본 연구에서는 trametes versicolor에서 분비하는 laccase를 분리 정제하고, 그 효소특성을 조사하였다. 공시균의 배지로는 PDB배지를 사용하였으며, 이 효소를 유도하기 위하여 공시균 접종 5일 후 inducer로 2,5-xylidine (0.2 mM)을 첨가하였다. Inducer 첨가 2일 후 laccase를 수확하여 Glass filter (GF/C)를 이용하여 균사체를 제거한 후 laccase 여과액의 정제시간을 단축시키고, 쉽게 단백질을 농축시키기 위하여 ultramicrofilter (Viva flow 50, GE Healthcare Bioscience, USA)를 사용하여 농축하였다. 이렇게 농축된 laccase 여과액은 Hitrap Q FF column으로 부분 정제하여 활성이 검출된 peak를 확인할 수 있었다. 효소의 특성을 조사한 결과 효소의 활성이 가장 높은 pH는 5.0이었으며 최적 온도는 $60^{\circ}C$였고, specific activity는 syringaldazine을 substrate로 사용하여 확인한 결과 crude한 상태에서는 약 32 U/mg였고, 농축한 후에는 약 409 U/mg였으며 Hitrap Q FF column으로 분리한 후에는 약 1.243 U/mg였다. 그리고 SDS-PAGE gel 사진으로 확인한 결과 단백질의 크기는 약 53 kDa이었다.
본 연구에서는 trametes versicolor에서 분비하는 laccase를 분리 정제하고, 그 효소특성을 조사하였다. 공시균의 배지로는 PDB배지를 사용하였으며, 이 효소를 유도하기 위하여 공시균 접종 5일 후 inducer로 2,5-xylidine (0.2 mM)을 첨가하였다. Inducer 첨가 2일 후 laccase를 수확하여 Glass filter (GF/C)를 이용하여 균사체를 제거한 후 laccase 여과액의 정제시간을 단축시키고, 쉽게 단백질을 농축시키기 위하여 ultramicrofilter (Viva flow 50, GE Healthcare Bioscience, USA)를 사용하여 농축하였다. 이렇게 농축된 laccase 여과액은 Hitrap Q FF column으로 부분 정제하여 활성이 검출된 peak를 확인할 수 있었다. 효소의 특성을 조사한 결과 효소의 활성이 가장 높은 pH는 5.0이었으며 최적 온도는 $60^{\circ}C$였고, specific activity는 syringaldazine을 substrate로 사용하여 확인한 결과 crude한 상태에서는 약 32 U/mg였고, 농축한 후에는 약 409 U/mg였으며 Hitrap Q FF column으로 분리한 후에는 약 1.243 U/mg였다. 그리고 SDS-PAGE gel 사진으로 확인한 결과 단백질의 크기는 약 53 kDa이었다.
The study was performed to purify and characterize laccase in culture of Trametes versicolor. The fungus was grown in liquid culture media of PDB and added 2,5-xylidine (0.2 mM) after 5 days to enhance the production of laccase. The fungal culture was incubated at $25^{\circ}C$ on a rotar...
The study was performed to purify and characterize laccase in culture of Trametes versicolor. The fungus was grown in liquid culture media of PDB and added 2,5-xylidine (0.2 mM) after 5 days to enhance the production of laccase. The fungal culture was incubated at $25^{\circ}C$ on a rotary shaker (120 rpm) for 7days, and the culture broth was clarified through Glass filter (GF/C). The aqueous solution was concentrated by ultramicrofiltration (Viva flow 50, GE Healthcare Bioscience, USA) and loaded onto a Hitrap Q FF column. Laccase activity could be detected at one peak, and this enzyme has a molecular mass of approximately 53kDa as determined by SDS-PAGE The optimum pH and temperature for syringaldazine were 5.0 and $60^{\circ}C$, respectively. The specific activity of crude, concentrated and purified laccase were 32, 409, and 1,243 U/mg, respectively.
The study was performed to purify and characterize laccase in culture of Trametes versicolor. The fungus was grown in liquid culture media of PDB and added 2,5-xylidine (0.2 mM) after 5 days to enhance the production of laccase. The fungal culture was incubated at $25^{\circ}C$ on a rotary shaker (120 rpm) for 7days, and the culture broth was clarified through Glass filter (GF/C). The aqueous solution was concentrated by ultramicrofiltration (Viva flow 50, GE Healthcare Bioscience, USA) and loaded onto a Hitrap Q FF column. Laccase activity could be detected at one peak, and this enzyme has a molecular mass of approximately 53kDa as determined by SDS-PAGE The optimum pH and temperature for syringaldazine were 5.0 and $60^{\circ}C$, respectively. The specific activity of crude, concentrated and purified laccase were 32, 409, and 1,243 U/mg, respectively.
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문제 정의
이에 본 연구에서는 활성이 높은 여러 종류의 laccase 동위효소(isozyme)를 생산하는 것으로 알려진 Trametes versico/or로부터 한 종류의 laccase를 생산, 분리, 정제하여 그 효소 득성을 조사하였다.
제안 방법
T. versicoloi를 배양할 때 inducer로 2, 5-xylidine (0.2 M)을 첨가하여 laccase의 발현을 다량으로 유도하였다(Kolknann et al., 2005).
본 연구에서 이용된 공시균의 배지로는 PDB배지를 사용하였으며, 이 효소를 유도하기 위하여 공시균 접종 5일 후 laccase의 활성도를 증가시키기 위하여 2, 5-xylidine (0.2 mM)을 첨가하여 2일간 더 배양하였다. 그 결과 inducer를 첨가한 날부터 laccase 가 유도되는 것을 확인할 수 있었다(Fig.
