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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 뽕잎추출물에 눈꽃 동충하초 균사체를 배양한 배양물을 멜라닌 생성 세포(B16BL6 mouse melanoma cell)에 처리함으로써 뽕잎 자체의 독성제거 효과와 멜라닌 생합성의 억제 기작을 확인하여 피부미백용 화장료 조성물로서의 이용가능성을 조사하였다.
제안 방법
- UV-Vis spectrophotometerxz- Ultrospec 2000 (Pharmacia Biotec, Swiss)을 사용하였고, melanin 생 합성 측정은 ELISA reader (Synergy™ HT. Bio-tek, USA)를 사용하여 490 nm파장에서 흡광도로 측정하였다. 기타 활성 측정 및 분석에 사용된 시약은 특급시약을 사용하였다.
- 25% trypsin-EDTA 용액을 처리하여 세포를 수확한 후, 원심분리하여 ceH pellet의 색을육안으로 판정하였다. 그 후 1 N NaOH 용액 0.5 ml 을 넣고 세포를 100℃, 2시간 처리하여 세포 내 멜라닌을 녹인 다음 490 nm 에서 흡광도를 측정 하여[6], 배 양액을 처 리하지 않은 세포의 멜라닌 양과 비교하여 배양액이 멜라닌 생성에 미치는 영향을 알아보았다.
- 24시간 배양하였다. 배양 후 1% FBS가 첨가된 MEM 배지로 교환 한 후, 뽕잎추출물과 뽕잎추출물을 이용한 동충하초 균사체 배양액을 각각 0, 1, 3, 5, 7, 10, 20%의 농도로 처리하였다. 시료처리 4일 후 0.
- MEM 배지를 사용하여 6 weU plate에 5xl04 cells/ ml 을 각각 5 ml 씩 넣고 5% COz, 37℃에서 24시간 배양 후에는 1% FBS가 첨가된 MEM 배지로 교환하였다. 뽕잎 추출물과 동충하초 균사체 배양액을 0, 1, 3, 5, 7, 10, 20, 30, 40, 50% 농도로 각각 처 리하여 24시간동안 배 양한 흑, 배양 상등액을 제거하였다. 그 후 PBS buffer (pH 7.
- 뽕잎추출물을 이용한 동충하초 균사체 배양액의 tyrosinase 활성 억제율을 측정하기 위하여, 96 well plate (SPL. Korea) 에 10 mM L-tyrosine 25 μl를 첨가한 후, 뽕잎추출물과 뽕잎추출물을 이용한 동충하초 균사체 배양액을 각각 0, 1, 3, 5, 7, 10, 20, 30, 40, 50%씩 각각 첨가하여, mushroom tyrosinase (2, 500 unit, Sigma Chemical Co., USA) 3μl를 넣고 50 mM 인산완충용액으로 최종 200 μl가 되게 조절하여 반응시켰다. 그 후 30℃에서 30분 동안 1분 간격으로 ELISA reader를 사용하여 490 nm에서 흡광도를 측정하여 tyrosinase 활성억제율을 다음의 식에서 구할 수 있었다.
- 뽕잎추출물을 이용한 동충하초 균사체 배양액의 멜라닌 생합성 억제 효능을 평가하기 위하여 B16BL6 mouse melanoma cell (5x104 cells/ ml) 을 6 well plate에 각각 5 ml 씩 넣고 24시간 배양하였다. 배양 후 1% FBS가 첨가된 MEM 배지로 교환 한 후, 뽕잎추출물과 뽕잎추출물을 이용한 동충하초 균사체 배양액을 각각 0, 1, 3, 5, 7, 10, 20%의 농도로 처리하였다.
- 뽕잎추출물을 이용한 동충하초 균사체 배양액의 세포 생존에 미치는 영향을 측정하기 위하여, crystal violet assay법[5 을 응용하여 사용하였다. MEM 배지를 사용하여 6 weU plate에 5xl04 cells/ ml 을 각각 5 ml 씩 넣고 5% COz, 37℃에서 24시간 배양 후에는 1% FBS가 첨가된 MEM 배지로 교환하였다.
- -100 ng/ ml를 첨가하였으며, 약 24시간 주기로 MEM 배지를 교체하였다. 세포 수확에 있어서는 trypsin-EDTA (Gibco. Co.)를 cello] 부착되어 있는 dish에 5분간 처리한 후 trypsin-EDTA를 완전히 제거하고, MEM 배지를 이용하여 수확하는 방법을 사용하였다[2이.
