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문제 정의
- 이에 본 연구에서는 백서에서 methotrexate에 의한 장관손상, 장내세균전위 , 체중과 장기무게 변화에 대한 글루타민의 효과를 알아보았다.
제안 방법
- Methotrexate 투여 48시간 후에 5 mg의 phenolsulfonphthalein (PS8 Sigma Chemical Co.)을 금속 경구 투여관을 이용하여 백서에 경구 투여 후 대소변을 분리하여 채취할 수 있는 대사 케이지 (metabolic cage)에서 PSP 투여 1시간 후부터 20시간 동안 소변을 수집하였다. 채집된 소변에서의 PSP 농도를 구하기 위하여 10mZ의 10% NaOH로 알칼리화 시킨 후 100 m/의 증류수를 이용하여 부피를 보정한 후에 559 nm의 파장에서 분광광도계 (Smartspect 300, Biorad, Hercules, CA, USA)로 측정하였다.
- 4g§k以day의 용량으로 일일 한차례 금속 경구 투여관을 이용하여 강제로 경구투여 하였으며 대조군과 methotrexate 투여군은 대조약물로 생리식염수를 같은 방법으로 경구투여 하였다. Methotrexate에 의한 장관손상은 methotrexate(Choongwae Pharmaceutical Co., Ltd., Seoul, KoreaX 20 mg瓜g 용량으로 일회 강제 경구투여 하여 유발하였다.
- 밑망을 설치하여 배설물이나 깔집 등 음식물이 아닌 것을 섭취하는 것을 방지하였다. 글루타민 투여군은 methotrexate 투여 시작 7일 전부터 L-glutamine(Daesang, Co., Ltd., Seoul, Korea)을 각각 L2g/k必day과 2.4g§k以day의 용량으로 일일 한차례 금속 경구 투여관을 이용하여 강제로 경구투여 하였으며 대조군과 methotrexate 투여군은 대조약물로 생리식염수를 같은 방법으로 경구투여 하였다. Methotrexate에 의한 장관손상은 methotrexate(Choongwae Pharmaceutical Co.
- 채취한 혈액에서 혈액검사와 지질과산화 측정을 위하여 혈청과 혈장을 분리하였다. 무균조작으로 장간막 림프절, 간, 비장, 신장 및 심장을 채취하여 무게를 측정한 후 이 중 100 mg을 장내세균 전위를 측정하기 위하여 채취하였다. 맹장의 장내세균수를 측정하기 위하여 맹장을 1cm 정도 절개한 후 대변 100 mg을 채취하였다.
- 배양하였다. 배양 후 각 배지에서 자란 집락 수를 관찰하여 CFU(colony-forming unit)/g으로 표시하였다. 장내세균전위를 알아보기 위하여 장간막 림프절 및 간, 비장, 신장 및 심장 100 mg을 소독된 Ten Broeck 조직파쇄기를 이용하여 균질화한 후 연속적으로 희석하고 그람 음성균수를 측정하기 위하여 MacConkey 한천배지에 접종하여 배양기에서 37℃로 48시간 동안 배양하였다.
- 백서들은 실험 시작 전 감염이나 기타 이상소견이 관찰되지 않았다. 백서들은 모두 4군으로 나누었으며 대조군, methotrexate 투여군, methotrexate 및 글루타민(glutamine) 1.2 g/kgeday 투여군, methotrexate 및 글루타민 2.4 g/keday 투여군으로 하였으며 각 군 당 백서 6마리를 배정하였다. 실험기간 동안 백서의 몸무게와 식이와 음용수의 섭취량을 측정하였다.
- 백서들은 실험기간 동안 고형사료와 물을 자유롭게 섭취하게 하였으며 매일 물과 사료의 섭취량과 몸무게의 변화를 측정하였다. 밑망을 설치하여 배설물이나 깔집 등 음식물이 아닌 것을 섭취하는 것을 방지하였다.
