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문제 정의
- 본 연구의 목적은 ICR 계의 생쥐 복강 내 urethane 투여 후 발생되는 폐암종의 형태적 변화를 관찰하고, 각 단계에서 세포증식능과 세포자멸사 조절인자인 Caspase 3, Survivin, p53 단백질의 발현을 관찰하고 이를 통해 폐샘암종 분자 생물학적 특성의 이해와 더불어 악성전환 위험성과 관련된 표지자로서의 유의성을 검증하고자 하였다.
제안 방법
- PCNA 양성세포와 세포자멸사 염색의 판정은 양측 폐에서 관찰된 증식증, 샘종, 그리고 샘암종을 400배 시야에서 사진촬영한 후 15개의 병변을 선정하여 하나의 병변마다 1,000개 이상의 세포를 관찰하여 양성 세포 수에 대한 백분율로 표기하였다.
- Survivin, Caspase 3, 그리고 p53 항체에 대한 염색의 판정은 핵에 갈색으로 염색된 세포의 수가 5% 이상일 경우 양성으로 판정하였다.
- Urethane 을 투여 후 생존한 40 마리의 생쥐 폐의 변화를 5주, 15주, 그리고 25주 간격으로 관찰하였다. Urethane 투여 5주 후에는, 폐포 내 정상 상피세포보다 두배 이상으로 농염된 핵과 핵소체가 보이는 이형성 증식세포가 부분적으로 관찰되었다.
- 본 연구에서는 실험대조군으로 5주령 된 생쥐 한 마리당 urethane 60 mg을 1주에 2회씩 3회 복강 내 투여 후 생쥐 폐에서 관찰된 형태적 소견은 5주부터 부분적으로 폐포 내벽을 따라 경도의 이형성을 보이는 상피세포가 증식하였고, 15주 후에는 일부에서 주변 폐 실질을 압축시키는 샘종의 출현과 더불어 점차 진행하여, 25주 이후에서 주변으로 침윤성 양상을 보이는 샘암종이 관찰되었다. Urethane에 의한 실험적 폐샘암종 유발은 보통 urethane의 농도를 5주령 생쥐 한 마리당 12 mg(0.5 mg/gm 체중) 투여할 경우 30주 이후에서 출현하는 것으로 보고되어 있으나13, 본 실험에서는 생쥐 한 마리당 5배 높은 60 mg(2.5 mg/gm 체중)을 투여하였다. 이는 폐샘암종 유발기간을 단축시키기 위함이었다.
- . urethane 투여 후 발생되는 폐의 다양한 증식증, 샘종 및 샘암종에서 세포증식능을 측정하여 각 병변에서 생물학적인 특성을 비교-검토할 수 있었다. 연구 결과 PCNA 표지지수는 증식증에서 9.
- 또한 Survivin(mouse monoclonal, MS-1203, 1:100, Neomarker, Fremont, CA), p53 (mouse monoclonal, MS-104, 1:100, Neomarker, Fremont, CA), 그리고 Caspase 3(rabbit polyclonal, ab4051-500, 1:100, Abcam, Cambridge, MA)를 사용하였고 발색제는 3-amino-9-ethyl carbazol(AEC)로 염색하고 Mayer’s hematoxylin으로 대조 염색하여 글리세린으로 봉입한 다음 현미경으로 관찰하였다.
- 알킬화 발암물질인 urethane은 표적세포의 DNA에 직접 작용하여 돌연변이를 유발 하는 유전자 독성물질로 ICR계 생쥐 복강 내에 투여 하면 시간경과에 따라 폐포상피세포의 증식, 샘종을 거쳐 인체에서 발생되는 샘암종과 형태적으로 유사한 병변이 초래되어 널리 사용되고 있다3. 본 연구에서는 실험대조군으로 5주령 된 생쥐 한 마리당 urethane 60 mg을 1주에 2회씩 3회 복강 내 투여 후 생쥐 폐에서 관찰된 형태적 소견은 5주부터 부분적으로 폐포 내벽을 따라 경도의 이형성을 보이는 상피세포가 증식하였고, 15주 후에는 일부에서 주변 폐 실질을 압축시키는 샘종의 출현과 더불어 점차 진행하여, 25주 이후에서 주변으로 침윤성 양상을 보이는 샘암종이 관찰되었다. Urethane에 의한 실험적 폐샘암종 유발은 보통 urethane의 농도를 5주령 생쥐 한 마리당 12 mg(0.