- 배양 후 1% FBS가 첨가된 MEM 배지로 교환 한 후, 뽕잎추출물과 뽕잎추출물을 이용한 동충하초 균사체 배양액을 각각 0, 1, 3, 5, 7, 10, 20%의 농도로 처리하였다. 시료처리 4일 후 0.25% trypsin-EDTA 용액을 처리하여 세포를 수확한 후, 원심분리하여 ceH pellet의 색을육안으로 판정하였다. 그 후 1 N NaOH 용액 0.
- 2)로 3회 세척하였다. 염 색된 세포로부터 crystal violet의 추출은 95% ethanol을 1시간 동안 상온에서 처리하였으며, 추출액을 540 nm 파장에서 측정한 흡광도를 통하여 세포의 생존율을 비교하였다.
- Green power, Korea) 로 추출 하였다. 이 추출물을 멸균증류수와 1:1 (v/ V)로 혼합하고, 약 0.5 cm 크기의 정사면체 감자 조각을 2% 되게 첨가하여 동충하초 균사체 액체 배양용 배지를 제조하였다. 그 후 전 배양한 동충하초 균사체 1/ 2 plate를 1 L 액체배지에 접종하여 25℃, 120 rpm의 조건으로 15일간 진탕배양 하였다.
대상 데이터
- B16BL6 mouse melanoma cell (No. 80006) 은 CO 세포 배양기(37℃, 5% CO2)에서 10% fetal bovine serum (Gibco. Co.)이 포함된 MEM 배지를 사용하여 배양하였다. 여기에 penicillin-streptomycin (Sigma Chemical Co.
- 본 실험에 사용된 버섯 균사체는 경남농업기술원으로부터 분양받은 눈꽃 동충하초(Paecilomyces japonica) 균사체를 사용하였으며, 뽕잎은 경남 함양군 안의면 일대의 야산에서 서식하는 야생 뽕잎을 채취하여 사용하였다. 세포주인 B16BL6 mouse melanoma cell (No.
- 뽕잎 추출물에 동충하초 균사체 배양을 위하여, potato dextrose agar (PDA. Difco, USA) 배지에서 7일간 25℃에서 정치 배양한 눈꽃 동충하초 균사체를 사용하였다. 뽕잎 추출액은 천연재료인 야생뽕잎을 흐르는 물에 3번 수세한 후, 다시 증류수에 최종 수세하여 착즙기(3-8-3626.
- 야생 뽕잎을 채취하여 사용하였다. 세포주인 B16BL6 mouse melanoma cell (No. 80006)은 한국 세포주 은행으로부터 분양받아 사용하였으며, 우태아 혈청 (Fetal Bovine Serum, FBS)은 Gibco 사의 것을, 배양용 배지(Minimum Essential Medium. MEM)는 Sigma 사의 것을 사용하였다.
성능/효과
- Fig. 1, 2에서 보는 바와 같이 배양액을 20% 첨가 시 50%의 멜라닌생성 관련 효소의 활성 억제효과를 보였으며, 최종 50% 농도에서는 tyrosinase 활성을 100% 억제시키는 것을 관찰할 수 있었다. 하지만 뽕잎 추출물만으로는 20% 첨가 시 거의 억제율을 보이지 않았으며, 최종 50% 농도에서도 20%의 억제율을 관찰하였다.
- 3과 4에서와 같이 나타내었다. 그 결과 뽕잎 추출물 7% 처리 시 50%의 세포가 사멸하는 것을 보였으며, 2Q%이상 처리 시 에는 세포가 모두 사멸됨을 확인하였다. 그러나 뽕잎 추출물을 이용한 동충하초 균사체 배양액은 50% 처리 시까지 세포독성이 전혀 나타나지 않는 것을 관찰하였다(Fig.
- 3)에서 보여주었듯이 세포독성으로 세포가 생육하지 못한 결과로 측정된다. 따라서 동충하초 균사체가 뽕잎 추출물을 기질로 하여 대사 하는 과정에서 미백활성은 점진적으로 증가 시키는 반면 독성은 감소시킨 것으로 판단된다.
