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문제 정의
- 본 연구에서는 국내에서 분리된 백색부후균 Trametes versicolor을 대상으로 최적 분해조건을 조사하고, 분해활성이 우수한 방법을 조사하여 bisphenol A의 생분해능을 증가시키고자 하였으며, bisphenol A의 생분해에 따른 에스트로겐 활성(estrogenic activity)의 감소를 조사하였다.
제안 방법
- Bisphen이 A (50 mg/L)가 포함된 춘천 하수종말처리장 유입수에 최소배지의 영양분을 첨가하고 T. versicolor^] 균사체와 상등액의 비율을 10, 20, 30, 40, 50% (v/v)로 달리하여 접종한 후 6 일 동안의 분해율을 조사하였다. 폐수는 여과지와 여과막으로 여과하여 다른 미생물에 의한 bisphenol A의 분해를 배제시켰다.
- 53 mmx 5.0 μm); injector, 275°C; oven, 270°C; detector, 280°C. Chromato- gram의 수집과 처리는 Autochro-Win (영린기기, Korea)을 사용하였다.
- T. versicolor^: YMG 배지와 최소배지에 접종한 직후 bisphenol A를 첨가하여 일정 시간 배양한 후, 잔류 bisphenol A 를 추출하여 분해능을 비교하였다. 또한 YMG 배지와 최소배지에서 균주를 일정 시간 선배양한 후 bisphenol A를 첨가하고 배양하여 bisphenol A의 생분해 정도를 비교하였다n Bisphenol A 의 농도(1, 25, 50, 100 mg/L), 온도(25, 30, 35, 40°C), 배지 초기 pH (4, 5, 6, 7, 8), 교반속도(정치, 80, 130, 200 rpm), 접종 물의 선배양 시간(5, 7, 9, 11, 13, 15일)을 달리하고 또한 리그닌 분해효소인 laccase 의 meMiatoi인 ABTS [2, 2-azino-bis(3- ethylbenzothiazoline-6-sulfonicacid) diammonium salt] 200 μM 과 HBT [ 1 -hydroxy-benzotriazole] 200 μM을 첨가하여 T.
- YMG 배지에 T. versicolor의 접종과 동시에 bisphenol A 50 mg/L를 넣어 6시간 간격으로 bisphenol A의 잔존량을 조사하였다. 그 결과 T.
- versicolor를 접종하고 bisphenol A를 첨가하여 일정시간 배양한 뒤 pH를 조사하였을 때 pH 5로 변화되었다. 교반이 생분해에 미치는 영향을 조사하였는데 정치배양과 진탕배양이 큰 차이를 나타내지 않았다. 백색부후균의 생분해는 정치배양에서 효율적이라는 보고도 있으나 진탕배양에서 더 높은 경우도 있기 때문에 균주와 대상물질에 따라 교반이 생분해율에 영향을 미칠 수 있는 것으로 추정된다(7).
- versicolor^: YMG 배지와 최소배지에 접종한 직후 bisphenol A를 첨가하여 일정 시간 배양한 후, 잔류 bisphenol A 를 추출하여 분해능을 비교하였다. 또한 YMG 배지와 최소배지에서 균주를 일정 시간 선배양한 후 bisphenol A를 첨가하고 배양하여 bisphenol A의 생분해 정도를 비교하였다n Bisphenol A 의 농도(1, 25, 50, 100 mg/L), 온도(25, 30, 35, 40°C), 배지 초기 pH (4, 5, 6, 7, 8), 교반속도(정치, 80, 130, 200 rpm), 접종 물의 선배양 시간(5, 7, 9, 11, 13, 15일)을 달리하고 또한 리그닌 분해효소인 laccase 의 meMiatoi인 ABTS [2, 2-azino-bis(3- ethylbenzothiazoline-6-sulfonicacid) diammonium salt] 200 μM 과 HBT [ 1 -hydroxy-benzotriazole] 200 μM을 첨가하여 T. versicolor에 의한 bisphenol A의 분해율을 분석하였다.
- 백색부후균에 의한 bisphenol A의 생분해에 대한 최적 환경 조건을 탐색하기 위해 온도, pH 및 교반 등을 달리하여 생분해율을 조사하였다. Bisphenol A는 농도가 높을수록 그 독성 때문에 생분해율이 감소하였는데 1 mg/L의 경우 6시간 이내에 100% 분해가 일어났으며 100 mg/L의 농도에서도 12시간 후에는 100% 제거되었다(Fig.
