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문제 정의
- 따라서 본 연구의 목적은 마우스에서 CCh로 유도된 간독성에 대해, 광범위하게 2가 금속이온과 칼슘이온을 chelation하는 EDTA와 세포 외 칼슘과 chelation하는 것으로 알려져 있는 EGTA의 보호효과를 확인하고, 비교함에 있다.
제안 방법
- 1개의 정싱대조군(Normal control, 0.02 ml/10g, ip)과 5개의 실험군으로 구성되었고, 각 군 당 mouse 암컷 3마리와 수컷 3마리씩 총 6마리로 하였다. 실험군은 CCL (Sigma Chemical, USA)를 olive oil과 1 : l(v/v) 동량 비율로 완전혼합시켜 급성 간 독성을 유발시킬 목적으로 배등[1] 의 방법에 준해 복강투여(2ml/kg, i.
- c.)로 전 처리한 다음 1시간 후 CCLt 투여군, 그리고 5) 고농도 EDTA (100㎎/㎏, s.c.)로 전 처리한 다음 1시간 후 CCL투여군으로 각각 설정하였다.
- Homogenizer는 T10 basic 기종 (IKA Ultra-Turrax, Germany)을, Spectrophotometer는 Spectra Max plus 기종 (Molecular Devices, USA)을 사용하였다.
- 혈청중의 ALP(alkaline phosphatase), AST(aspartate transaminase), ALT(alanine aminotransferase), TG(triglyceride), cholesterol 활성은 영동제약의 생화학적 진단용kit를 사용하여 측정하였는데, ALP, AST, ALT는 Kinetic 방법으로 흡광도를 측정하였고, TQ cholesterole Endpoint 방법으로 흡광도를 측 측정하였다. 각각 측정한 흡광도는 검사한 항목별로 제공된 결과값환산식에 의해 변환하였다.
- 간 조직의 광학현미경적 변화 관찰을 위해 적출 즉시 간의 일부분을 (각 군 간 동 일 부위 적출) 10% 중성 포르말린 액에 고정한 다음 수세하고 alcohol의 농도 증가에 따라 탈수하고 paraffin에 포매하였다. 포매된 조직은 3 |im 두께로 절편한 (RM2145; Leica, Germany) 다음 hematoxylin-eosin 염색을 실시하여 광학현미경(BX51; Olympus, Japan)으로 관찰 비교하였다.
- 간, 비장, 신장을 적출하여 냉각된 생리식염수로 즉시 씻어서 혈액을 제거하고, 거즈로 물기를 제거시킨 후, 각각 중량을 측정하고, 체중 10 g당 상대 중량으로 산출하였다. 특히 적출시킨 간 조직의 동일 부위 일부분을 채취하여 10배의 냉각된 1.
- 포매된 조직은 3 |im 두께로 절편한 (RM2145; Leica, Germany) 다음 hematoxylin-eosin 염색을 실시하여 광학현미경(BX51; Olympus, Japan)으로 관찰 비교하였다. 그리고 간의 전반적인 병변 정도에 따라 severe(-H-+), moderate(++), mild(+), normal(-)로 임의적 인 간 손상 평가를 실시하였다.
- 국내의 오리엔트바이오(한국) 회사로부터 5주령의 ICR mouse를 암컷 18마리와 수컷 18마리를 구입하여 실험실 환경(온도 23±2℃, 습도 55 ±5%)에서 일주일간 적응시킨 다음 실험에 사용하였다. 사료는 실험동물 전용 고형 사료로, 음수와 식이는 절식 전까지 자유섭식토 록 하였으며 다만 CCL, 투여 후 마우스를 살처분하기 전까지 18시간 동안은 사료급여를 중지하였으며 음수는 자유로이 공급하였다. 동물은 AAALAC(Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care) 기준에 따라 관리하였다.
- 02 ml/10g, ip)과 5개의 실험군으로 구성되었고, 각 군 당 mouse 암컷 3마리와 수컷 3마리씩 총 6마리로 하였다. 실험군은 CCL (Sigma Chemical, USA)를 olive oil과 1 : l(v/v) 동량 비율로 완전혼합시켜 급성 간 독성을 유발시킬 목적으로 배등[1] 의 방법에 준해 복강투여(2ml/kg, i.p.)를 실시하였다.
- 간 조직의 광학현미경적 변화 관찰을 위해 적출 즉시 간의 일부분을 (각 군 간 동 일 부위 적출) 10% 중성 포르말린 액에 고정한 다음 수세하고 alcohol의 농도 증가에 따라 탈수하고 paraffin에 포매하였다. 포매된 조직은 3 |im 두께로 절편한 (RM2145; Leica, Germany) 다음 hematoxylin-eosin 염색을 실시하여 광학현미경(BX51; Olympus, Japan)으로 관찰 비교하였다. 그리고 간의 전반적인 병변 정도에 따라 severe(-H-+), moderate(++), mild(+), normal(-)로 임의적 인 간 손상 평가를 실시하였다.
