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문제 정의
- 본 연구는 뽕잎 추출물을 배지로 눈꽃 동충하초 균사체 배양시 배양 상등액의 여드름균(Propionibacterium acnes) 억제효과를 확인함으로써 여드름 제거 기능성 화장품 조성물로서의 이용가능성을 조사하였다.
- 본연구는뽕잎추출물에눈꽃동충하초균사체(Paecilomyces japonica) 배양액의 Propionibacterium acnes에 대한 생육 억제 활성을 조사한 것이다. 배양 배지내의 뽕잎 추출물 농도는 3%일 때 가장 높은 여드름 균 생육 억제 활성이 나타났으며, 3% 농도의 뽕잎 추출물을 이용한 균사체 배양 날짜별 활성은 25일 배양시 가장 높은 여드름 균 생육 억제 활성을 확인 할 수 있었다.
제안 방법
- 5 cm 정사면체 감자 조각 5%를 첨가 하여 동충하초 균사체 액체 배양용 배지를 제조하였다. 그 후 전 배양한 동충하초 균사체 1/ 2 plate를 500 ml 동충하초 균사체 액체 배양용 배지에 접종하여 25℃, 120 rpm의 조건으로 진탕배양 하였으며, 배양일을 5, 10, 15, 20, 25, 30일 간격으로 각각 배양후 배양액을 회수하여 13,000 rpm에서 10분간 원심분리 후 상등액을 0.2 ㎛ syringe filter (Sartorius, Germany)로 여과하여 4℃에 보관하며, 3% 뽕잎 추출액에 동충하초 균사체 배양일수별 활성 측정 시료로 사용하였다.
- 0 mm)를 이용하여 도말 하였다. 그 후, 준비된 시료를 각각의 농도별로 paper disk에 농축시켜서 처리 하였다. 이때 시료의 농축은 Dry oven을 이용하여 37℃에서 농축하여 사용하였다.
- 뽕잎 추출물 배지에 접종할 액체 배양용 동충하초 균사체를 배양하기 위하여 PDA(Potato Dextrose agar)에 눈꽃 동충하초 균사체를 접종하여 7일간 25℃에서 정체 배양하여 사용하였다. 뽕잎은 앞서 준비된 건조 뽕잎을 멸균증류수에 3% 농도로 혼합하고, 기질로는 약 0.
- 뽕잎 추출물에 동충하초 균사체 배양 날짜별 단백질 패턴을 확인하기 위하여, 앞서 배양일수별 배양된 배양액을 12% acrylamide gel에 각 배양액 100 ㎕를 전기 영동 하였다. 그 후, Coomassie blue 염색법에 의하여 염색하여 protein 발현 양상을 확인하였다.
- 동충하초 균사체를 배양하기 위하여 PDB(Potato Dextrose Broth)에 눈꽃 동충하초 균사체를 접종하여 7일간 25℃에서 정체 배양하였다. 뽕잎은 앞서 준비된 건조 뽕잎을 멸균증류수에 1, 3, 5, 7% 농도로 각각 혼합하고, 기질로는 약 0.5 cm 정사면체 감자 조각 5%를 첨가 하여 동충하초 균사체 액체 배양용 배지를 제조하였다. 그 후 전 배양한 동충하초 균사체 1/ 2 plate를 500 ml 동충하초 균사체 액체 배양용 배지에 접종하여 25℃, 120 rpm의 조건으로 15일 진탕배양 하였으며, 배양이 완료된 후 배양액을 회수하여 13,000 rpm에서 10분간 원심분리하고 상등액을 0.
