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문제 정의
- 본 연구에서는 난분해성 PAHs로 오염된 유류 오염 토양으로부터 분리한 Sphingomonas sp. KS 301의 SOD를 순수 정제하여 그 특징을 알아보고자 하였다.
- 이 활성산소들을 제거하는 데에는 SOD가 필수적이므로 PAH 분해 균들의 SOD들은 연구해 볼 가치가 있다. 따라서 본 연구는 유류 오염 토양에서 phenanthrene과 같은 난분해성 PAH들을 분해하는 미생물들 중에서 SOD 활성이 높은균주로부터 SOD를 순수 정제하여 PAH 분해균주 자신의 산화적스트레스에 대한 방어 체계 담당하는 SOD들의 특성을 밝히고자수행되었다.
제안 방법
- DEAE-Sepharose 크로마토그래피를 통하여 얻은 각각의 SOD 활성 분획들에 대해 Phenyl-Sepharose 크로마토그래피를 실시하였다. HiPrep Phenyl-Sepharose column (16x10 cm)를 1.
- 배양한 Sphingomonas sp. KS 301 균을 수확하여 French Press를 이용하여 세포 주출물을 만들고 DEAE-Sepharose 크로마토그래피를 시행하였다. 각 분획물들의 SOD 활성을 측정한 결과 Fig.
- Sphingomonas sp. KS 301 균주로부터 분리 정제한 SOD를 기초과학지원연구소에 의뢰하여 N-말단 아미노산 서열을 분석하였다. 분석 결과를 National Center for Biotechnology Information (NCBI)의 Basic Local Alignment Search Tool (BLAST)를 이용하여 다른 알려진 균주들의 SOD 아미노산 서열과의 유사도를 살펴보았을 때 SOD Ⅲ는 분석한 13개의 N-말단 아미노산 서열중 9개의 N-말단 아미노산 서열이 Psudomonas ovalis 및 Vibrio cholerae의 SOD들과 같아 가장 유사하였다(Table 3).
- Sphingomonas sp. KS 301 균주에서 분리 정제한 SOD와 Mn 및 Fe type의 E. coli SOD의 농도를 달리 하면서 활성을 측정하고 비교하였다. Fig.
- Native 상태의 분자량을 측정하기 위해서 Superose- 12 gel filtration 크로마토그래피를 실시하였다. 먼저 여과한 100 mM NaCl, 20 mM Tris (pH 8.
- 35 ml/minM로 조절하였다. Phenyl-Sepharose 크 로마토그래피를 수행한 각 SOD 시료들을 ultrafiltration (NOVEX 사의 viva spin)으로 농축하고 NaCl과 glycerol0] 각각 100 mM, 7% 되게 첨가한 후 column에 장전하고, equilibration과 동일한 조건으로 흘리며 fraction당 0.75 ml씩 수집하였다. Solution assay를 통하여 SOD 활성이 높은 분획물들을 모아 20 mM Tris (pH 8.
- Phenyl-Sepharose 크로마토그래피를 통하여 얻은 SOD 활성 분획물들에 대해 Superose-12 10/300 columne 크로마토그래피를 실시하였다. 먼저 100 mM NaCl이 들어있는 20 mM Tris (pH 8.
- SOD 활성의 최적 pH를 알아보기 위해 50 mM sodium acetate (pH 5.0) 완충용액, 50 mM 2-[N-Morpholino]-ethanesulfonic acid (MES)(pH 6.0) 완충용액, 50 mM potassium phosphate (pH 7.0, 7.8) 완충용액, 50 mM Tris-HCl (pH 8.0) 완충용액, 50 mM glycine (pH 9.0, 10.0) 완중용액을 넣고 NBT reduction assay로 30℃에서 20분간 반응한 후 SOD 활성을 측정하였으며, 열에 대한 안정성을 조사하기 위하여 reagent들과 xanthine oxidase가 없는 반응 용액에 적당량의 SOD를 넣고 각각 45℃에서 0, 5분, 10분, 15분, 30분 동안 미리 반응시킨 후 xanthine, NBT, xanthine oxidase 넣고 다시 3VC에서 20 분간 반응시킨후 흡광도 560 nm에서 SOD의 활성을 측정하였다. 또한 분리정제한 SOD의 최적 온도를 알아보기 위하여 까지 다양한 온도에서 NBT reduction assay로 활성을 측정하였다.
