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문제 정의
- 일반적으로 H2O2에 의한 신경세포의 사멸은 caspase-3을 활성화시키는 apoptosis 경로로 유도 된다고 알려져 있다.22)본 논문에서는 석곡 추출물이 가지는 신경세포 보호 효과의 기전 연구를 위하여 산화적 스트레스로부터 유도되는 PC12 세포의 apoptosis의 활성 여부를 확인하였다. Apoptosis의 형태학적 특징 중의 하나인 핵의 변화를 관찰하기 위해서 핵 내 DNA에 특이적으로 결합하는 형광 염색제인 Howhst 33342를 사용하여 핵을 염색하고 형광 현미경으로 관찰하였다(Fig.
- 따라서 본 연구에서는 산화적 스트레스로부터 유도되는 신경세포의 사멸을 보호할 수 있는 생리활성물질을 탐색하기 위한 목적으로 석곡의 추출물을 이용하여 HzQ에 의해 손상된 PC12 신경 세포주에 대한 세포 보호효과를 밝히고자 하였다.
제안 방법
- 6-well plate에 2X105 cells/wellS. 24 시간 동안 배양하여 추출물 10, 50 ng/m/ 농도로 처리한 후, 0.5 mM H2O2를 처리하여 2시간 반응하였다. PBS 완충액으로 2회 세척하고 10% formaline- 처리하여 4시간 고정한 후 다시 PBS로 세척하고 Hoechst 33342(Sigma, MO, USA)로 30분 동안 염색하였다.
- 신경세포에서의 산화적 스트레스를 유도하기 위하여 H2O2를 시간별로 처리하였다. 96-well plate에 1 X105 cells/mZ 농도로 세포를 분주 한 후, 24시간 동안 배양하고 0.1, 0.5, 1 mM의 농도로 H2O2를 30, 60, 90, 120분간 노출 시킨 뒤 산화적 스트레스를 받아 50% 이하의 세포사멸을 유도하는 적정한 농도와 시간을 결정하였다.
- 5, 1 mM) of H2O2, and cell count after (a: 30 min, b: 60 min, c: 90 min, d: 120 min) incubation. After MTT assay, the MTT reduction rate (mean ± S.D. of triplicate determination) were calculated by setting each of control survivals in the absence of H2O2. *: p<0.
- Cell survival effects of DME was determined using MTT reduction assay (A) and LDH release assay (B). After MTT assay, the MTT reduction rate (means ± S.D. of triplicate determination) were calculated by setting each of control survivals in the absence of H2O2 and DME methanol extracts. Data were normalized to the activity of LDH release from vehicle-treated cells (100%) and expressed as percentage of the control (obtained separate plating).
- 22)본 논문에서는 석곡 추출물이 가지는 신경세포 보호 효과의 기전 연구를 위하여 산화적 스트레스로부터 유도되는 PC12 세포의 apoptosis의 활성 여부를 확인하였다. Apoptosis의 형태학적 특징 중의 하나인 핵의 변화를 관찰하기 위해서 핵 내 DNA에 특이적으로 결합하는 형광 염색제인 Howhst 33342를 사용하여 핵을 염색하고 형광 현미경으로 관찰하였다(Fig. 4A). 정상 세포의 핵은 타원형의 온전한 핵 모양을 나타낸 반면 산화적 손상을 입은 세포의 핵은 condensation과 fragmentatione-^- 인한 apoptotic body가 핵 주변에 나타나는 전형적인 apoptosis 특징을 나타내었다.
- LDH 측정에 의한 세포독성 확인. 석곡 추출물의 신경세포보호 효과를 측정하기 위한 방법으로 LDHQactate dehydrogenase) release assay를 실시하였다.
- 5% Triton X-100용액을 50 gZ 첨가하여 40rpm으로 10분 동안 shaking시켜 세포벽을 깨트린 다음, 같은 방법으로 LDH reagent 50㎕를 첨가하여 반응 시키고, 반응이 끝나면 반응 정지액을 넣은 뒤, 540nm에서 흡광도를 측정하였다. LDH에 의한 세포독성의 백분율은 배양액과 살아있는 세포에서 유리된 총 LDH에 대한 배양액으로부터 유리된 LDH의 값으로 계산하여 무처리 대조군과 비교한 값을 나타내었다.