- 뽕잎 추출물 배지에 접종할 액체 배양용 동충하초 균사체를 배양하기 위하여 PDA(Potato Dextrose agar)에 눈꽃 동충하초 균사체를 접종하여 7일간 25℃에서 정체 배양하여 사용하였다. 뽕잎은 앞서 준비된 건조 뽕잎을 멸균증류수에 3% 농도로 혼합하고, 기질로는 약 0.5 cm 정사면체 감자 조각 5%를 첨가 하여 동충하초 균사체 액체 배양용 배지를 제조하였다. 그 후 전 배양한 동충하초 균사체 1/ 2 plate를 500 ml 동충하초 균사체 액체 배양용 배지에 접종하여 25℃, 120 rpm의 조건으로 진탕배양 하였으며, 배양일을 5, 10, 15, 20, 25, 30일 간격으로 각각 배양후 배양액을 회수하여 13,000 rpm에서 10분간 원심분리 후 상등액을 0.
- 여러 배지에서 동충하초 균사체를 배양했을 때와 뽕잎 추출물에 배양했을 때의 차이점을 조사하기 위하여, 배지별 동충하초 균사체 배양액제조를 위하여 기질로 쓰이는 5% 감자만으로 만든 배지와 합성 배지인 PD broth와 3% 뽕잎 추출물 배지를 500 ml 씩 제조하였다. 그 후 액체 배양용 동충하초 균사체를 사용하기 위하여 PD agar 배지에 눈꽃 동충하초 균사체를 접종하여 7일간 25℃에서 정체 배양한 것을 사용하였다.
- 열에 의한 활성도 변화를 관찰하기 위하여 앞서 배양된 3% 뽕잎 추출물에 동충하초 균사체 25일 배양액을 E-tube에 넣고, 100℃의 온도에서 15, 30, 45, 60, 90, 120 min 씩 각각 처리한 후 각 시료 350 ㎕를 paper disk에 농축하여 여드름균 생육활성 억제 효과를 조사하였다.
대상 데이터
- 본 실험에 사용된 버섯 균사체는 경남농업기술원으로부터 분양받은 눈꽃 동충하초(Paecilomyces japonica) 균사체를 사용하였으며, 뽕잎은 경남 함양군 안의면 일대의 야산에서 서식하는 야생 뽕잎을 채취하여, 자연 건조후 분쇄하여 사용하였다. 여드름 균인 Propionibacterium acnes는 한국 미생물보존센터 (KCCM.
- 실험에 사용된 여드름 균인 Propionibacterium acnes의 배양은 RC(Reinforced clostridial) 배지를 이용하였으며, -70℃에 동결 보존하여 필요시 마다 해동하여 사용하였다. 항균 활성 측정시 균주 배양은 보존중인 균을 1차 RC agar 배지에 48 시간 배양 후, 다시 RC 액체 배지에 접종하여 48 시간 배양하였으며, UV-Vis spectrophotometer를 사용하여 660nm에서 O.
- 본 실험에 사용된 버섯 균사체는 경남농업기술원으로부터 분양받은 눈꽃 동충하초(Paecilomyces japonica) 균사체를 사용하였으며, 뽕잎은 경남 함양군 안의면 일대의 야산에서 서식하는 야생 뽕잎을 채취하여, 자연 건조후 분쇄하여 사용하였다. 여드름 균인 Propionibacterium acnes는 한국 미생물보존센터 (KCCM. 6919)에서 분양받아 조사하였다. 균수 및 멜라닌 측정에 사용된 UV-Vis spectrophotometer는 Ultrospec 2000 (Pharmacia Biotec, Swiss)을 사용하였고 기타 활성 측정 및 분석에 사용된 시약은 특급시약을 사용하였다.
이론/모형
- 뽕잎 추출물에 동충하초 균사체 배양 날짜별 단백질 패턴을 확인하기 위하여, 앞서 배양일수별 배양된 배양액을 12% acrylamide gel에 각 배양액 100 ㎕를 전기 영동 하였다. 그 후, Coomassie blue 염색법에 의하여 염색하여 protein 발현 양상을 확인하였다.
성능/효과
- 3% 뽕잎 추출물에 25일간 동충하초 균사체 배양액의 농도별 여드름균 생육 억제 활성을 측정한 결과 그림 5와 같이 50 ㎕에서 약한 활성을 관찰하였으며 처리 농도가 증가될수록 여드름균 생육 억제 활성이 증가됨을 확인 할 수 있었다.