- 혈청중의 ALP(alkaline phosphatase), AST(aspartate transaminase), ALT(alanine aminotransferase), TG(triglyceride), cholesterol 활성은 영동제약의 생화학적 진단용kit를 사용하여 측정하였는데, ALP, AST, ALT는 Kinetic 방법으로 흡광도를 측정하였고, TQ cholesterole Endpoint 방법으로 흡광도를 측 측정하였다. 각각 측정한 흡광도는 검사한 항목별로 제공된 결과값환산식에 의해 변환하였다.
대상 데이터
- 그리고 olive oile 국내 CJ제품을 구입하였다. ALP, AST, ALT, TG cholesterol kit는 영동제약의 제품을 사용하였다.
- 국내의 오리엔트바이오(한국) 회사로부터 5주령의 ICR mouse를 암컷 18마리와 수컷 18마리를 구입하여 실험실 환경(온도 23±2℃, 습도 55 ±5%)에서 일주일간 적응시킨 다음 실험에 사용하였다. 사료는 실험동물 전용 고형 사료로, 음수와 식이는 절식 전까지 자유섭식토 록 하였으며 다만 CCL, 투여 후 마우스를 살처분하기 전까지 18시간 동안은 사료급여를 중지하였으며 음수는 자유로이 공급하였다.
- 그리고 olive oile 국내 CJ제품을 구입하였다. ALP, AST, ALT, TG cholesterol kit는 영동제약의 제품을 사용하였다.
- 시약 ethylenediaminetetraacetic acid(EDTA), carbon tetrachloride(CCL), ethylene glycol-bis(B-aminoethyl ether)- N, N, N, 'N' -tetraacetic acid(EGTA), thiobarbituric acid(TBA), sodium dodecyl sulfate, 1, 1, 3, 3-tetraethoxy-propanee 미국의 Sigma Chemical 회사로부터 구입하였고, acetic acid 는 일본의 소화화학 주식회사로부터, KC1 은 일본의 Yakuri pure chemicals 회사로부터 구입하였다.
데이터처리
- 모든 실험 결과는 window용 SAS 9 program을 사용하여 실험군 당 평균 土 표준오차로 표시하였고, 각 군 간의 평균치의 통계적 유의성은 Duncan's multiple range test 에.의 해 검정하였다.
이론/모형
- 사료는 실험동물 전용 고형 사료로, 음수와 식이는 절식 전까지 자유섭식토 록 하였으며 다만 CCL, 투여 후 마우스를 살처분하기 전까지 18시간 동안은 사료급여를 중지하였으며 음수는 자유로이 공급하였다. 동물은 AAALAC(Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care) 기준에 따라 관리하였다.
- 사염화탄소 투여에 의해 생성된 지질과 산화물은 Ohkawa [16]의 방법으로 정량하였다. 즉 시험관에 간 homogenate을 200 ul씩 넣고, 8.
성능/효과
- 대조군. (212±10)과 비교하여 EGTA 고농도군을 제외한 EGTA 저농도군, EDTA 저농도군과 고농도군이 각각 132±29, 131 ±16, 129 ± 6으로 유의성 있는 감소 효과를 나타내었다(Table 2).
- AST의 경우 정상 대조군(119±45)보다 CC14 단독 투 여군(392±18)이 3배 이상 높게 나타났고, EGIA 저농도군과 고농도군, EDTA 저농도군과 고농도군에서 각각 241 ± 1, 192 ±76, 214±24, 91 ±40으로 유의성 있는 농도의존적 감소 효과를 보였으며, 각각의 농도에서 EDTA 투여군이 EGTA 투여군보다 우수한 간 보호 효과를 나타냄을 알 수 있었다(Table 2).
- [8], 그리고 세포 외칼슘을 chelation하는 것으로 알려져 있는 EGTA는 ccl를 배양 간 세포에 처리 시 나타나는 간세포질 내 칼슘 증가 및 형질막의 수포화를 억제하는 것으로 보고되어 있다. [3], 본 실험 결과에서도 EGTA 투여시 CCU-rr 발 간손상 억제 효과를 관찰할 수 있었는데, 저농도 으〕 EGTA 투여군과 고농도 ECFIA 투여군간에 간손상을 나타내는 혈액화학적 지표와 간 조직학적 소견으로 볼 때 전반적으로 비슷한 양상을 보여주었다. 이는 세포의 생존 및 세포사에 관여하는 것으로 잘 알려진 생체 내 칼슘의 항상성과 관련하여 적절한 칼슘의 유지가 간 세포 의 손상 정도를 결정짓는데 연관이 있음을 시사한다.
