[논문]Carbamoyl Phosphate Synthetase I이 요소회로 유전자를 발현하는 CHO 세포 주의 세포 성장과 재조합 Erythropoietin의 생산에 미치는 영향

조수미; 김나영; 김형진; 김홍진

Carbamoyl Phosphate Synthetase I이 요소회로 유전자를 발현하는 CHO 세포 주의 세포 성장과 재조합 Erythropoietin의 생산에 미치는 영향
Effects of Carbamoyl Phosphate Synthetase I against Cell Growth and Production of Recombinant Erythropoietin in Urea Cycle Enzyme Expressing CHO Cell Line 원문보기

약학회지 = Yakhak hoeji, v.51 no.3, 2007년, pp.214 - 218

조수미 (중앙대학교 약학대학) , 김나영 (중앙대학교 약학대학) , 김형진 (중앙대학교 약학대학) , 김홍진 (중앙대학교 약학대학)

Abstract ▼ AI-Helper

In the previous reports, we developed the CO5 by introducing genes for the first and second urea cycle enzymes, carbamoyl phosphate synthetase I (CPS I) and ornithine transcarbamoylase (OTC) into the IBE cell lines producing erythropoietin (EPO). The CO5 have been found out to have 15-20% higher cell growth rate and produce 2-times more EPO than the parental cell line, IBE. To investigate the role of CPS I in CO5 cell line for the cell growth and amount of EPO, we knock-downed CPS I gene expression via siRNA treatment. Expression level of EPO in cell lysate of CO5 was 3-5 fold higher than that of IBE. After siRNA treatment, the cell growth of CO5 was decreased 8-21% and the EPO productivity in the cell Iysate was significantly decreased. However, these changes of the cell growth and EPO productivity were not observed in IBE. These results indicate that CPS I gene expression is important for the increased cell growth and EPO productivity of CO5 cell line.

주제어

AI 본문요약
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제안 방법

동일 양의 samplee Laemm俨)의 방법에 따라 125% sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gel(SDS-PAGE)상에서 전개된 후 PVDF membrane에 transfer 되었다. 0.5% skim milk와 0.1% tween 20 이 함유된 20 mM THs・buff&에서 16시간 동안 blocking한 후 EPO를 확인하기 위해 1차 항체로 anti-human EPO polyclonal rabbit IgG(R&D Systems, USA)를 사용하였고 2차 항체로 HRP-conjugated anti-rabbit IgG(R&D Systems)를 사용하였으며 ECL chemilumine-scence solution(Santa Cruz, USA)을 기질로 효소 반응을 일으켜 X-ray 상에서 EPO를 확인하였다. IBE 와 CO₅ 내 EPO 의 양은 Kim et 尻의 방법에 따라 Scion image software(Scion Corporation, USA)를 사용하여 분석하였다.
60 mm에 1.5 乂 105 cells/mZ의 IBE와 CO₅를 5 mZ씩 seeding 한 후 minimum essential alpha medium(Gibco BRL, USA) 에 10% fetal bovine serum(Gibco BRL, USA), 1% penicillin- streptomycine(Gibco BRL), lmM carbamylglutamate(Sigma, USA), 5mM L-ornitine(Sigma)과 IM MTX가 함유된 배지로 37℃, 5% CO₂ 조건에서 배양하였고 12)배지 교환 없이 1, 2, 3, 4, 5및 6일차까지 배양된 세포는 PBS로 2회 세척한 후 세포 내 EPO 양을 아래 기술된 Western blotting 방법으로 확인하였다.
C05의 CPS I 억제에 따른 세포성장의 변화를 확인하기 위해 media, reagent, 및 control 군과 비교하였고 이를 대조군인 IBE 와 비교하였다. Fig.
IBE 세포 주는 Z)7^7?-deficient CHO 세포 주에 human EPO와 DHFR 유전자를 형질전환 시켰고 EPO 증폭을 위해 10-6 M methotrexete (MTX)로 선별하였다. CO₅ 세포 주는 IBE세포 주에 CPS I과 OTC 유전자를 형질전환 시켰다.
CO₅ 세포 주에서 CPS I이 세포 성장과 세포 내 EPS] 미치는 영향을 확인히기 위해 대조 군으로 IBE 세포주가 사용되었고 CPSL1을 transfection한 군은 배양 배지만 첨가한 군(media), transfection reagent를 첨가한 군(reagent), control siRNA를 transfection한 군(control)과 비교하였다. IBE와 CO₅ 세포 주는 six-well plate에 2.
CPS I의 억제에 따른 세포 내 EPO 양의 변화를 확인하기 위해 IBE와 CO₅에 media, reagent, control 및 CPSL1을 처리하였고 48시간 후 세포 내 EPO 양을 확인하였다. Fig.
군(control)과 비교하였다. IBE와 CO₅ 세포 주는 six-well plate에 2.5 x 105 cel0well로 seeding한 후 24시간 동안 배양하였고 hiperfect transfection reagent(Qiagen» 사용하여 control siRNA와 CPSL1 을 manuscript instructioii에 따라 transfection하였다. 24, 48, 72시간 후의 세포수의 변화는 hemocytometer를 사용하여 측정하였고 세포 내 EPO 양의 변화는 4&M간 배양 후 아래 기술된 Western blotting 방법을 통해 확인되었다.
時15)본연구에서는 Park et 瓦.과 Kim et 就(2)의 연구에 이어서 IBE 와 CO₅의 세포 내 EPO 양을 조사하였고 C05 세포 주에 도입된 CPS I과 OTC 유전자중 요소 회로의 첫 번째 효소인 CPS I 에 대한 siRNA를 transfection하여 CPS I의 발현 억제에 따른 세포 성장률과 세포 내 EPO 발현의 변화를 확인하였다.
(2) 또한 각각의 요소회로 유전자가 세포성장과 EPO 발현에 어떠한 영향을 미치는지는 밝혀지지 않았다. 따라서 본 연구에서는 IBE와 C05 세포 내 EPO 양을 1일차부터 6일차까지 측정하였고 siRNA를 이용하여 C05 내 요소회로 유전자 중 CPS I의 발현을 억제하여 그에 따른 세포 성장률과 세포 내 EPO 양의 변화를 분석하였다. IBE와 C05 세포 내 EPO 양을 분석한 결과 C05가 IBE에 비해 3~5배 많은 EPO가 존재한다는 결과를 확인하였다(Fig.