- , Seoul, Korea)에서 공급받아 실험 전 7일간 적응시켰다. 백서의 사육 시 12시간 간격으로 낮과 밤을 구별하고 사육 온도는 22±1℃로 유지하였으며 고형사료인 Basal diet 5053(PMI Nutrition International, Inc., Richimond, CA, USA)와 물을 자유롭게 섭취하게 하였다. 백서들은 실험 시작 전 감염이나 기타 이상소견이 관찰되지 않았다.
- 4 g/keday 투여군으로 하였으며 각 군 당 백서 6마리를 배정하였다. 실험기간 동안 백서의 몸무게와 식이와 음용수의 섭취량을 측정하였다.
- 배양 후 각 배지에서 자란 집락 수를 관찰하여 CFU(colony-forming unit)/g으로 표시하였다. 장내세균전위를 알아보기 위하여 장간막 림프절 및 간, 비장, 신장 및 심장 100 mg을 소독된 Ten Broeck 조직파쇄기를 이용하여 균질화한 후 연속적으로 희석하고 그람 음성균수를 측정하기 위하여 MacConkey 한천배지에 접종하여 배양기에서 37℃로 48시간 동안 배양하였다. 배양 후 각 배지에서 자란 집락 수를 관찰하여 CFU(colony-forming unit)/g로 표시하였다.
- 장투과성 검사를 위한 24시간 소변 채취 후 백서는 ketamine hydrochloride 100 n回kg 및 xylazine hydrochloride 60 mg/ kg를 근주하여 마취한 후에 무균조작으로 복부를 정중앙에서 절개하였다. 절개 직후 소장의 대장의 발적이나 부종과 같은 육안적인 손상을 관찰하였고 맹장으로부터 상방 20 cm의 회장에서 장 내용물을 100 mg을 채취하였다.
- 절개 직후 소장의 대장의 발적이나 부종과 같은 육안적인 손상을 관찰하였고 맹장으로부터 상방 20 cm의 회장에서 장 내용물을 100 mg을 채취하였다. 이후 횡경막을 절개하고 심장에서 혈액을 채취하여 백서를 사망시켰다.
- )을 금속 경구 투여관을 이용하여 백서에 경구 투여 후 대소변을 분리하여 채취할 수 있는 대사 케이지 (metabolic cage)에서 PSP 투여 1시간 후부터 20시간 동안 소변을 수집하였다. 채집된 소변에서의 PSP 농도를 구하기 위하여 10mZ의 10% NaOH로 알칼리화 시킨 후 100 m/의 증류수를 이용하여 부피를 보정한 후에 559 nm의 파장에서 분광광도계 (Smartspect 300, Biorad, Hercules, CA, USA)로 측정하였다.*) 측정치를 계산하여 복용한 PSP 중 회수된 양을 백분율로 표시하였다.
- 이후 횡경막을 절개하고 심장에서 혈액을 채취하여 백서를 사망시켰다. 채취한 혈액에서 혈액검사와 지질과산화 측정을 위하여 혈청과 혈장을 분리하였다. 무균조작으로 장간막 림프절, 간, 비장, 신장 및 심장을 채취하여 무게를 측정한 후 이 중 100 mg을 장내세균 전위를 측정하기 위하여 채취하였다.
- 회장 및 맹장에서 획득한 장내용물 중 100 mg을 취하여 연속적으로 희석한 후 장내 호기성균수를 측정하기 위하여 혈액한천배지와 장내 그람 음성균수를 측정하기 위하여 MacConkey 한천배지에 접종하여 배양기에서 37℃로 4S시간 동안 배양하였다. 배양 후 각 배지에서 자란 집락 수를 관찰하여 CFU(colony-forming unit)/g으로 표시하였다.
대상 데이터
- 7주령의 체중 180~200 g 정도의 수컷 Sprague-Dawley 백서 24마리를 오리엔트 바이오사(Orient Bio Co., Ltd., Seoul, Korea)에서 공급받아 실험 전 7일간 적응시켰다. 백서의 사육 시 12시간 간격으로 낮과 밤을 구별하고 사육 온도는 22±1℃로 유지하였으며 고형사료인 Basal diet 5053(PMI Nutrition International, Inc.