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2. 실험동물의 구분과 실험방법
실험동물 70마리를 각각 정상대조군 15마리, 실험대조군으로 urethane 투여 군 55마리로 배분하였다. 실험은 urethane(2.
- 실험동물은 생후 5주 된 ICR 계 수컷 생쥐(Samtaco Bio Korea) 70마리를 사용하였고, 사료는 시판고형사료(삼양사료 주식회사, 한국)를 사용하였다. 실험동물은 생쥐용 쥐장에 10마리씩 넣어 환경 적응을 위해 실험 1주일 전부터 동일 조건 하에서 미리 사육시켰다. Urethane은 Sigma 회사(Sigma-Aldrich Co, St.
- 실험시작 후 5주, 15주에 각각 대조군 5마리와 실험군 10마리씩, 그리고 실험이 종료되는 25주에는 생존해 있는 모든 동물의 경추를 탈골시키고 개복한 후 양측 폐를 절제 후 기관지에 10% 중성 포르마린을 주입하여 폐를 팽창시킨 다음 고정시켜 통상적인 방법으로 5 μm 두께의 조직표본을 만들어 헤마토실린과 에오신 염색하여 관찰하였다.
- 실험동물 70마리를 각각 정상대조군 15마리, 실험대조군으로 urethane 투여 군 55마리로 배분하였다. 실험은 urethane(2.5 mg/gm 체중)을 1주에 2번 연속적으로 복강 내 3회 주입하였다.
- 실험적 폐 샘암종 발생과정에서 형태학적 분류에 따른 세포증식능지수, 세포자멸사 빈도, Survivin, Caspase 3, 그리고 p53 발현을 조사하는 것이므로 분석단위는 생쥐의 개체가 아니라 폐의 병변으로 하였다.
- 파라핀 포매조직을 통상적인 방법으로 알코올로 함수과정을 거쳐 감추어진 항원을 노출시키기 위해 citric acid 완충액에 넣고 고압극초단파(750 W)에서 20분간 처리 후, 실온에서 30분간 식힌 다음 Tris 용액으로 세척하고 avidin-biotin complex 방법을 이용 하여 일련의 면역조직화학적 염색을 시행하였다. 일차항체로 세포증식능은 생쥐 단클론 항PCNA 항체 (Novocastra Co, Newcastle, UK, 1 : 1000)를, 세포자멸사는 TUNEL 방식을 이용하여 Tdt DAB in situ apoptosis detection kit(Travigen, Gaithersburg, MD)를 사용하였다.
대상 데이터
- 실험동물은 생쥐용 쥐장에 10마리씩 넣어 환경 적응을 위해 실험 1주일 전부터 동일 조건 하에서 미리 사육시켰다. Urethane은 Sigma 회사(Sigma-Aldrich Co, St. Louis, MO) 제품을 구입하여 사용하였다.
- 실험동물은 생후 5주 된 ICR 계 수컷 생쥐(Samtaco Bio Korea) 70마리를 사용하였고, 사료는 시판고형사료(삼양사료 주식회사, 한국)를 사용하였다. 실험동물은 생쥐용 쥐장에 10마리씩 넣어 환경 적응을 위해 실험 1주일 전부터 동일 조건 하에서 미리 사육시켰다.
데이터처리
- 통계적 유의성에 대한 평가는 Student T 검정법을 이용하였으며, p값이 0.05 미만인 경우 통계적 유의성이 있는 것으로 판정하였다.