- SOD의 분자량을 측정하기 위해 정제된 SOD를 12% SDS- PAGE를 실시하고 크기를 알고 있는 표준 단백질들과 비교하여분자량을 계산하였으며, 더 정확한 분자량을 알기 위하여 MALDI-TOF MS를 이용한 분석을 기초과학지원연구소에 분석을의뢰하였다. Native 상태의 분자량을 측정하기 위해서 Superose- 12 gel filtration 크로마토그래피를 실시하였다.
- SOD의 종류를 알아보기 위해 정제한 SOD와 Mn type의 E. coli SOD에 SOD 활성의 억제 물질인 KCN, H2O2, NaNg 또는 EDTA를 여러가지 농도로 반응 용액에 첨가하고 3(TC에서 20 분간 반응시킨 후 NBT reduction assay로 측정하였다.
- 75 ml씩 수집하였다. Solution assay를 통하여 SOD 활성이 높은 분획물들을 모아 20 mM Tris (pH 8.0) 완충용액으로 4℃에서 투석하였다.
- Superose-12 gel filtration 크로마토그래피를 통해 얻은 SOD 활성이 높은 분획물들에 대해 Uno-Ql ion exchange 크로마토그래피를 수행하였다. Uno-Ql column을 20 mM Tris (pH 8.
- 2). 각 SOD 활성을 가지는 분획들을 모아 각각ammonium sulfhte 35-75% 포화를 통하여 분획하고 20 mM Tris (pH 8.0) 완충용액으로 하룻밤 투석하였다. 투석한 분획들을 Phenyl-Sepharose 크로마토그래피를 실시하였는데 Phenyl- Sepharose column에는 SOD가 결합되지 않고 관통하여 solution assay를 통해 SOD 활성이 높은 분획을 모아 ultrafiltration으로 농축하고 Superose-12 gel filtration 크로마토그래 피 를 실시 하였다 (Fig.
- 0) 완충용액으로 세척 한 후 총 15 ml의 0-500 mM NaCl 농도 구배를 걸어 분획 하였다. 각 분획들에 SOD solution assay와 SDS-PAGE를 수행하여 활성과 순수 도가 높은 분획을 모아 20 mM Tris (pH 8.0) 완충용액으로 투석하여 NaCl을 제거하고 생화학적 및 물리화학적 특성을 조사하였다.
- 3A and 3B). 각 분획물 들을 solution assay와 gel overlay assay를 실시하여 SOD 활성이 높은 분획을 모-5 20 mM Tris (pH 8.0) 완충용액으로 하룻밤 투석하여 NaCl을 제거한 후 다섯가지의 SOD들을 Uno-Ql ion exchange 크로마토그래피를 실시하였다.
- 0) 완중용액을 넣고 NBT reduction assay로 30℃에서 20분간 반응한 후 SOD 활성을 측정하였으며, 열에 대한 안정성을 조사하기 위하여 reagent들과 xanthine oxidase가 없는 반응 용액에 적당량의 SOD를 넣고 각각 45℃에서 0, 5분, 10분, 15분, 30분 동안 미리 반응시킨 후 xanthine, NBT, xanthine oxidase 넣고 다시 3VC에서 20 분간 반응시킨후 흡광도 560 nm에서 SOD의 활성을 측정하였다. 또한 분리정제한 SOD의 최적 온도를 알아보기 위하여 까지 다양한 온도에서 NBT reduction assay로 활성을 측정하였다.