75 mm의 slab gel-fi- 만들었으며 시료 완충 용액 20 ul에 효소 시료 10 ul씩을 녹여 2분간 100℃에서 중탕하였다. 이 시료를 slab gel에 가하여 120 V 직류전기로 전기영동 후 Coomassie Brilliant Blue-R250 (0.1%) 용액으로 염 색하여 단백 질을 검증하였다. 또한 표준은 SDS low molecular weight marker (Sigma)를 사용하여 분자량을 측정하였다.
4. Laccase 활성 측정
정제된 laccase의 활성을 측정하기 위하여 0.5 mM syringaldazine (in methanol)을 25℃의 항온수조에 넣고 10분간 예열한 뒤 100 mM phosphate 완충액(pH 6.0) 1.99 ml와 예열시킨 syringaldazine 10 ul, 조효소액 1 ml를 잘 혼합하여 526 nm에서 흡광도를 측정하였다(Galliano et al., 1991)
정제된 laccase의 효소 특성분석을 하기 위하여 pH와 온도 변화에 따른 효소활성을 측정하였다. Fig.
최적 pH는 조효소액 1 ml, 완충액 1.990 M. substrate 10ul를 혼합 후 10분 방치 한 후 급냉한 다음 흡광도를 즉정하여 조기 속도를 기준으로 최적 pH 를 구하였다 최적 온도는 조효소액과 완충액을 위와 동량 혼합 후 각 온도에서 10분 방치한 후 급냉한다음 초기 속도를 측정하여 조사하였다.
T. versicolor 균사체로부터 laccase를 생산하기 위하여 액체배지인 potato dextrose broth (PDB) 합성배지를 사용하였으며, inducer로써 2, 5-xylidine 을 사용하였다.
본 실험에서는 Canada, Forintek에서 분양받은 Trametes. versicolor 균주를 potato dextrose agar (PDA) 배지에 접종하여 25℃에서 7일 동안 배양한 다음 4℃ 냉장고에 보관 후 사용하였다.
이론/모형
Laemmli (1970) 방법에 따라 Polyacrylamide gel 전기 영동과 같은 조건에서 2% SDS를 포함하고 있는 12%의 Acrylamide stacking gel로 0.75 mm의 slab gel-fi- 만들었으며 시료 완충 용액 20 ul에 효소 시료 10 ul씩을 녹여 2분간 100℃에서 중탕하였다. 이 시료를 slab gel에 가하여 120 V 직류전기로 전기영동 후 Coomassie Brilliant Blue-R250 (0.
단백질 함량은 Bradford법 (Bradford, 1976)을 이용하여 595 nm에서의 흡광도를 측정하여 정 량 분석하였으며 BSA를 표준단백질로 사용하였다.
1%) 용액으로 염 색하여 단백 질을 검증하였다. 또한 표준은 SDS low molecular weight marker (Sigma)를 사용하여 분자량을 측정하였다.
성능/효과
2 mM)을 첨가하여 2일간 더 배양하였다. 그 결과 inducer를 첨가한 날부터 laccase 가 유도되는 것을 확인할 수 있었다(Fig. 1).
농죽된 배양액의 laccase를 iorrexchange column (Hitrap Q FF)으로 정제하여 peak를 확인할 수 있었으며 SDS-PAGE에 의하여 단백질 band를 확인하여 본 결과 분자량이 약 50 kDa 정도 됨을 확인할 수 있었다. 이렇게 정제된 laccase의 특성을 조사하여 본 결과 최적 pH는 5.
농축된 균체외 효소를 이온교환 크로마토그라피로 부분 정제하여 효소활성을 확인하여 본 결과 분획 4 이후부터 protein 양은 지속적으로 빠져 나왔으나 분획 4와 5에서만 laccase의 활성을 확인할 수 있었다(Fig. 3).
다량으로 발현된 laccase는 extracellular enzyme 이기 때문에 배양액의 농축이 필요하므로 본 연구에서는 ultrafilter (Viva flow 50, cutoff; 30, 000)를 사용하여 12시간 농축하였을 때 약 13배 정도를 농축할 수 있었다.
V 등으로 분리되어지기도한다. 대부분의 T. rersico/oz에서 유래한 laccase 효소들은 최적 pH가 3~4의 범위에 속하였으나 본 실험에서 생산된 laccase는 최적 pH가 5.0으로 중성에 가까운 약산성을 나타내었다(Table 2).
또한 효소의 활성과 온도에 대한 실험을 실시한 결과 60℃에서 가장 높은 활성을 보이다가 이후 급격히 활성이 감소하였다.
본 연구에서 정제된 laccas의 효소적 특성을 비교한 결과 laccase I type으로 사료되며 비교적 고온에 안정성을 지닌 효소로 확인되었다.
이렇게 정제 농축된 laccase의 정제도와 분자량을 알아보기 위하여 SDS-PAGE 선기영동(10% polyacrylamid gel)을실시하여 53 kDa 크기의 분자량을 갖는 단일한 band 를 확인할 수 있었다(Fig. 2).
있었다. 이렇게 정제된 laccase의 특성을 조사하여 본 결과 최적 pH는 5.0이었고. 최적 온도는 60℃ 로 확인되었다.
0이었고. 최적 온도는 60℃ 로 확인되었다.
최적 온도는 60℃에서 높은 효소 활성을 나타내어 열에 안정된 효소의 특성을 보여주었다 (Fig. 5).
참고문헌 (12)
Bradford, M. M 1976. A rapid and sensitive method for the quantification of microgram quantities of protein utilizing the principle of proteindye binding. Anal. Biochim 72: 248-254
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