- 5A에서와 같이 뽕잎 추출물은 10% 이상 처리 시에 멜라닌 생합성의 억제가 관찰되었다. 또한 뽕잎 추출물을 이용한 동충하초 균사체 배양액의 경우 Fig. 5B와 같이 3% 처리부터 육안으로 세포의 멜라닌 생합성이 억제됨을 관찰하였고, 더욱더 정확한 억제율을 확인하기 위하여 흡광도를 측정을 한 결과 10% 처리에서 60%, 20%에는 80%의 멜라닌 생합성이 억제됨을 확인할 수 있었다. 이 결과에서 볼 때 뽕잎 추출물 자체의 멜라닌 합성 억제 활성은 아주 약하며, 이러한 효과 역시 앞의 자료 (Fig.
- 뽕잎 추출물을 이용한 동충하초 균사체 배양액의 tyrosinase 활성 억제를 조사한 결과 시료의 처리 농도가 높아질수록 멜라닌 생성 억제율이 증가하는 것을 관찰하였다.
- 뽕잎 추출액과 뽕잎추출물을 이용한 동충하초 균사체 배양액의 멜라닌 생합성 억제율을 B16BL6 mouse melanoma cell을 이용한 결과 Fig. 5A에서와 같이 뽕잎 추출물은 10% 이상 처리 시에 멜라닌 생합성의 억제가 관찰되었다. 또한 뽕잎 추출물을 이용한 동충하초 균사체 배양액의 경우 Fig.
- 5B와 같이 3% 처리부터 육안으로 세포의 멜라닌 생합성이 억제됨을 관찰하였고, 더욱더 정확한 억제율을 확인하기 위하여 흡광도를 측정을 한 결과 10% 처리에서 60%, 20%에는 80%의 멜라닌 생합성이 억제됨을 확인할 수 있었다. 이 결과에서 볼 때 뽕잎 추출물 자체의 멜라닌 합성 억제 활성은 아주 약하며, 이러한 효과 역시 앞의 자료 (Fig. 3)에서 보여주었듯이 세포독성으로 세포가 생육하지 못한 결과로 측정된다. 따라서 동충하초 균사체가 뽕잎 추출물을 기질로 하여 대사 하는 과정에서 미백활성은 점진적으로 증가 시키는 반면 독성은 감소시킨 것으로 판단된다.
- 4). 이 결과에서 볼 때 뽕잎 추출물 자체의 세포독성을 동충하초 균사체가 배양됨에 따라 점진적으로 제거되어 배양 최종일에는 완전히 제거 되었을 것으로 판단된다. 그리고 세포에 대한 독성이 없는 것으로 보아 차후 화장품소재로 이용하였을 때, 피부에 자극적 인 부작용이 없을 것으로 사료되며, 동충하초 균사체 배양액의 피부자극실험은 이 등[16]이 앞서 보고 한 바 있어 화장품 소재로서의 부작용은 없을 것으로 판단된다.
- 하지만 뽕잎 추출물만으로는 20% 첨가 시 거의 억제율을 보이지 않았으며, 최종 50% 농도에서도 20%의 억제율을 관찰하였다. 이러한 결과는 뽕잎 자체에서도 어느 정도의 멜라닌 합성 억제를 보이지만 동충하초 균사체를 배양함으로써, 합성 억제율이 크게 증가함을 관찰할 수 있었다.
- 1, 2에서 보는 바와 같이 배양액을 20% 첨가 시 50%의 멜라닌생성 관련 효소의 활성 억제효과를 보였으며, 최종 50% 농도에서는 tyrosinase 활성을 100% 억제시키는 것을 관찰할 수 있었다. 하지만 뽕잎 추출물만으로는 20% 첨가 시 거의 억제율을 보이지 않았으며, 최종 50% 농도에서도 20%의 억제율을 관찰하였다. 이러한 결과는 뽕잎 자체에서도 어느 정도의 멜라닌 합성 억제를 보이지만 동충하초 균사체를 배양함으로써, 합성 억제율이 크게 증가함을 관찰할 수 있었다.
후속연구
- 이 결과에서 볼 때 뽕잎 추출물 자체의 세포독성을 동충하초 균사체가 배양됨에 따라 점진적으로 제거되어 배양 최종일에는 완전히 제거 되었을 것으로 판단된다. 그리고 세포에 대한 독성이 없는 것으로 보아 차후 화장품소재로 이용하였을 때, 피부에 자극적 인 부작용이 없을 것으로 사료되며, 동충하초 균사체 배양액의 피부자극실험은 이 등[16]이 앞서 보고 한 바 있어 화장품 소재로서의 부작용은 없을 것으로 판단된다.
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