- coil의 Mn-SOD의 경우에도 NaNa에 의해서 활성이 억제되었지만 cyanide와 H2O2 에 의해서는 그렇지 않아 정제한 SOD Ⅲ는 Mim-SOD형이라는 것을 알 수 있었다. 또한 정제한 SOD Ⅲ가 금속 이온에 영향 을받는 지 알아보기 위해 우선 EDTA에 영향을 받는지 먼저 확인하였다. 1 mM EDTA, 5 mM EDTA를 반응 용액에 넣어 NBT reduction assay로 SOD 활성을 측정해 보니 영향을 받지 않는것으로 나타났다.
- coil의 Mn-SOD의 경우에도 NaNa에 의해서 활성이 억제되었지만 cyanide와 H2O2 에 의해서는 그렇지 않아 정제한 SOD Ⅲ는 Mim-SOD형이라는 것을 알 수 있었다. 또한 정제한 SOD Ⅲ가 금속 이온에 영향 을받는 지 알아보기 위해 우선 EDTA에 영향을 받는지 먼저 확인하였다. 1 mM EDTA, 5 mM EDTA를 반응 용액에 넣어 NBT reduction assay로 SOD 활성을 측정해 보니 영향을 받지 않는것으로 나타났다.
- Native 상태의 분자량을 측정하기 위해서 Superose- 12 gel filtration 크로마토그래피를 실시하였다. 먼저 여과한 100 mM NaCl, 20 mM Tris (pH 8.0) 완충용액으로 유속 0.2 ml/ min으로 흘려주면서 column을 충분히 평형화시킨 후 표준 단백질들, amylase (200 kDa), alchol dehydrogenase (150 kDa), bovine serum albumin (68 kDa), carbonic anhydrase (29 kDa), lysozyme (14.4 kDa) (Sigma)과 정제한 SOD들을 각각 장전하여 0.4ml/fraction으로 받고 standard graph를 그린 후 정제된 SOD 들의 복합체 여부를 판단하였다.
- 5 ml 만들었다. 반응 용액을 30℃에서 20분간 반응시킨 후 560 nm 흡광치로부터 SOD 활성을 측정하였다. SOD의 활성은 xanthine oxidase 에 의한 NBT의 환원을 50% 억제하였을 때 1 unit 라고 정의하였다.
- 5 ml, bromo-phenol blue 100㎕)과 섞은 후 10VC에서 5 분간 가열하여 변성 처리하였다. 변성 처리한 효소를 12% polyacrylamide separating gel과 5% stacking gel을 이용하여 120 V로 2시간 동안 전기영동을 실시하였다.
- 이 과정에서 유출물을 faction당 4 ml씩 분획한 후 SOD 활성을 측정하고 모았다. 본 연구에 이용된 SOD들은 모두 Phenyl-Sepharose column에 결합하지 않고 관통하거나 세척 과정에서 모두 발견되었으므로, ammonium sulfate 농도 구배를 하지 않았다.
- SOD의 비활성도 (specific activity)! 비교하기 위해 반응 용액에 정제된 SOD Ⅲ와 Mn 및 Fe type의 E. coli SOD (Sigma)를 각각 20 ng, 40 ng, 60 ng, 80 ng, 100 ng씩 넣고 xanthine oxidase 100 μg을 넣어 3VC에서 20분간 반응시킨 후 560 nm에서 흡광도의 변화를 측정하였다.
- 5 ml/min의 유속으로 장전한 후 1 L의 동일 완충용액으로 결합되지 않는 단백질이 완전히 제거되도록 흘려주었다. 수지에 결합된 단백질을 0- 350 mM NaCl 농도 구배를 걸어 1.2 ml/min의 유속으로 총 1 L를 흘리면서 7 ml씩 분획하여 SOD 활성을 측정하고 가장 높은 분획들을 모아 다음 과정에 이용하였다.