- 3%의 뽕잎 농도에 동충하초 균사체 배양일수별 단백질 패턴을 확인한 결과 그림 3과 같이 날짜가 증가 될수록 단백질 발현량이 증가됨을 확인할 수 있었다. 또한 배양 15일 이후에 뚜렷한 단백질 발현을 확인 하였으며, 배양 25일과 30일의 단백질 발현 차이는 거의 없음을 확인하였다.
- 3%의 뽕잎 농도에 동충하초 균사체를 날짜별 배양시 배양액의 여드름균 생육 억제 활성을 측정한 결과 그림 2에서와 같이 배양 10일 이후 배양일수가 증가 될수록 활성의 크기가 증가됨을 확인 할 수 있었다. 그러나 배양 25일 이후에는 활성의 증가가 나타나지 않으며, 가장 높은 여드름균 생육 억제 활성을 나타내는 적절한 배양 일수는 25일 임을 확인 할 수 있었다.
- 각각의 농도의 뽕잎 추출물에 동충하초 균사체 배양 후 그 배양액을 이용한 P. acnes 생육 억제 활성을 측정한 결과 1% 농도에서는 직경 1 cm, 3% 농도에서는 직경 1.8 cm, 5% 농도에서는 직경 1.6 cm, 7% 농도에서는 직경 1Cm의 생육 억제 활성 환을 관찰 할 수 있었다 (그림. 1). 하지만 동충하초 균사체를 배양하지 않은 control의 경우 아무 활성도 관찰되지 않았다.
- 각기 다른 종류의 배지를 이용한 동충하초 균사체 배양액의 여드름균 생육 억제 활성을 확인 한 결과 그림 4와 같이 뽕잎이 첨가되지 않은 5% 감자 배지의 경우 여드름균 생육 억제 활성을 확인 할 수 없었으며, 합성 배지인 PDB에 배양결과 직경 1.8 Cm 정도의 여드름균 생육 억제 활성이 나타났으나 3% 뽕잎이 첨가된 배지에서는 직경 2.4 Cm로 가장 큰 여드름균 생육 억제 활성을 확인 할 수 있었다. 이 결과로 볼 때 동충하초 균사체가 기질인 5% 감자 배지에 배양시 여드름균 생육 억제 활성은 나타나지 않았으며, 합성 배지인 PD broth에서 여드름균 생육 억제 활성을 나타나지만, 3% 뽕잎 추출물이 첨가된 천연 배지의 배양액이 여드름균 생육 억제 활성이 가장 높음을 확인 할 수 있었다.
- 3%의 뽕잎 농도에 동충하초 균사체를 날짜별 배양시 배양액의 여드름균 생육 억제 활성을 측정한 결과 그림 2에서와 같이 배양 10일 이후 배양일수가 증가 될수록 활성의 크기가 증가됨을 확인 할 수 있었다. 그러나 배양 25일 이후에는 활성의 증가가 나타나지 않으며, 가장 높은 여드름균 생육 억제 활성을 나타내는 적절한 배양 일수는 25일 임을 확인 할 수 있었다. 또한 10일 이후에 활성이 나타나는 것을 볼 때, 뽕잎추출물에 동충하초 균사체 배양액의 여드름균 생육 억제 물질은 동충하초 균사체의 1차 대사산물이 아닌 2차 대사산물인 것으로 판단되다.
- 따라서, 뽕잎 추출물을 이용한 동충하초 균사체 배양액은 여드름균 생육 억제 활성이 뛰어나며, 열에 안정한 천연 여드름 억제 화장품료 조성물로서의 이용가능성이 확인 하였다.
- 그러나 배양 25일 이후에는 활성의 증가가 나타나지 않으며, 가장 높은 여드름균 생육 억제 활성을 나타내는 적절한 배양 일수는 25일 임을 확인 할 수 있었다. 또한 10일 이후에 활성이 나타나는 것을 볼 때, 뽕잎추출물에 동충하초 균사체 배양액의 여드름균 생육 억제 물질은 동충하초 균사체의 1차 대사산물이 아닌 2차 대사산물인 것으로 판단되다.