대상 데이터

주는 Z)7^7?-deficient CHO 세포 주에 human EPO와 DHFR 유전자를 형질전환 시켰고 EPO 증폭을 위해 10-6 M methotrexete (MTX)로 선별하였다. CO₅ 세포 주는 IBE세포 주에 CPS I과 OTC 유전자를 형질전환 시켰다.
CPS [에 대한 siRNA(CPSLl)는 5'-CTCCAAGAGTCTGTT- CCASIA3을 target sequence로 하여 sense sequence 5'- CCAAGAGUCUGUUCCACUA-3'와 antisense sequence 5'- UAGUGGAACAGACUCUUGG3로 제작되었고 대조 군으로 gene silencing 효과가 없다고 알려져 있는 control siRNA가 sense sequence 5'・UUCUCCGAACGUGUCACGU-3'와 antisense sequence 5MGUGACACGUUCGGAGAA3로 제작되었다 (Qiagen, USA).

이론/모형

5 x 105 cel0well로 seeding한 후 24시간 동안 배양하였고 hiperfect transfection reagent(Qiagen» 사용하여 control siRNA와 CPSL1 을 manuscript instructioii에 따라 transfection하였다. 24, 48, 72시간 후의 세포수의 변화는 hemocytometer를 사용하여 측정하였고 세포 내 EPO 양의 변화는 4&M간 배양 후 아래 기술된 Western blotting 방법을 통해 확인되었다.
1% tween 20 이 함유된 20 mM THs・buff&에서 16시간 동안 blocking한 후 EPO를 확인하기 위해 1차 항체로 anti-human EPO polyclonal rabbit IgG(R&D Systems, USA)를 사용하였고 2차 항체로 HRP-conjugated anti-rabbit IgG(R&D Systems)를 사용하였으며 ECL chemilumine-scence solution(Santa Cruz, USA)을 기질로 효소 반응을 일으켜 X-ray 상에서 EPO를 확인하였다. IBE 와 CO₅ 내 EPO 의 양은 Kim et 尻의 방법에 따라 Scion image software(Scion Corporation, USA)를 사용하여 분석하였다.
Quick freezing 방법을 사용하여 cell을 lysis 하였고 total protein을 Bradford 법으로 정량 하였다. 동일 양의 samplee Laemm俨)의 방법에 따라 125% sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gel(SDS-PAGE)상에서 전개된 후 PVDF membrane에 transfer 되었다.
Bradford 법으로 정량 하였다. 동일 양의 samplee Laemm俨)의 방법에 따라 125% sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gel(SDS-PAGE)상에서 전개된 후 PVDF membrane에 transfer 되었다. 0.