- 心의 경우 정상 대조군(41 ± 19)보다 CC14 단독 투여군(175 ±38)에서 약 4배 정도 증가를 보였으며, EGTA 저농도군과 고농도군에서는 각각 63 ± 13, 71 + 34로 CCL, 단독 투여군과 비교해 유의한 감소를 보였고, EDTA 저농도군과 고농도군에서는 각각 46 ±2, 37 ± 11로 투여용량에 따른 ALT 억제 효과를 나타냈으며 EGTA 투여군보다 EDTA 투여군이 더 우수한 간 보호 효과를 보여주었다(Table 2).
- 간 조직에서 CC14 투여로 인한 지질과 산화 정도를 측정하기 위한 척도로서 MDA의 경우 정상 대조군(57.4±8.8)에 비해 CCU 단독 투여(86.2± 8.6> 시 간 조직에서 유의한 증가가 관찰되었으며 EGIA 및 EDTA 투여 시 각 군의 투여농도에 따라 25%-38%의 억제 정도를 나타내었으며 EGTA 저농도군, EDTA 저농도군과 고농도군에서 유의한 감소를 나타내었다(Table 3).
- 마우스에서 CCL»로 유발된 간독성에 대해서 혈청생 화학적 검사(ALP, ALT, AST, cholesterol, TG)와 지질과 산화물인 MDA 변화 조사, 간세포의 조직학적 변화 관찰 을 토대로 종합해 볼 때, 칼슘킬레이터인 EGTA 및 칼슘과 2가 금속이온을 동시에 킬레이션하는 EDTA 모두에서 유의한 간 보호 효과가 있음을 확인하였으며 특히 두 chelators 가운데에서 EDTA 투여시 용량의존적인 억제 효과를 잘 보여주었다. 그리고 칼슘 chelator인 EGTA보다는 광범위한 divalent ion chelator인 EDTA가 간세포 손상에 주로 관여하는 Fenton 반응과 관련이 있는 Fe2+과 간세포사에 직접적인 연관이 있는 것으로 알려져 있는 Ca2+을 동시에 둘 다 chelation함으로써 더 우수한 간 보호 효과가 있음을 시사한다.
- 마우스에서 CCL»로 유발된 간독성에 대해서 혈청생 화학적 검사(ALP, ALT, AST, cholesterol, TG)와 지질과 산화물인 MDA 변화 조사, 간세포의 조직학적 변화 관찰 을 토대로 종합해 볼 때, 칼슘킬레이터인 EGTA 및 칼슘과 2가 금속이온을 동시에 킬레이션하는 EDTA 모두에서 유의한 간 보호 효과가 있음을 확인하였으며 특히 두 chelators 가운데에서 EDTA 투여시 용량의존적인 억제 효과를 잘 보여주었다. 그리고 칼슘 chelator인 EGTA보다는 광범위한 divalent ion chelator인 EDTA가 간세포 손상에 주로 관여하는 Fenton 반응과 관련이 있는 Fe2+과 간세포사에 직접적인 연관이 있는 것으로 알려져 있는 Ca2+을 동시에 둘 다 chelation함으로써 더 우수한 간 보호 효과가 있음을 시사한다.
- 실험 개시부터 희생 전까지의 체중 변화는 CCU 투여 후 살처분까지 18시간 절식으로 인해 모든 군에서 체중 감소를 보였으며, 정상 대조군이 -4.6 g으로 가장 심한 체중 감소를 나타냈고, CCLt대조군과 저농도 EDTA 투여군이 -3.2 g으로 가장 낮은 감소를 나타내었다. 하지만 각 군별간 유의한 차이는 없었다(Table 1).
- 특히 EDTA 고농도 투여군이 각각의 EDTA 및 EGTA를 포함한 모든 투여군들 가운데서 가장 탁월한 간 보호 효과를 나타내었으며 이는 간세포의 조직학적인 실험 결과와도 잘 일치함을 보여주었다. 이는 CCZ 투여로 야기된 간세포 손상에 주로 관여하는 것으로 잘 알려진 철분과 유리칼슘 증가에 대한 동시억제 효과를 나타내는 EDTA 투여군이 가장 뚜렷이 개선되었음을 시사하며 농도의존적인 형태 또한 잘 보여준 것으로 여겨진다. 그러나 본 실험에 사용한 EGTA 및 EDTA 모두 이러한 금속이온과 칼슘이온이 관여하는 간세포 손상과정에서 상호 어떠한 형태로 간세포 보호에 기여하였는지에 대한 자세한 기전 연구는 향후 여러 다양한 금속 chelators들과 항산화 효소들 간의 상호 비교 연구를 통해 규명되어야 할 것으로 사료된다.