이론/모형
- 파라핀 포매조직을 통상적인 방법으로 알코올로 함수과정을 거쳐 감추어진 항원을 노출시키기 위해 citric acid 완충액에 넣고 고압극초단파(750 W)에서 20분간 처리 후, 실온에서 30분간 식힌 다음 Tris 용액으로 세척하고 avidin-biotin complex 방법을 이용 하여 일련의 면역조직화학적 염색을 시행하였다. 일차항체로 세포증식능은 생쥐 단클론 항PCNA 항체 (Novocastra Co, Newcastle, UK, 1 : 1000)를, 세포자멸사는 TUNEL 방식을 이용하여 Tdt DAB in situ apoptosis detection kit(Travigen, Gaithersburg, MD)를 사용하였다. 또한 Survivin(mouse monoclonal, MS-1203, 1:100, Neomarker, Fremont, CA), p53 (mouse monoclonal, MS-104, 1:100, Neomarker, Fremont, CA), 그리고 Caspase 3(rabbit polyclonal, ab4051-500, 1:100, Abcam, Cambridge, MA)를 사용하였고 발색제는 3-amino-9-ethyl carbazol(AEC)로 염색하고 Mayer’s hematoxylin으로 대조 염색하여 글리세린으로 봉입한 다음 현미경으로 관찰하였다.
- 실험시작 후 5주, 15주에 각각 대조군 5마리와 실험군 10마리씩, 그리고 실험이 종료되는 25주에는 생존해 있는 모든 동물의 경추를 탈골시키고 개복한 후 양측 폐를 절제 후 기관지에 10% 중성 포르마린을 주입하여 폐를 팽창시킨 다음 고정시켜 통상적인 방법으로 5 μm 두께의 조직표본을 만들어 헤마토실린과 에오신 염색하여 관찰하였다. 폐병변의 형태학적 소견은 Foley 등2의 판정기준에 따라 이형성 증식증, 샘종, 그리고 샘암종으로 분류하였다.
성능/효과
- Survivin 양성인 경우 세포자멸사 지수는 2.61±2.08%이었고 survivin이 음성인 경우에는 1.64±1.86%로 양성 및 음성군간에는 유의한 차이를 보이지 않았다(Table 4).
- Urethane 투여 후 발생한 폐의 증식증에서 PCNA 표지지수는 9.6±8.9, 샘종에서는 23.2±14.8이었고(Figure 1D) 샘암종에서는 55.7±19.4로 폐암종 발생과정에서 통계적으로 유의하게 지속적으로 증가하였다 (p<0.01).
- Urethane으로 유도된 폐의 증식증, 샘종, 그리고 샘암종에서 capase 3의 양성부위와 음성부위에서의 세포증식능은 32.2±18.5%와 20.5±19.9%로 나타나 caspase 3 양성부위에서 세포증식 지수가 증가하는 경향을 보였다.
- 그러한 증거로서 인체에 발생한 폐암종17과 방광암종18에서 종양 내에 세포자멸사가 많은 경우 대부분 증식하는 세포의 증가로 종양이 진행되어 있었다는 것과 일치하는 결과였다. 결국 본 연구에서 urethane에 의한 생쥐의 폐샘암종 발생 및 진행과정에서 세포증식과 세포자멸사가 서로 밀접하게 연관되어 있다는 것을 확인할 수 있었다. 그렇지만 SV40-T 항원으로 형질전환 시킨 생쥐에 발생한 유방암종에서 세포자멸사 표지지수가 암종보다는 전암 단계인 비정형성 상피세포증식증에서 증가하였다는 Shibata 등19의 보고와는 상반되었다.
- 결론적으로 본 연구를 통하여 PCNA와 세포자멸사지수는 암세포로의 형질전환하는 위험도를 평가하는 지표로 유용할 것으로 보이며, caspase, survivin은 p53는 urethane에 의해 유도된 생쥐 폐암 모델에서 발암과정에 중요하게 관여하는 단백질로 보인다.
- 또한 survivin 양성부위와 음성부위에서의 세포증식능은 29.2±21.7%와 21.4±20.1% 로 나타났으며, 통계적으로는 유의한 차이가 없었다.