- MTT 분석을 통한 세포 생존율 측정. 석곡 추출물의 신경세포 보호효과를 측정하기 위하여 MTT reduction assay를 실시하였다.
- ApoptosisS 유도하는 caspase-3는 cystein protease familily로써 활성화 되어 기질 결합체인 DEVD・pNA를분해하여 p-nitoranilin (pNA)를 생성하는데 이러한 성질을 이용하여 pNA의 푸른빛으로 활성정도를 측정할 수 있는 방법인 caspase-3 colorimetric assay를 실시하였다. PC12 세포에 0.5 mM RQ를 처리 하면 산화적 손상이 가해져서 약 4배 정도 높은 caspase-3 활성을 확인하였다. 이에 비해 석곡 추출물을 1, 5, 10, 50㎍/mZ로 처리한 경우에는 농도 의존적으로 caspase-3 의 활성이 감소하였으며 가장 높은 농도 50 ㎍/m/처리 시에는 그 활성도가 대조군에 비하여 1.
- 석곡 추출물의 신경세포보호 효과를 측정하기 위한 방법으로 LDHQactate dehydrogenase) release assay를 실시하였다. PC12 세포주를 IX10, cells/mZ로맞춘 후, 100 ㎕씩 96-well plate에 분주하여 CO2 incubator에서 24시간 동안 배양한 뒤, 1, 5, 10, 50 ㎍/㎖의 농도로 제조한 석 곡 추출물을 세포주에 처리하였다. 30분 후 0.
- 다음으로 석곡에 의한 신경 세포의 apoptosis 감소가 caspase-3과 관련이 있는지 확인하기 위하여 caspase-3의 활성을 확인해 보았다(Fig. 4B). ApoptosisS 유도하는 caspase-3는 cystein protease familily로써 활성화 되어 기질 결합체인 DEVD・pNA를분해하여 p-nitoranilin (pNA)를 생성하는데 이러한 성질을 이용하여 pNA의 푸른빛으로 활성정도를 측정할 수 있는 방법인 caspase-3 colorimetric assay를 실시하였다.
- 반응 후 well 바닥에 형성된 formazan이 흩어지지 않게 상등액을 제거하고 DMSO 100)1/ 첨가하여 녹이고 ELISA reader(Model 680, BioRad, USA)를 이용하여 540 nm 에서 흡광도를 측정하였다. 대조구 세포수를 100%로 하였을 때 상대적인 세포성장 억제율을 구하였다.
- 2와 같다. 먼저 H2O2에 의해 유도되는 PC12 세포주의 손상에 대한 신경세포 보호효과를 확인하기 위해 MTT reduction assay 방법을 이용하여 아무것도 처리하지 않은 정상군과 H2O2를 처리한 대조군 그리고 HQj와 석곡 추출물을 농도별로 처리한 실험군을 비교하였다. Fig.
- 신경세포가 외부환경에 민감하게 자극을 받으면 신경상해를 입는 것과 동시에 세포사의 발생으로 인한 세포의 형태학적인 변화가 나타난다21) 따라서 H2O2로 유도된 스트레스 상태의 PC12 세포주에서 석곡 추출물이 세포의 형태학적 변화에 미치는 영향을 일이.보기 위해 광학현미경 하에서 관찰하였다(Fig. 3). 정상군에 비해 대조군은 스트레스로 인하여 신경돌기가 거의 소멸된 양상을 보임으로써 신경세포의 형태학적으로 큰 변화가 유도된 것을 확인할 수 있으나, 석곡 추출물을 10 ㎍/W, 50 gg/mZ 처리하였을 때는 농도 의존적으로 신경세포의 생존을 확인할 수 있었다.
- 석곡 추출물에 대한 PC 12 세포주의 형태학적인 관찰을 위해 6-well plate에 2X105 cells/ well로 24시간 동안 배양하였다. 석곡 추출물을 농도별(1, 5, 10, 50㎍/mZ)로 처리한 후 0.5mM의 H2O2를 2시간 노출시켜 phase-contrast microscope(TS 100-F, Nikon, Tokyo, Japan) 로각 well의 세포형태를 관찰하고 100배로 사진 촬영하였다.