- 특히 독성을 일으키는 중금속의 종류에 따라 적절한 chelation 치료방법의 선택이 회복시기를 결정하는 매우 중요한 요소로 인식되고 있다. 일반적인 chelator로 사용되는 EDTA가 산화적 손상반응에 관여하는 과산소라디칼(superoxide radical) 관련 독성을 억제하는 과산 소디스뮤타아제 및 Fenton 반응에 관여하는 것으로 알려진 hydroxyl radical을 산생하는 생체내 과산화수소(hydrogen peroxide) 관련 독성을 방어하는 카탈라제와 유사한 작용을 보인다는 사실은 본 연구 결과에서 나타난 EDTA의 지질과 산화 억제 효 과와도 상호 연관이 있음을 시사한다. [8], 그리고 세포 외칼슘을 chelation하는 것으로 알려져 있는 EGTA는 ccl를 배양 간 세포에 처리 시 나타나는 간세포질 내 칼슘 증가 및 형질막의 수포화를 억제하는 것으로 보고되어 있다.
- 하지만 각 군별간 유의한 차이는 없었다(Table 1).적출한 각각의 장기를 마우스 체중 10 g당 상대 중량으로 환산하였을 시, 간의 상대 중량은 정상 대조군에서 평균 0.52 g 을 나타냈고 2군(CCI4 대조군)에서 6군(고농도 EDTA 투여군)까지 각각 0.58, 0.60, 0.58, 0.58, 0.54 g을 나타냄으로써 6군을 제외하고 정상 대조군과 비교하여 간 상 대중량의 유의성 있는 증가를 나타내었다. 비장과 신장 중량에서는 유의한 변화가 관찰되지 않았다(Table 1).
- 한편 다른 연구자들은 CC14 투여로 인한 간 손상 지표물질인 AST, ALT, MDA의 증가 및 항산화 효소인 GSH, catalase 감소가 철분 킬레이터인 desferrioxamine 투여로 회복됨을 보여주었다 [13], 본 연구결과에서도 CCh 투여로 간 손상의 혈액화학적 지표물질인 ALP, ALT 및 AST를 비롯하여 간 세포의 Fenton 반응으로 인한 지질 과산화척도인 MIRE] 대한 증가가 칼슘킬레이터인 EGTA 와 칼슘 및 금속이 온들을 동시에 chleation하는 작용을 가진 EDTA를 투여하였을 시 모두 현저히 감소하였으나 지질 성분인 cholesterol 및 TG의 경우에서는 EGTA 혹은 EDTA 투여시 대체로 감소 경향만을 나타내었다. 특히 EDTA 고농도 투여군이 각각의 EDTA 및 EGTA를 포함한 모든 투여군들 가운데서 가장 탁월한 간 보호 효과를 나타내었으며 이는 간세포의 조직학적인 실험 결과와도 잘 일치함을 보여주었다. 이는 CCZ 투여로 야기된 간세포 손상에 주로 관여하는 것으로 잘 알려진 철분과 유리칼슘 증가에 대한 동시억제 효과를 나타내는 EDTA 투여군이 가장 뚜렷이 개선되었음을 시사하며 농도의존적인 형태 또한 잘 보여준 것으로 여겨진다.
- 또한 CC14 투여시의 전형적인 공포변성(ballooning degeneration) 소견도 곳곳에서 관찰되었다. 한편 EGTA 투여군(Fig. 1C &D) 및 EDTA 투여군(Fig. IE & F)의 경우 저농도군과 고농도군 모두 ccl 대 조군에 비해서 뚜렷한 조직학적인 개선효과를 보였으며, EGTA 경우 저농도군과 고농 도군간에 대체로 비슷한 양상을 보였으나 EDTA 투여군 경우는 저농도군에 비해서 고농도군이 훨씬 더 정상 대조군에 가까운 양상을 나타냄으로써 용량의존적인 효과와 혈액생화학적인 소견과도 잘 일치함을 보여주었다.
후속연구
- 이는 CCZ 투여로 야기된 간세포 손상에 주로 관여하는 것으로 잘 알려진 철분과 유리칼슘 증가에 대한 동시억제 효과를 나타내는 EDTA 투여군이 가장 뚜렷이 개선되었음을 시사하며 농도의존적인 형태 또한 잘 보여준 것으로 여겨진다. 그러나 본 실험에 사용한 EGTA 및 EDTA 모두 이러한 금속이온과 칼슘이온이 관여하는 간세포 손상과정에서 상호 어떠한 형태로 간세포 보호에 기여하였는지에 대한 자세한 기전 연구는 향후 여러 다양한 금속 chelators들과 항산화 효소들 간의 상호 비교 연구를 통해 규명되어야 할 것으로 사료된다.
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