- 140xg, 30 min)를 통해 유기용매증만을 분리하였다. 분리된 유기용매에서 기체크로마토그래프(GC)를 이용하여 bisphenol A의 잔존량을 분석하였으며 GC의 운전조건은 다음과 같다. 영린 GC (M600D, 영 린기기, Korea) column, HP-1 (15 mx 0.
- 분해실험에 사용되었던 bisphenol A가 첨가되었던 배양체를 마쇄기로 1분간 마쇄한 후 10 ml의 methylene chloride# 넣고, extraction shaker (Recipro shaker RS-1, JEIO TECH)에서 300 rpm으로 30분간 잔류 bisphenol A를 추출한 후 원심분리(4℃, 6, 140xg, 30 min)를 통해 유기용매증만을 분리하였다. 분리된 유기용매에서 기체크로마토그래프(GC)를 이용하여 bisphenol A의 잔존량을 분석하였으며 GC의 운전조건은 다음과 같다.
- 이상과 같은 생분해 기초자료를 실제 오염 환경에 사용할 수 있는지 확인하기 위해 T. versicolor^ 의한 생분해를 bisphenol A가 포함된 폐수에 직접 적용하여 생분해율을 측정하였다. 이전실험에서처럼 상등액에 대한 균사체의 비율이 10%일 경우에는 분해율이 그다지 높지 않았는데 이는 폐수 내 성분들에 의해 백색부후 균의 생장과 분해효소 분비가 제한되었기 때문인 것으로 추정되었다.
대상 데이터
- 실험에 사용된 균주인 구름버섯 Trametes versicolor 951007-22-5 monokaiyon 균주는 강원대학교 생명과학부 미생물생리학실험실에서 분양받았다. T.
데이터처리
- 모든 실험은 triplicate로 수행하였으며 결과는 그 평균치로 나타내었고 편차는 error bar로 표시하였다.
이론/모형
- T. versicolor^ 의한 bisphenol A 생분해 과정에서 에스트로겐활성의 변화는 Nishikawa 등(1999)에 의해 개발된 yeast two- hybrid assay system을 이용하여 즉정하였다. Bisphenol A가 첨가된 T.
성능/효과
- 1%, 2시간에는 100% 분해하였다. Bisphenol A를 1, 25, 50, 100 mg/L의 농도로 첨가하여 생분해율을 조사하였을 때, 6시간 동안 각각 95.7, 56.6, 4.3, 0%의 분해를 나타내었으며 12시간째에는 모든 농도에서 거의 다 제거되었다(Fig. 1). T.
- 200 ipm으로 진탕배양을 하였을 때 균사체가 뭉쳐 자라는 현상이 나타나며, 정치배양을 하였을 경우 균사가 배지 내에 넓게 퍼져 정치 배양 시 균사체의 생장이 더 많이 일어난 듯 보이지만 균사체의 건조중량을 조사하였을 때 이들 간의 균체량에도 큰 차이가 나타나지 않았다(결과 미제시). Mediator는 laccase에 의해 산화되는 작용범위를 넓혀주는 역할을 하는데(1), 생분해율을 높이기 위하여 laccase의 mediator를 첨가하여 bisphenol A의 분해율을 조사하였을 때 최소배지에서 ABTS가 분해율을 크게 증가시켰으나 HBT 첨가 시에는 오히려 대조군보다 생분해율이 낮았다. ABTS는 T.
- 6)에서 분해율이 가장 우수하였다. T. versicolor^ 접종과 동시에 bisphenol A 50 mg/L를 넣은 후 ABTS 200 jjM을 첨가한 경우에는 24시간 이내에 bisphenol A가 100% 분해되었으나 HBT는 24, 36, 48시간 동안 각각 25.2, 96.9, 100%로 mediator를 첨가하지 않았을 때와 비교하여 오히려 낮은 분해율을 보였다.
- 1). T. versicolor^] 접종과 동시에 bisphenol A 50 mg/L을 넣고 온도조건을 달리하였을 때 12시간 배양 후 35℃에서 100% 제거되어 분해율이 가장 우수하였다(Fig. 2). YMG 배지의 초기 pH를 달리하여 T.