- 석곡 추출물의 신경세포 보호효과를 측정하기 위하여 MTT reduction assay를 실시하였다. 세포주를 IX105 cells/mZ로 맞추고 96-well plate에 각각 100 ㎕씩 첨가하여 24시간 동안 37℃, 5% CO2 incubator에서 배양한 후, DMSO에 녹인 석곡 추출물을 각각 1, 5, 10, 50ug/mZ의 농도로 처리하였다. 30분 동안 배양한 후 0.
- 산화적 스트레스 유도. 신경세포에서의 산화적 스트레스를 유도하기 위하여 H2O2를 시간별로 처리하였다. 96-well plate에 1 X105 cells/mZ 농도로 세포를 분주 한 후, 24시간 동안 배양하고 0.
- 본 연구팀에서는 국내 . 외에서 자생하고 있는 435가지의 약용식물 추출물을 대상으로 PC12 신경 세포주를 이용하여 H2O2 로부터 신경세포 보호효과를 갖는 천연추출물의 탐색을 시도하였다. 그 결과 석곡(Dendrobium nobile Lindl.
대상 데이터
- Louis, MO, USA)제품을 구입하였으며, LDH(Lactate dehydrogenase) release assay kit는 Wako Pure Chemical Industries, Ltd.(Osaka, Japan)로부터 구입하였다. 세포주 배양을 위해 필요한 Dulbecco's modified Eagle's medium(DMEM), fetal bovine serum(FBS), horse serum(HS) 및 penicillinstreptomycin 등은 Gibco-BRL(Grand Island, NT, USA) 에서구입하였으며, 그 외 연구에 사용된 용매 및 시약은 모두 일급이상의 등급을 사용하였다.
- 세포주 및 배양. 본 실험에 사용된 세포주는 rat pheochromocytoma PC 12로써 한국세포주은행 (KCLB)에서 분양받아 사용하였다. 사용된 배지는 DMEM medium에 10% fetal bovine serum(FBS), 5% horse serum(HS) 및 lOOunit/m/의 penicillin, lOOmg/mZ의 streptomycin을 첨가하여 사용하였고, 95%의 습도가 유지되는 37℃, 5% CO2 incubator(MCO-18AIC, SANYO, Osaka, Japan)에서 배양하였다.
- 시약 및 실험재료. 본 실험에서 사용된 석곡은 2006년 11월경 남 마산시 (주)금강제약으로부터 제공받아 추출하여 실험에 사용하였다. 신경세포 보호효과 실험에 사용된 시약으로 H2O2 (Hydrogen peroxide solution)와 MTT(3-[4, 5-dimethythiazol-2-yl]-2, 5-diphenyl tetrazolium bromide)는 Sigma Chemical Co.
- 본 연구팀에서는 국내 . 외에서 자생하고 있는 435가지의 약용식물 추출물을 대상으로 PC12 신경 세포주를 이용하여 H2O2 로부터 신경세포 보호효과를 갖는 천연추출물의 탐색을 시도하였다.
- 본 실험에 사용된 세포주는 rat pheochromocytoma PC 12로써 한국세포주은행 (KCLB)에서 분양받아 사용하였다. 사용된 배지는 DMEM medium에 10% fetal bovine serum(FBS), 5% horse serum(HS) 및 lOOunit/m/의 penicillin, lOOmg/mZ의 streptomycin을 첨가하여 사용하였고, 95%의 습도가 유지되는 37℃, 5% CO2 incubator(MCO-18AIC, SANYO, Osaka, Japan)에서 배양하였다.
- , Tokyo, Japan)에서 농축하여 용매 주줄 물을 얻었다. 석곡 메탄올 추출물은 5mg/mZ로 DMSO(dimethyl sulfbxide)에 녹여 적당한 농도로 희석하여 실험에 사용하였으며 이 추출물을 DME라고 명명하였다.
- (Osaka, Japan)로부터 구입하였다. 세포주 배양을 위해 필요한 Dulbecco's modified Eagle's medium(DMEM), fetal bovine serum(FBS), horse serum(HS) 및 penicillinstreptomycin 등은 Gibco-BRL(Grand Island, NT, USA) 에서구입하였으며, 그 외 연구에 사용된 용매 및 시약은 모두 일급이상의 등급을 사용하였다.
