상으로 질량분석기를 이용하여 얻은 EI-MS spectrum에서 분자량이 302 임을 알 수 있었다.
- 독활 뿌리로부터 얻어진 에탄올 추출물 및 용매분획의 항균 활성은 CHC13 분획에서 가장 높게 활성을 나타내었다. CHC13 분획을 column chromatography 및 prep-HPLC 등을 이용하여 분리한 화합물 1은 mp가 166-167℃인 무색 침상으로 질량분석기를 이용하여 얻은 EI-MS spectrum에서 분자량이 302 임을 알 수 있었다.
- 8〜3L2"g/mC로 측정하였다. 두 물질은 모두 그람 양성균인 S. wreus에서 MIC가 7.8㎍/㎖ 로 가장 높은 활성 억제 효과를 나타내었다. 분리된 화합물 1인 continentalic acid 은 독활의 주요 활성성분으로 잘 알려져 있는 물질로 항염증 및 혈소판응집억제 효과가 있는 것으로 보고 되어 있다 (Han et al.
- 78~L29에서 관측되었으며, oxygenated methine signal 여러 개의 singlet methyl signal의 존재로부터 staol임을 예측할 수 있다. 또한 13C-NMR spectrum에서 29 개의 탄소의 signal이 관측되었으며, 8C 138.7 및 129.7에서 olefine methine signal로 한 쌍의 이중결합이 있는 것을 확인할 수 있었고, 또한 8C 72.2에서 oxygenated methine signal 도 관즉되었다. 그리고 methyl의 signal (8C 14.
- , 2001). 이러한 목적으로 수행된 여러 생약 에탄올 추출물을 대상으로 한 예비 실험에서 독활이 항균효과가 뛰어남을 확인할 수 있었다.
- 그리고, 고 자장 영역에서, quatemary 3개, methine 11개, methylene 9개, metiiyl 6개의 signal0] 관측되었다. 이와 같은 결과를 종합하고, 기존의 문헌의 spectral data들과 비교하여 (24E)-Stigmasta-5, 22-dien-3^-ol 즉, stigmasteroL으로 동정하였다 (Kang et al., 1996).
- 화학적 성질 및 분광학적 분석을 통하여 화합물은 mp가 166-167℃인 백색침상, C20H30O2의 분자식을 갖는 (-)-pimara-8(14), 15-dien-19-oic acid 즉, continentalic acid 으로 동정하였으며, 화합물 2는 mp가 164-165℃인 백색침상, C29H4Q의 분자식을 갖는 (24E)-stigmasta-5, 22-dien-3/?-ol, 즉 stigmasterol으로 동정하였으며 항균효과를 측정한 결과 두 화합물 모두 유의성 있는 결과를 나타내었으며, 이 중 화합물 1인 continentalic acid이 더욱 우수한 활성을 나타내었다. 특히 그람 양성균인 S. aureus에서 MIC가 7.8㎍/㎖, E. faecalis에서는 MIC가 12.5 ㎍/㎖에서 비교적 강한 억제 효과를 보였으며, 화합물 2에서는 S. aureus에서 MIC가 7.8 ㎍/㎖ S. epidemidis에서는 MIC가 12.5 ㎍/㎖에서 억제 효과를 보여 주었으나 그람 음성균에서 100㎍/㎖ 이상으로 항균활성이 측정되지 않았다. 따라서 화합물 1과 화합물 2는 그람 양성균에 대한 새로운 항균제로 개발에 유용한 화합물이 될 것으로 기대된다.
- 항균력이 뛰어나고 안전성이 있는 물질을 분리하여 응용을 목적으로 예비 검색 결과에서 선택된 독활을 activity-guided isolation에 따라 에탄올 추출물 및 용매 분획물들의 액체배지와 고체배지에서의 항균력은 CHCI3분획에서 그람 양^균인 S. aureus에서 MIC가 31.2 ㎍/mg 와 6 mm 로 각각 높게 측정 되었다.
후속연구
- 5 ㎍/㎖에서 억제 효과를 보여 주었으나 그람 음성균에서 100㎍/㎖ 이상으로 항균활성이 측정되지 않았다. 따라서 화합물 1과 화합물 2는 그람 양성균에 대한 새로운 항균제로 개발에 유용한 화합물이 될 것으로 기대된다.
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