- 4 ml/min의 유속으로 장전하고 동일 완충용액으로 다시 흘려주었다. 이 과정에서 유출물을 faction당 4 ml씩 분획한 후 SOD 활성을 측정하고 모았다. 본 연구에 이용된 SOD들은 모두 Phenyl-Sepharose column에 결합하지 않고 관통하거나 세척 과정에서 모두 발견되었으므로, ammonium sulfate 농도 구배를 하지 않았다.
- 3C) solution assay와 SDS-PAGE를 이용하여 정제도를 조사해 본 결과 DEAE-Sepharose 크로마토그래피에서 가장 강한 활성을 나타내는 SOD Ⅲ가 정제되었다. 정제된 SOD Ⅲ를 SDS-PAGE, 비변성 PAGE 후 Coomassie staining, 그리고 비변성 PAGE 후 geloverlay assay를 비교하였다(Fig. 4). SOD Ⅲ는 비변성 PAGE와 gel overlay assay에서 단일 band를 보였으며, 또한 DEAE- Sepahrose 크로마토그래피, Phenyl-Sepharose 크로마토그래피, Superose-12 gel filtration 크로마토그래피 싱에서는 단일 band를 보였지만, 여전히 SDS-PAGE상에서 이 중 band를 보였다.
- 정제한 SOD Ⅲ의 시간 증가에 따른 열에 대한 안정성을 알아보고자 여러 온도에서 배양하면서 5분 간격으로 30분 동안 SOD 활성을 측정하였다. 45℃ 이상에서는 SOD 활성이 없다가 45℃ 이하부터 SOD 활성을 보였는데 10분 동안 preincubation 시키면 SOD 활성이 20% 감소하고 30분에서는 SOD 활성이 거의 없었다(Fig.
- 즉, Solution assay 상에서의 가장 활성이 높은 분획은 gel overlay assay상에서 가장 굵은 활성 띠로 나타났으며 또한 SDS-PAGE와 비교하였을 경우에도 서로 다른 크기의 SOD 단백질 활성 띠를 발견할 수 있었다. 측정 결과 발견한 다섯 가지의 활성들을 SOD I, Ⅱ, Ⅲ, IV, V라고 명명하고 각각 정제 과정에 이용하였다(Fig. 2). 각 SOD 활성을 가지는 분획들을 모아 각각ammonium sulfhte 35-75% 포화를 통하여 분획하고 20 mM Tris (pH 8.
- 투석한 ammonium sulfate 분획물에 대해 DEAE-Sepharose 크로마토그래 피 를 실시하였다. DEAE-Sepharose fest flow (2.
- 0) 완충용액으로 하룻밤 투석하였다. 투석한 분획들을 Phenyl-Sepharose 크로마토그래피를 실시하였는데 Phenyl- Sepharose column에는 SOD가 결합되지 않고 관통하여 solution assay를 통해 SOD 활성이 높은 분획을 모아 ultrafiltration으로 농축하고 Superose-12 gel filtration 크로마토그래 피 를 실시 하였다 (Fig. 3A and 3B). 각 분획물 들을 solution assay와 gel overlay assay를 실시하여 SOD 활성이 높은 분획을 모-5 20 mM Tris (pH 8.
- 효소정제 단계마다 SDS-PAGE (polyacrylamide gel electro- phoresis)로 효율을 측정해 가며, 최종 정제를 확인하였다. 효소를 4x 시료 완충용액 (1 M Tris-HCl; pH 6.
대상 데이터
- DEAE-Sepharose FF resin과 Superose-12 10/300, HiPrep 16/ 10 phenyl (low sub) column (Amersham, US A) 들과 Uno QI prepacked column (BioRad, USA)은 구입하여 사용하였으며, column들을 이용한 chromatography는 온도가 4℃로 유지되는 저온실에서 BioRad 사의 Biologic HR workstation을 이용하였다. 효소활성을 비교하기 위하여 사용한 Mn type과 Fe type의 E.
- 이용하였다. 효소활성을 비교하기 위하여 사용한 Mn type과 Fe type의 E. coli SOD 들은 Sigma (USA)에서 구입하여 사용하였다.