- 본 실험에서 사용된 석곡은 2006년 11월경 남 마산시 (주)금강제약으로부터 제공받아 추출하여 실험에 사용하였다. 신경세포 보호효과 실험에 사용된 시약으로 H2O2 (Hydrogen peroxide solution)와 MTT(3-[4, 5-dimethythiazol-2-yl]-2, 5-diphenyl tetrazolium bromide)는 Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA)제품을 구입하였으며, LDH(Lactate dehydrogenase) release assay kit는 Wako Pure Chemical Industries, Ltd.(Osaka, Japan)로부터 구입하였다.
데이터처리
- 모든 자료의 처리는 SPSS-PC+ 통계 package를 사용하여 처리하였다. 각 항목에 따라 백분율과 평균치 ± 표준편차(SD)를 구하고 각 추출물의 세포독성 정도를 비교하기 위해 one-way 분산분석(ANOVA)을 시행하여 F값을 구하고 Scheffe's test를 이용하여 대조군과 각 구간의 유의성 차이를 검증하였다. 통계적 유의성은 5% 수준에서 평가하였다.
- 각 항목에 따라 백분율과 평균치 ± 표준편차(SD)를 구하고 각 추출물의 세포독성 정도를 비교하기 위해 one-way 분산분석(ANOVA)을 시행하여 F값을 구하고 Scheffe's test를 이용하여 대조군과 각 구간의 유의성 차이를 검증하였다. 통계적 유의성은 5% 수준에서 평가하였다.
이론/모형
- 4B). ApoptosisS 유도하는 caspase-3는 cystein protease familily로써 활성화 되어 기질 결합체인 DEVD・pNA를분해하여 p-nitoranilin (pNA)를 생성하는데 이러한 성질을 이용하여 pNA의 푸른빛으로 활성정도를 측정할 수 있는 방법인 caspase-3 colorimetric assay를 실시하였다. PC12 세포에 0.
- extracts (DME) on the H2O2-induced oxidative stress cell death in PC12 cells. Cell survival effects of DME was determined using MTT reduction assay (A) and LDH release assay (B). After MTT assay, the MTT reduction rate (means ± S.
- MTT 분석을 통한 세포 생존율 측정. 석곡 추출물의 신경세포 보호효과를 측정하기 위하여 MTT reduction assay를 실시하였다. 세포주를 IX105 cells/mZ로 맞추고 96-well plate에 각각 100 ㎕씩 첨가하여 24시간 동안 37℃, 5% CO2 incubator에서 배양한 후, DMSO에 녹인 석곡 추출물을 각각 1, 5, 10, 50ug/mZ의 농도로 처리하였다.
- LDH 측정에 의한 세포독성 확인. 석곡 추출물의 신경세포보호 효과를 측정하기 위한 방법으로 LDHQactate dehydrogenase) release assay를 실시하였다. PC12 세포주를 IX10, cells/mZ로맞춘 후, 100 ㎕씩 96-well plate에 분주하여 CO2 incubator에서 24시간 동안 배양한 뒤, 1, 5, 10, 50 ㎍/㎖의 농도로 제조한 석 곡 추출물을 세포주에 처리하였다.
성능/효과
- 1과 같다. 0.1 mM의 H2O2 농도에서는 시간이 경과함에 따라(30, 60, 90, 120 분) 세포생존율(90.2, 87.7, 93.2, 91.3%)에는 거의 변화가 없었으며 0.5 mM의 농도에서는 시간이 경과함에 따라 각각 68.6, 59.0, 45.6, 44.6%를 가장 높은 농도인 1 mM의 농도에서는 38.9, 10.6, 9.3, 8.6%의 세포생존율을 보였다. 따라서 가장 적당한 산화적 스트레스 조건으로 45.