- versicolor^ 5일 선배양한 후 bisphenol A 50 mg/L를 첨가한 결과 6시간 배양 이내에 bisphenol A가 100% 분해되었다. T. versicolor의 접종과 동시에 bisphenol A 50 mg/L를 넣어 온도와 pH가 bisphenol A 생분해에 미치는 영향을 조사하였을 때 30°C (Fig. 5)와 pH 6 (Fig. 6)에서 분해율이 가장 우수하였다. T.
- versicolor는 12시간 이내에 bisphenol A를 100% 분해시켰다. YMG 배지에 T. versicolor를 접종하여 5일 동안 선배양한 후 bisphenol A 50 mg/L를 첨가한 결과 T. versicolor는 bisphenol A를 1시간 동안 56.1%, 2시간에는 100% 분해하였다. Bisphenol A를 1, 25, 50, 100 mg/L의 농도로 첨가하여 생분해율을 조사하였을 때, 6시간 동안 각각 95.
- YMG 배지에서 bisphenol A의 생분해 시 yeast two-hybrid system (14)을 이용하여 에스트로겐 활성을 측정하였는데 1, 25, 50, 100 mg/L bisphenol A 농도에서 6시간째에 에스트로겐 활성이 각각 100, 63.5, 32.4, 15.3%, 12시간 반응 후에는 100, 89.1, 93.1, 62.5%가 각각 감소하였다.
- 1). YMG 배지에서 온도조건을 달리 하여 생분해에 미치는 영향을 조사한 결과 35℃에서 분해율이 가장 높게 나타났으며 30℃에서도 거의 유사하였다(Fig. 2). 반면에 최소배지에서는 30℃에서 생분해율이 가장 우수하였으며 35℃에서는 분해율이 30℃에 비해 약간 떨어졌다(Fig.
- 2). YMG 배지의 초기 pH를 달리하여 T. venricoZor의 접종과 동시에 bisphenol A 50 mg/L을 첨가하여 12시간 배양하였을 때 초기 pH 6에서 bisphenol A가 91% 제거되어 분해율이 가장 우수하였다(Fig. 3). 교반의 영향은 그리 크지 않아 12시간 경과 후 정치배양은 99.
- 8%의 분해를 나타내었다. YMG 액체배지에서 T. versicolor^ 선배양 시간을 달리한 접종원이 생분해에 미치는 영향을 조사하였을 때 7일 선배양 균주 접종 시 bisphenol A가 6시간 만에 100% 분해되어 가장 높은 생분해율을 나타내었다(Fig. 4).
- 3). 교반의 영향은 그리 크지 않아 12시간 경과 후 정치배양은 99.4 %, 진탕배양은 95.4-98.8%의 분해를 나타내었다. YMG 액체배지에서 T.
- versicolor의 접종과 동시에 bisphenol A 50 mg/L를 넣어 6시간 간격으로 bisphenol A의 잔존량을 조사하였다. 그 결과 T. versicolor는 12시간 이내에 bisphenol A를 100% 분해시켰다. YMG 배지에 T.
- 2). 반면에 최소배지에서는 30℃에서 생분해율이 가장 우수하였으며 35℃에서는 분해율이 30℃에 비해 약간 떨어졌다(Fig. 5). 백색부후 균의 리그닌 분해효소인 laccase는 bisphenol A 생분해에 관여한다고 알려졌으며 45℃의 비교적 높은 온도에서 laccase에 의한 bisphenol A의 전환율이 가장 높은 것으로 보고되었는데(10), bisphenol A의 생분해에 있어 최소배지에 비해 짧은 시간 내에 분해가 일어나는 YMG 배지에서는 균체량에 의한 의존도보다는 분비된 laccase에 의존한 분해의 가능성이 높을 것으로 예상된다.
- 배지 초기 pH에 따른 영향은 YMG 배지와 최소배지 모두 초기 pH 6의 배지에서 분해율이 가장 우수하였고 pH 7 이상의 조건에서는 생분해율의 급격한 감소를 보였다(Fig. 3 and 6). 백색부후 균은 약 산성조건에서 우수한 생장을 보이며, laccase 또한 pH 5에서 bisphenol A의 전환이 우수하다고 조사된 바 있다(10).