데이터처리
- 모든 수치는 평균土표준편차로 표시하고 각 군 간의 차이는 SPSS 11.5 프로그램 (SPSS Inc, Chicago, IL, USA)을 이용하여 Mann-Whitney 검정법으로 p값이 0.05 이하인 경우를 유의성이 있는 것으로 판정하였다.
성능/효과
- 글루타민 투여군에서는 methotrexate 단독 투여군에 비해 원위부 회장 및 맹장의 장내세균 수의 차이가 없었다(Eble m). Methotrexate 단독 투여군에서 대조군보다 장간막 림프절, 간 및 비장에서 그람음성균의 장내세균 전위가 증가하였다. 글루타민 1.
- 이번 연구에서도 methotrexate를 투여한 백서에서 대조군에 비해 장투과성이 증가 되었고, 장간막 림프절, 간, 비장으로의 장내세균전위가 증가하였다. 그러나 장내세균은 대조군보다 오히려 감소하는 양상이었으며 특히 장내세균전위의 정도에 중요한 영향을 미치는 맹장의 그람음성균의 수는 의미 있게 감소하였다. 장내세균수의 감소는 methotrexate의 항균작용에 의한 것으로 생각되며 이는 장내세균의 과증식을 보인 이전의 연구&와 반대의 소견이다.
- Methotrexate 단독 투여군에서 대조군보다 장간막 림프절, 간 및 비장에서 그람음성균의 장내세균 전위가 증가하였다. 글루타민 1.2 g/kg/day 투여군에서는 methotrexate 단독투여군과 장간막 림프절, 간 및 비장에서의 그람음성균의 장내세균전위가 차이가 없었으나, 글루타민 2.4 加以 day 투여군에서는 장내세균전위가 감소하였다(Eble IV).
- Methotrexate 단독 투여군에서 대조군보다 장간막 림프절, 간 및 비장에서 그람음성균의 장내세균 전위가 증가하였다. 글루타민 1.2 g/kg/day 투여군에서는 methotrexate 단독투여군과 장간막 림프절, 간 및 비장에서의 그람음성균의 장내세균전위가 차이가 없었으나, 글루타민 2.40kg/ day 투여군에서는 장내세균전위가 감소하였다(Table IV).
- 글루타민은 소장과 대장의 상피세포의 에너지원이 되지만 장내세균도 일종의 세포이므로 경구투여가 장내세균의 과증식을 유발 할 수 있으므로, 글루타민을 비경구로 투여하는 것이 유리하다는 주장도 있었다. 그러나 이번 연구에서 감소한 장내세균의 수에 영향을 주지 못하였으므로 최소한 면역억제제에 투여 시 글루타민에 의한 장내세균 과증식의 가능성은 적다고 할 수 있다.
- 면역억제제인 methotrexate는 장내세균의 고]증식 없이 장관장벽손상을 유발하여 장내세균전위를 유발하고, 글루타민은 2.4 g/ kg/day의 고투여 용량에서 methotrexate에 의한 장관장벽손상 과장 내 세균 전위를 억제하였다. 또한 methotrexatee 체중감소와 간의 장기무게를 감소시켰으나 글루타민의 투여는 이를 개선하지 못하였다.
- 그러나 이번 연구에서 감소한 장내세균의 수에 영향을 주지 못하였으므로 최소한 면역억제제에 투여 시 글루타민에 의한 장내세균 과증식의 가능성은 적다고 할 수 있다. 이번 연구에서 Methotrexate에 의한 장내세균전위의 증가는 장간막 림프절, 간, 비장에서만 증가하였고 신장과 심장에서는 관찰되지 않았다. 이는 이번 연구와 같은 방법으로 비스테로이드성 항염제에 의한 장관손상 및 장내세균전위에 대해 알아본 실험 결과를 비교하여 보았을 때, 장관장벽의 손상이 심하지 않고 다른 병태모델과는 달리 장내세균의 과증식이 발생하지 않았으며 methotrexatee] 항균작용도 어느 정도 기여했기 때문으로 생각된다.