- 3%의 뽕잎 농도에 동충하초 균사체 배양일수별 단백질 패턴을 확인한 결과 그림 3과 같이 날짜가 증가 될수록 단백질 발현량이 증가됨을 확인할 수 있었다. 또한 배양 15일 이후에 뚜렷한 단백질 발현을 확인 하였으며, 배양 25일과 30일의 단백질 발현 차이는 거의 없음을 확인하였다. 이결과로 볼 때 배양 15일 이후에 동충하초 균사체 배양으로 단백질이 발현되었으며, 이로 인하여 여드름균 생육 억제 활성이 나오는 것으로 사료된다.
- 그리고 5% 감자만을 넣고 배양하였을 경우 여드름 균의 활성이 나타나지 않았으며, 합성 배지인 PDB를 사용 시 뽕잎 추출물을 이용해 배양하였을 때보다 낮은 활성을 나타내었다. 또한 뽕잎 추출물에 동충하초 균사체 배양액의 여드름균 생육 억제 활성의 열 안정성을 확인하기 위한 열처리 결과, 100℃에서 45분 까지 열에 안정함을 확인 할 수 있었다. 이러한 결과로 볼 때 뽕잎 추출물에 동충하초 배양액의 여드름균 생육 억제 물질은 배당체 또는 peptide 인 것으로 판단된다.
- 배양 배지내의 뽕잎 추출물 농도는 3%일 때 가장 높은 여드름 균 생육 억제 활성이 나타났으며, 3% 농도의 뽕잎 추출물을 이용한 균사체 배양 날짜별 활성은 25일 배양시 가장 높은 여드름 균 생육 억제 활성을 확인 할 수 있었다. 또한 여드름 균에 생육 억제 활성을 가지는 물질은 동충하초 균사체의 2차 대사산물로 판단 할 수 있었다. 뽕잎 추출물에 동충하초 균사체 배양액의 처리농도별 여드름 활성은 처리 농도가 상승할수록 증가하였다.
- 본연구는뽕잎추출물에눈꽃동충하초균사체(Paecilomyces japonica) 배양액의 Propionibacterium acnes에 대한 생육 억제 활성을 조사한 것이다. 배양 배지내의 뽕잎 추출물 농도는 3%일 때 가장 높은 여드름 균 생육 억제 활성이 나타났으며, 3% 농도의 뽕잎 추출물을 이용한 균사체 배양 날짜별 활성은 25일 배양시 가장 높은 여드름 균 생육 억제 활성을 확인 할 수 있었다. 또한 여드름 균에 생육 억제 활성을 가지는 물질은 동충하초 균사체의 2차 대사산물로 판단 할 수 있었다.
- 뽕잎 추출물에 동충하초 균사체 배양액의 열에 의한 안정성을 조사한 결과 그림 6과 같이 100℃에서 각 시간대 별로 처리 하였을 때 열을 처리하지 않은 control 에 비하여 처리 시간이 증가 될수록 여드름균 생육 억제 활성은 감소되긴 하지만, 여드름균 생육 억제 활성이 100℃의 열에도 45 분까지 그 활성을 유지하는 것을 관찰할 수 있었다. 이 결과로 볼 때 여드름균 생육 억제 물질이 상당히 열에 안정한 것으로 판단되며 이것을 이용한 화장품 제조 시 가해지는 열에도 활성이 실활되지 않을 것으로 사료 된다.
- 또한 여드름 균에 생육 억제 활성을 가지는 물질은 동충하초 균사체의 2차 대사산물로 판단 할 수 있었다. 뽕잎 추출물에 동충하초 균사체 배양액의 처리농도별 여드름 활성은 처리 농도가 상승할수록 증가하였다. 그리고 5% 감자만을 넣고 배양하였을 경우 여드름 균의 활성이 나타나지 않았으며, 합성 배지인 PDB를 사용 시 뽕잎 추출물을 이용해 배양하였을 때보다 낮은 활성을 나타내었다.