- 바 있다(13). 본 연구에서 구름버섯 균주 접종과 동시에 bisphenol A 50 mg/L를 첨가하였을 때 YMG 배지에서 T. versicolor는 12시간 이내에 bisphenol A를 100% 분해하였으며 최소배지에서는 36시간 이내에 bisphenol A가 100% 분해되었다. 영양물질이 풍부한 YMG 배지에서는 균주의 생장이 빠르기 때문에 최소배지에서보다 생분해율이 높았으며 동일한 현상이 여러 백색부후균에 의한 2, 4, 6-trinitrotoluene (TNT) 분해에서도 나타났다(9).
- 백색부후 균의 리그닌 분해효소인 laccase는 bisphenol A 생분해에 관여한다고 알려졌으며 45℃의 비교적 높은 온도에서 laccase에 의한 bisphenol A의 전환율이 가장 높은 것으로 보고되었는데(10), bisphenol A의 생분해에 있어 최소배지에 비해 짧은 시간 내에 분해가 일어나는 YMG 배지에서는 균체량에 의한 의존도보다는 분비된 laccase에 의존한 분해의 가능성이 높을 것으로 예상된다. 실제로 laccase 활성과 연관된 bisphenol A 분해의 영향을 조사하기 위하여 T. versicolor^} laccase 분비 활성이 매우 높은 시기인 배양 7일째 균주를 접종물로 사용하여 T. versicolor의 접종과 동시에 bisphenol A 50mg/L를 첨가하였을 때 6시간 만에 100% 분해되는 매우 높은 분해능을 보였다. 이 결과는 상당량의 균체량을 확보한 후 bisphenol A와 반응시키는 선배양의 결과와 비교하였을 때에도 분해율의 큰 차이를 보이지 않으며 bisphenol A의 분해에 있어 laccase 활성이 크게 좌우함을 알 수 있다.
- versicolor의 접종과 동시에 bisphenol A 50mg/L를 첨가하였을 때 6시간 만에 100% 분해되는 매우 높은 분해능을 보였다. 이 결과는 상당량의 균체량을 확보한 후 bisphenol A와 반응시키는 선배양의 결과와 비교하였을 때에도 분해율의 큰 차이를 보이지 않으며 bisphenol A의 분해에 있어 laccase 활성이 크게 좌우함을 알 수 있다. 백색부후 균이 분비하는 리그닌 분해효소로 laccase, manganese dependent peroxidase (MnP), lignin peroxidase (LiP)가 대표적인 것으로 알려져 있는데(15), YMG 배지에서 T.
- 7). 이런 결과는 선배양 시생 분해능이 촉진되는 현상과 유사하며 일정량 이상의 균사체가 확보된 경우에는 T. versicolor^ 충분히 추가적으로 생장하며 생분해능을 나타낼 수 있을 것으로 추정된다. 따라서 고정화 백색부후 균 반응조 등을 활성슬러지 반응조와 조합을 만들어 이용할 경우 bisphenol A 함유폐수에 적용할 수 있을 것으로 기대된다.
- 이전실험에서처럼 상등액에 대한 균사체의 비율이 10%일 경우에는 분해율이 그다지 높지 않았는데 이는 폐수 내 성분들에 의해 백색부후 균의 생장과 분해효소 분비가 제한되었기 때문인 것으로 추정되었다. 이에 따라 저해현상을 극복하고 단기간에 생장이 일어날 수 있도록 접종물 중 균체량의 비율을 높인 경우, 30%의 비율로 접종하였을 때에는 6일째에, 50%의 경우에는 4일째에 bisphenol A가 100% 분해되었다(Fig. 7). 이런 결과는 선배양 시생 분해능이 촉진되는 현상과 유사하며 일정량 이상의 균사체가 확보된 경우에는 T.
- 폐수에 최소배지의 영양성분과 bisphenol A 50 mg/L를 첨가한 후 T. versicolor 접종물 중 마쇄된 균사체의 비율이 높을수록 bisphenol A의 제거능이 높아져서 50%의 경우 4일 이내에, 30%의 경우 6일 이내에 bisphenol A가 100% 분해되었다(Fig. 7).
후속연구
- versicolor^ 충분히 추가적으로 생장하며 생분해능을 나타낼 수 있을 것으로 추정된다. 따라서 고정화 백색부후 균 반응조 등을 활성슬러지 반응조와 조합을 만들어 이용할 경우 bisphenol A 함유폐수에 적용할 수 있을 것으로 기대된다.
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