- 이와 같은 소견으로 Survivin 단백은 종양이 형성되는 과정 동안 점차적으로 발현이 증가하는 단백으로 종양의 형성 및 진행 과정에 영향을 미치는 것으로 생각되었다. 또한 본 연구에서 survivin 발현 양성군과 음성군에서 세포증식 능의 차이가 없었다. 이런한 점은 종양의 유형간 차이가 있을 것으로 추측하였다.
- 이런 점으로 미루어 기능적으로 두 단백질이 샘암종으로 진행 하는 과정에서 독립적으로 또는 상호 연관성을 통하여 일정한 역할을 하는 것으로 볼 수 있을 것이다. 또한 세포증식지수와 세포자멸사 지수가 모두 증식증이나 샘종에 비해 샘암종에서 증가하였고(Table 2) caspase- 3나 survivin이 발현될 경우 세포증식지수나 세포자멸사지수가 증가하는 경향이 있어 보이는 결과(Table 3)로 보아, survivin과 caspase-3는 상반되는 기능을 가지고 있음에도 불구하고 유사하게 증가할 수 있을 것으로 보인다. 결국 Table 3에서 보는 바와 같이, caspase-3과 survivin의 발현으로 세포증식 지수나 세포자멸사 지수가 증가하는 것은 이 두 지수사이에는 분자생물학적인 기작에 연관성을 시사하면서도 구체적인 현상은 서로 독립적으로 다른 경로를 거칠 것이 충분히 예상되기 때문에, caspase-3와 survivin의 발현과 두 지수 사이의 관계는 앞으로 더욱 연구되어져야할 부분으로 보인다.
- 따라서 돌연변이 p53 유전자는 survivin의 작용을 억제하지 못하기 때문에 survivin 단백발현이 증가한다12. 본 실험에서는 폐암종 형성과정에서부터 caspase 3와 survivin이 발현되었고, 암종에서는 발현율이 현저하게 높았다. 그렇지만 p53 단백은 샘암종의 일부에서만 발현된 점으로 미루어 caspase 3와 survivin의 발현은 p53유전자 이외에 다른 요소가 있을 것으로 생각한다.
- Caspase 3와 survivin 발현은 샘암종의 초기단계에서부터 지속적으로 관여하며, 본 실험 모델에서는 p53유전자 변이는 초기보다는 암종으로 형질전환이 일어난 후에 부분적으로 발생하였을 수 있다. 본 연구를 통하여 urethane에 의한 생쥐의 폐샘암종 발생과정에서 세포증식능과 세포자멸사는 종양의 발생과 진행과정에서 지속적으로 관여함을 알 수 있었다.
- 본 연구에서 survivin 단백 발현은 증식증에서 10%, 샘종에서는 20%의 발현되었으나 샘암종에서는 40%에서 관찰되어 폐샘암종의 발생과 진행에 중요한 역할을 하는 것으로 생각된다. 이와 같은 소견으로 Survivin 단백은 종양이 형성되는 과정 동안 점차적으로 발현이 증가하는 단백으로 종양의 형성 및 진행 과정에 영향을 미치는 것으로 생각되었다.
- . 본 연구에서 urethane에 의한 방광암 폐샘암종 발생 및 진행과정에서 세포자멸사는 증식증에서 0.24%, 샘종에서 1.25%, 그리고 샘암종에서 상대적으로 현저하게 높은 5.21%이었다. 이러한 결과는 urethane에 의한 폐샘암종 발생과정에서 악성종양으로 진행할수록 세포증식이 현저하게 증가함에 따라과도하게 생성되었거나 유전적 손상을 가지고 있는 종양세포들을 제거하는 빈도가 상대적으로 증가하기 때문으로 생각된다.
- 본 연구에서도 urethane 투여 후 발생한 폐의 샘암종 발생과정에서 증식증과 샘종에서 p53 단백은 발현되지 않았으나, 샘암종에서는 전체 15예 중 2예 (13.3%)에서 관찰되었다. 이러한 결과로 p53단백은 화학적 발암원에 의한 폐샘암종 발생과정에서 대부분 발현되지 않거나, 발현되더라도 진행된 샘암종의 일부에서 관찰되는 변화로 생각되었다.