- 0g/k以day의 단일 용량이라는 제한점이 있다. 이번 연구에서는 글루타민을 1.2g@day과 2.4g/kg/ day의 용량으로 투여하였는데 2.4 g/kg/day의 용량의 투여에서 장투과성의 methotrexate 단독투여보다 감소흐卜였다. 이번 연구의 결과로 글루타민은 경관급식과 같은 기존에 장관손상을 억제할 수 있다고 알려져 있는 물질과의 병합투여 없이 단독투여로 methotrexate에 의한 장관손상을 억제할 수 있음을 알 수 있다.
- 장내세균의 과증식이 동시에 관찰된다. 이번 연구에서도 methotrexate를 투여한 백서에서 대조군에 비해 장투과성이 증가 되었고, 장간막 림프절, 간, 비장으로의 장내세균전위가 증가하였다. 그러나 장내세균은 대조군보다 오히려 감소하는 양상이었으며 특히 장내세균전위의 정도에 중요한 영향을 미치는 맹장의 그람음성균의 수는 의미 있게 감소하였다.
- 4 g/kg/day의 용량의 투여에서 장투과성의 methotrexate 단독투여보다 감소흐卜였다. 이번 연구의 결과로 글루타민은 경관급식과 같은 기존에 장관손상을 억제할 수 있다고 알려져 있는 물질과의 병합투여 없이 단독투여로 methotrexate에 의한 장관손상을 억제할 수 있음을 알 수 있다. 그러나 투여해야 하는 글루타민의 양이 많으므로 실제 임상 적용에는 글루타민 투여양이 제한점으로 작용할 수 있으며 저용량의 지속적인 methotrexate 투여에 대한 글루타민의 장기투여의 효과에 대한 추가적인 연구가 필요하다.
- 장관장벽의 기능을 나타내는 장투과성은 대조군보다 methotrexate 단독 투여군에서 증가하였다. 글루타민 1.
후속연구
- 있다. 8)그러나 이 연구는 장관손상과 장내세균전위 실험동물 연구에 일반적으로 사용하지 않는 실험동물을 이용한 연구이며 고용량의 methotrexate를 사용하여 장관손상을 유발하였음에도 불구하고 투여된 글루타민의 양이 1.0g/k以day의 단일 용량이라는 제한점이 있다. 이번 연구에서는 글루타민을 1.
- 글루타민이 도움이 되었다.皿圮 그러나 본 연구에서는 methotrexate에 의한 체중과 간의 무게 감소에 고용량의 글루타민의 단기투여는 개선효과가 없었으며, 저용량의 지속적인 methotrexate 투여에 대한 글루타민의 장기투여의 효과에 대한 추가적인 연구가 필요하다.
- 또한 methotrexatee 체중감소와 간의 장기무게를 감소시켰으나 글루타민의 투여는 이를 개선하지 못하였다. 그러나 이번 연구는 다량의 me나lotrexate의 투여에 대한 고용량의 글루타민 투여 효과에 대한 연구이므로, 저용량의 지속적인 methotrexate 투여에 대한 글루타민의 장기투여의 효과에 대한 추가적인 연구가 필요하며, 실험동물 결과를 기초로 한 임상연구가 병행 되어야 할 것으로 생각된다.
- 이번 연구의 결과로 글루타민은 경관급식과 같은 기존에 장관손상을 억제할 수 있다고 알려져 있는 물질과의 병합투여 없이 단독투여로 methotrexate에 의한 장관손상을 억제할 수 있음을 알 수 있다. 그러나 투여해야 하는 글루타민의 양이 많으므로 실제 임상 적용에는 글루타민 투여양이 제한점으로 작용할 수 있으며 저용량의 지속적인 methotrexate 투여에 대한 글루타민의 장기투여의 효과에 대한 추가적인 연구가 필요하다.
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