성능/효과

1의 결과에서 보는 것처럼 IBE는 1일과 2일차에 세포 내 EPO 양이 가장 많게 나타났고 3일차부터 그 양이 줄어 드는 것이 확인되었다. 4일차부터는 EPO가 가지는 35kDa의 분자량보다 낮은 분자량을 나타내어 세포 내에서 붕괴되는 것이 확인되었고 5일과 6일차에는 30kDa 미만의 분자량을 나타내어 세포 내 EPO가 모두 붕괴된 것이 확인되었다(Fig. 1). C05는 IBE 와 마찬가지로 1일과 2일차에 세포 내 EPO 양이 가장 많았으며 3일차부터 줄어 드는 것이 확인되었다(Fig.
이러한 결과로 볼 때 C05는 많은 양의 EPOS- 생산할 수 있지만 EPO를 배지 내로 분비하는 데는 한계가 있는 것으로 생각된다. C05 내 CPS I 를 CPS1-1로 억제한 결과 세포 성장률이 8~21%의 감소를 보였다(Fig. 2). 이는 CPS I이 C05의 성장률 증가에 관여한다는 것을 의미한다.
그러나 CPS I의 억제에 따른 성장률의 감소가 IBE의 성장률 수준으로 감소하지 못한 것은 OTC에 대한 억제가 이루어 지지 않았기 때문인 것으로 생각된다. CPS I 억제에 따른 세포성장률의 결과와 달리, CPS I의 발현 억제 시 C05 세포 내 EPO 양은 IBE 와 비슷한 수준으로 감소하여 세포 성장률과 차별되는 결과를 보였다(Fig. 3). 이는 CPS I이 EPO 생산증가에 매우 중요한 역할을 한다는 것을 의미한다.
비교하였다. Fig. 2에서 보는 것처럼 C05는 48시간과 72시간 배양 후 세포성장률이 IBE에 비해 40% 높게 나타났고 reagent와 control 처리 군은 IBE와 C05에서 media 처리 군에 비해 세포 성장이 약 10% 감소 하였다(Fig. 2). 이는 transfection reagent?} 가지는 독성 때문인 것으로 생각된다.
48시간 후 세포 내 EPO 양을 확인하였다. Fig. 3에서 보는 것처럼 IBE에 media, reagent, control 및 CPS 1-1을 처리한 군에서는 EPO 양의 변화가 일어나지 않았지만 CO₅의 CPS1-1 처리군 에서는 media, reagent 및 control 군에 비해 세포 내 EPO 가 감소하여 CPS I의 발현 억제가 세포 내 EPO 양을 감소시킨다는 것이 확인되었다(Fig. 3). 이 결과로서 CO₅ 내 CPS I이 EPO생산 증가에 매우 중요한 요소로 작용한다는 것이 확인되었다.
따라서 본 연구에서는 IBE와 C05 세포 내 EPO 양을 1일차부터 6일차까지 측정하였고 siRNA를 이용하여 C05 내 요소회로 유전자 중 CPS I의 발현을 억제하여 그에 따른 세포 성장률과 세포 내 EPO 양의 변화를 분석하였다. IBE와 C05 세포 내 EPO 양을 분석한 결과 C05가 IBE에 비해 3~5배 많은 EPO가 존재한다는 결과를 확인하였다(Fig. 1). 이는 Kim et 浏2)의 연구에서 배양 배지 내 존재하는 C05의 EPO 양이 IBE 보다 2배 많게 나타난 결과 보다 더 많은 차이를 보인다.
IBE와 CO₅ 세포 내 EPO 양을 western blotting으로 확인한 결과 Fig. 1의 결과에서 보는 것처럼 IBE는 1일과 2일차에 세포 내 EPO 양이 가장 많게 나타났고 3일차부터 그 양이 줄어 드는 것이 확인되었다. 4일차부터는 EPO가 가지는 35kDa의 분자량보다 낮은 분자량을 나타내어 세포 내에서 붕괴되는 것이 확인되었고 5일과 6일차에는 30kDa 미만의 분자량을 나타내어 세포 내 EPO가 모두 붕괴된 것이 확인되었다(Fig.
1). Scion image> 통한 densitometric assay 결과 C05 내 EPO 양은 IBE에 비해 1 일차에 5배 2일과 3일차에는 3배가 많음이 확인되었고 IBE와달리 5일과 6일차에도 세포 내에서 안정적으로 EPO가 유지됨을 확인하였다(Fig. 1). 이 결과로서 CO₅가 IBE보다 3~5배 많은 세포 내 EPO를 가진다는 것이 확인되었고 세포 내 EPO를더 안정적으로 유지할 수 있는 조건을 가짐이 확인되었다.
이는 Kim et 浏2)의 연구에서 배양 배지 내 존재하는 C05의 EPO 양이 IBE 보다 2배 많게 나타난 결과 보다 더 많은 차이를 보인다. 따라서 C05의 세포 내와 배양 배지 내 EPOS- 고려한 총 EPO 생산양은 IBE와 많은 차이를 보일 것으로 예상된다. 이러한 결과로 볼 때 C05는 많은 양의 EPOS- 생산할 수 있지만 EPO를 배지 내로 분비하는 데는 한계가 있는 것으로 생각된다.
우리는 지난 연구를 통해 요소회로의 첫 번째 두 번째 효소인 CPS I과 OTC를 CHO세포에 형질전환 시켰고 그 결과 세포 성장률이 증가되고 재조합 EPO의 생산이 증가된다는 결과를 얻었다. u, i2)그러나 epo는 배양 배지 내에서 측정되었고 세포 내에 남아 있는 EPO 양은 측정되지 않았다.
3). 이 결과로서 CO₅ 내 CPS I이 EPO생산 증가에 매우 중요한 요소로 작용한다는 것이 확인되었다.
이는 IBE와 달리 CO₅에 CPS1-1 이 특이적으로 반응한다는 것을 의미하고 CPS I 억제에 의해 세포 성장률이 감소한다는 것을 의미한다. 이 결과로서 CO₅ 세포의 성장률에 CPS I이 중요한 역할을 한다는 것이 확인되었다.
1). 이 결과로서 CO₅가 IBE보다 3~5배 많은 세포 내 EPO를 가진다는 것이 확인되었고 세포 내 EPO를더 안정적으로 유지할 수 있는 조건을 가짐이 확인되었다.