- 세포자멸사 빈도는 증식증에서는 0.24±0.01, 샘종에서는 1.25±0.03, 그리고 샘암종에서는 5.21±0.68으로(Figure 1E) PCNA지수와 마찬가지로 폐암종 발생과정에서 지속적으로 증가하였다(p<0.01)(Table 2).
- 세포자멸사지수는 caspase 3 양성부위에서 3.08±2.01%로 음성부위에서의 1.53±1.71%보다 통계적으로 유의하게 증가 하였다(p<0.01).
- urethane 투여 후 발생되는 폐의 다양한 증식증, 샘종 및 샘암종에서 세포증식능을 측정하여 각 병변에서 생물학적인 특성을 비교-검토할 수 있었다. 연구 결과 PCNA 표지지수는 증식증에서 9.6%, 샘종에서는 23.2%, 그리고 샘암종에서는 55.7%로 발암과정에 비례하여 순차적으로 증가하였다. 결국 종양세포에서 PCNA의 지속적인 증가의 의미는 G1기에서 S기에 있는 세포로 단백질 합성이 증가되고 있음을 의미하며, 이를 유발하는 세포분열의 조절기능 장애는 샘암종으로 진행되면서 더 심하게 일어난다고 생각된다.
- 폐의 증식증 20예 중 2예로 10%의 양성률을 보였고, 샘종 25예 중 5예로 20%에서, 그리고 샘암종 15예 중 6예에서 양성으로 40%의 양성률을 보여 암종으로 진행할수록 survivin의 발현은 증가하는 양상을 보여주었다 (Figure 1G)(p<0.01).
- 이러한 점으로 미루어 survivin은 caspase 3의 활성을 억제시킬 수는 있지만 caspase 3 단백발현과는 상호관련이 없을 수도 있을 것이다. 한편 본 연구에서 caspase 3가 발현되어 있는 세포군에서 세포자멸사가 증가되어 있는 점으로 보아 caspase 3는 세포자멸사와 관련이 있을 것으로 추측되었다.
후속연구
- 또한 세포증식지수와 세포자멸사 지수가 모두 증식증이나 샘종에 비해 샘암종에서 증가하였고(Table 2) caspase- 3나 survivin이 발현될 경우 세포증식지수나 세포자멸사지수가 증가하는 경향이 있어 보이는 결과(Table 3)로 보아, survivin과 caspase-3는 상반되는 기능을 가지고 있음에도 불구하고 유사하게 증가할 수 있을 것으로 보인다. 결국 Table 3에서 보는 바와 같이, caspase-3과 survivin의 발현으로 세포증식 지수나 세포자멸사 지수가 증가하는 것은 이 두 지수사이에는 분자생물학적인 기작에 연관성을 시사하면서도 구체적인 현상은 서로 독립적으로 다른 경로를 거칠 것이 충분히 예상되기 때문에, caspase-3와 survivin의 발현과 두 지수 사이의 관계는 앞으로 더욱 연구되어져야할 부분으로 보인다. Li 등26은 위샘암종에서 survivin과 caspase 3의 발현양상은 역관계가 있다고 보고하였다.
- 심지어 p53의 돌연변이나 야생형 p53의 발현 증가가 전혀 관찰되지 않은 연구보고도 있다32. 이러한 결과들을 종합하여 보면, 생쥐에서 Urethane에 의한 폐암이 발현되는 과정에는 p53는 선도적인 역할을 하지 않는 것처럼 보이는데, 사람에서 생기는 발암 과정에서는 p53의 돌연변이가 매우 중요한 역할을 할 것으로 보이는 것과 대조되어 이러한 발암과정의 차이에 대한 연구가 앞으로 필요할 것으로 보인다.
- 결국 세포자멸사와 PCNA의 상관성에 대해서 본 실험만으로는 그 이유를 설명할 수가 없었고, urethane에 의해 유발된 생쥐의 폐샘암종에서 세포자멸사를 연구한 다른 논문들이 없어 비교 고찰할 수가 없었다. 이에 대해 추후 다양한 방법으로 확인해야 할 것이다.
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