- 4 Cm로 가장 큰 여드름균 생육 억제 활성을 확인 할 수 있었다. 이 결과로 볼 때 동충하초 균사체가 기질인 5% 감자 배지에 배양시 여드름균 생육 억제 활성은 나타나지 않았으며, 합성 배지인 PD broth에서 여드름균 생육 억제 활성을 나타나지만, 3% 뽕잎 추출물이 첨가된 천연 배지의 배양액이 여드름균 생육 억제 활성이 가장 높음을 확인 할 수 있었다. 이는 동충하초 균사체가 뽕잎의 여러 가지 물질을 이용하여 여드름균 항균 물질을 생성하는 것으로 판단되며 이를 이용한 천연 여드름균 생육 억제 화장품 제재로서 이용가능성을 확인할 수 있었다.
- 뽕잎 추출물에 동충하초 균사체 배양액의 열에 의한 안정성을 조사한 결과 그림 6과 같이 100℃에서 각 시간대 별로 처리 하였을 때 열을 처리하지 않은 control 에 비하여 처리 시간이 증가 될수록 여드름균 생육 억제 활성은 감소되긴 하지만, 여드름균 생육 억제 활성이 100℃의 열에도 45 분까지 그 활성을 유지하는 것을 관찰할 수 있었다. 이 결과로 볼 때 여드름균 생육 억제 물질이 상당히 열에 안정한 것으로 판단되며 이것을 이용한 화장품 제조 시 가해지는 열에도 활성이 실활되지 않을 것으로 사료 된다.
- 또한 배양 15일 이후에 뚜렷한 단백질 발현을 확인 하였으며, 배양 25일과 30일의 단백질 발현 차이는 거의 없음을 확인하였다. 이결과로 볼 때 배양 15일 이후에 동충하초 균사체 배양으로 단백질이 발현되었으며, 이로 인하여 여드름균 생육 억제 활성이 나오는 것으로 사료된다. 또한 배양 25일과 30일의 단백질 생성 차가 별로 없는 것으로 보아 최적 배양일수는 25일인 것을 다시 한 번 확인 할 수 있었다.
- 이 결과로 볼 때 동충하초 균사체가 기질인 5% 감자 배지에 배양시 여드름균 생육 억제 활성은 나타나지 않았으며, 합성 배지인 PD broth에서 여드름균 생육 억제 활성을 나타나지만, 3% 뽕잎 추출물이 첨가된 천연 배지의 배양액이 여드름균 생육 억제 활성이 가장 높음을 확인 할 수 있었다. 이는 동충하초 균사체가 뽕잎의 여러 가지 물질을 이용하여 여드름균 항균 물질을 생성하는 것으로 판단되며 이를 이용한 천연 여드름균 생육 억제 화장품 제재로서 이용가능성을 확인할 수 있었다. 또한 뽕잎을 이용한 동충하초 균사체 배양액의 미백 활성 (Park et al.
- 또한 뽕잎 추출물에 동충하초 균사체 배양액의 여드름균 생육 억제 활성의 열 안정성을 확인하기 위한 열처리 결과, 100℃에서 45분 까지 열에 안정함을 확인 할 수 있었다. 이러한 결과로 볼 때 뽕잎 추출물에 동충하초 배양액의 여드름균 생육 억제 물질은 배당체 또는 peptide 인 것으로 판단된다.
- 하지만 동충하초 균사체를 배양하지 않은 control의 경우 아무 활성도 관찰되지 않았다. 이의 결과로 볼 때 뽕잎의 농도가 3%일 때 가장 높은 활성을 나타냈으며 그 이상의 농도에서는 활성의 크기가 낮아지는 것을 확인 하였으며, 이는 뽕잎 3%의 농도가 동충하초 균사체의 여드름 생육 억제 활성 물질의 분비가 가장 높은 농도이며, 이후 농도에서는 동충하초의 생육이 뽕잎 추출물의 높은 농도에 의하여 저해되어서 활성물질의 분비가 감소된 것으로 판단된다.
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