후속연구

u, i2)그러나 epo는 배양 배지 내에서 측정되었고 세포 내에 남아 있는 EPO 양은 측정되지 않았다.(2) 또한 각각의 요소회로 유전자가 세포성장과 EPO 발현에 어떠한 영향을 미치는지는 밝혀지지 않았다. 따라서 본 연구에서는 IBE와 C05 세포 내 EPO 양을 1일차부터 6일차까지 측정하였고 siRNA를 이용하여 C05 내 요소회로 유전자 중 CPS I의 발현을 억제하여 그에 따른 세포 성장률과 세포 내 EPO 양의 변화를 분석하였다.
있다.哄。) 이번 연구를 통한 CHO 세포 주에서 CPS I의 역할에 관한 결과는 이러한 동물세포 발현 시스템의 단점을 보완하는데 유용하게 사용 될 수 있을 것으로 예상된다. 앞으로의 연구에서는 C05 내 EPO가 세포 밖으로 분비되는 메커니즘과 OTC의 역할에 관한 자세한 연구가 이루어져야 할 것이다.
哄。) 이번 연구를 통한 CHO 세포 주에서 CPS I의 역할에 관한 결과는 이러한 동물세포 발현 시스템의 단점을 보완하는데 유용하게 사용 될 수 있을 것으로 예상된다. 앞으로의 연구에서는 C05 내 EPO가 세포 밖으로 분비되는 메커니즘과 OTC의 역할에 관한 자세한 연구가 이루어져야 할 것이다.

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저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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