- 먼저 H2O2에 의해 유도되는 PC12 세포주의 손상에 대한 신경세포 보호효과를 확인하기 위해 MTT reduction assay 방법을 이용하여 아무것도 처리하지 않은 정상군과 H2O2를 처리한 대조군 그리고 HQj와 석곡 추출물을 농도별로 처리한 실험군을 비교하였다. Fig. 2A의 결과와 같이, 대조군의 세포 생존율은 47% 수준으로 떨어졌으나, 이때 석 곡 추출물 1, 5, 10, 50 pg/mZS 세포주에 처리했을 때 신경세포 생존율은 59.6%, 74.0%, 85.6%, 99.5%의 농도 의존적으로 세포가 회복되는 수준을 확인할 수 있었다. 또한 동일한 조건하에서 세포의 손상 정도를 확인하기 위하여 배양객 중에 들어 있는 LDH(lactate dehydrogenase)의 방출 양을 측정한 결과는 Fig.
- 외에서 자생하고 있는 435가지의 약용식물 추출물을 대상으로 PC12 신경 세포주를 이용하여 H2O2 로부터 신경세포 보호효과를 갖는 천연추출물의 탐색을 시도하였다. 그 결과 석곡(Dendrobium nobile Lindl.) 추출물로부터 강력한 신경세포 보호효과를 확인할 수 있었다. 본 연구에서 사용된 석곡은 난초과에 속한 금채석 곡(Dendrobium nobile Lindley) 또는 기타 동속 근연식물의 지상부를 건조한 것으로, 주요성분은 dendrobine, dendramine, nobilonine, dendrine 등이 있으며, 약리작용으로는 해열작용, 호흡 억제 작용, 심장흥분 억제 작용 등이 알려져 있다.
- 정상 세포의 핵은 타원형의 온전한 핵 모양을 나타낸 반면 산화적 손상을 입은 세포의 핵은 condensation과 fragmentatione-^- 인한 apoptotic body가 핵 주변에 나타나는 전형적인 apoptosis 특징을 나타내었다. 그러나 석 곡 추출물을 처리한 결과 핵의 condensation 현상과 fieagmentation이 현저히 감소함을 형광 현미경을 통하여 확인하였다(Fig. 4A). 이러한 결과는 HQ?에 의한 세포의 독성이 apoptosis에 기인함을 나타내며, 석곡은 이러한 조건에서 신경세포를 보호하는 효과를 나타낸다고 할 수 있다.
- 6%의 세포생존율을 보였다. 따라서 가장 적당한 산화적 스트레스 조건으로 45.6%의 생존율을 보인 0.5 mM의 H2O2를 2시간 처리하는 것으로 결정하였다.
- 정상군에 비해 대조군은 스트레스로 인하여 신경돌기가 거의 소멸된 양상을 보임으로써 신경세포의 형태학적으로 큰 변화가 유도된 것을 확인할 수 있으나, 석곡 추출물을 10 ㎍/W, 50 gg/mZ 처리하였을 때는 농도 의존적으로 신경세포의 생존을 확인할 수 있었다. 따라서 이러한 신경세포의 형태학적인 변화를 통하여 석곡 추출물은 H2O2 에 의한 신경세포 손상을 억제하거나 보호하는 효과가 있다는 것을 확신 할 수 있었다.
- 9%로 감소하였다. 이 결과는 석곡 추출물이 H2O2에 의해 유도된 PC12 신경세포 손상을 강력하게 억제한다는 것을 시사한다.
- 3). 정상군에 비해 대조군은 스트레스로 인하여 신경돌기가 거의 소멸된 양상을 보임으로써 신경세포의 형태학적으로 큰 변화가 유도된 것을 확인할 수 있으나, 석곡 추출물을 10 ㎍/W, 50 gg/mZ 처리하였을 때는 농도 의존적으로 신경세포의 생존을 확인할 수 있었다. 따라서 이러한 신경세포의 형태학적인 변화를 통하여 석곡 추출물은 H2O2 에 의한 신경세포 손상을 억제하거나 보호하는 효과가 있다는 것을 확신 할 수 있었다.
- 2B와 같다. 정상군에 비해 대조군은 약 50% 정도의 LDH 방출을 확인할 수 있는데 반해 석곡 추출물 1, 5, 10, 50 gg/ m/을 처리했을 때는 32.8, 29.9, 21.9, 18.9%로 감소하였다. 이 결과는 석곡 추출물이 H2O2에 의해 유도된 PC12 신경세포 손상을 강력하게 억제한다는 것을 시사한다.
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