이론/모형
- SOD 활성을 간접적으로 측정하는 방법으로 xanthine/xanthine oxidase에 의해 SOD 활성을 cytochrome c와 NBT를 이용하는 두 가지 방법이 있는데 cytochrome c reduction assay (16)을 이용하여 측정하는 것보다 NBT reduction assay (20)를 이용하여 측정하는 것이 2.5배 민감하다고 알려져 있기 때문에 NBT reduction assay를 이용하였다. 100 pM xanthine, 25 NBT, 1 mM EDTA를 50 mM potassium phosphate (pH 7.
- 단백질 정량은 BSA (Bovine Serum Albumin)^- 표준 단백질로 이용하여 Bradford 방법(7)에 따라 595 nm에서 흡광도를 측정하여 수행하였다.
성능/효과
- 또한 정제한 SOD Ⅲ가 금속 이온에 영향 을받는 지 알아보기 위해 우선 EDTA에 영향을 받는지 먼저 확인하였다. 1 mM EDTA, 5 mM EDTA를 반응 용액에 넣어 NBT reduction assay로 SOD 활성을 측정해 보니 영향을 받지 않는것으로 나타났다. 따라서 다른 금속이온의 영향을 받는지 여부를 확인하지 않았다.
- 또한 정제한 SOD가 금속 이온에 영향을 받는지 알아보기 위해 우선 EDTA에 영향을 받는지 먼저 확인하였다. 1 mM EDTA, 5 mM EDTA를 반응용액에 넣어 NBT reduction assay로 SOD 활성을 즉정해 보니 영향을 받지 않는 것으로 나타났다.
- coli SOD의 농도를 달리 하면서 활성을 측정하고 비교하였다. Fig. 5에서 알 수 있듯이 본 연구에서 정제된 SOD Ⅲ가 E. coil의 SOD들보다 비활성도가 높게 나타났다. 즉 SOD Ⅲ는 5배 정도 활성이 높게 나타났다.
- Sphingomonas sp. KS 301 균의 세포 주줄물을 DEAE- Sepharose 크로마토그래피를 시행하여 SOD 활성을 측정한 결과 다섯 가지의 활성이 발견되었다. 이 활성들은 비변성 PAGE 전기영동을 실시한 후 gel overlay assay를 한 결과 Sphingomonas 균은 최소한 서로 다른 다섯 가지의 SOD들을 가지는 것으로 사료된다.
- 4). SOD Ⅲ는 비변성 PAGE와 gel overlay assay에서 단일 band를 보였으며, 또한 DEAE- Sepahrose 크로마토그래피, Phenyl-Sepharose 크로마토그래피, Superose-12 gel filtration 크로마토그래피 싱에서는 단일 band를 보였지만, 여전히 SDS-PAGE상에서 이 중 band를 보였다. 따라서 sod me 완전히 순수 정제되었다고는 볼 수 없다.
- 5 kDa으로 나타나 SDS-PAGE의 결과와거의 유사하였다. SOD의 분자구조를 알아보기 위하여 Superose- 12 gel filtration 크로마토그래피를 실시한 후 native 상태의 SOD 의 크기를 알고 있는 표준 단백질과 비교하였을 때 SOD Ⅲ는 71 kDa으로 측정되어 정제된 SOD가 최소한 2개 이상으로 이루어진 복합체라는 것을 알 수 있었다 .
- Uno-Ql ion exchange 크로마토그래피를 실시한 후(Fig. 3C) solution assay와 SDS-PAGE를 이용하여 정제도를 조사해 본 결과 DEAE-Sepharose 크로마토그래피에서 가장 강한 활성을 나타내는 SOD Ⅲ가 정제되었다. 정제된 SOD Ⅲ를 SDS-PAGE, 비변성 PAGE 후 Coomassie staining, 그리고 비변성 PAGE 후 geloverlay assay를 비교하였다(Fig.
- 따라서 sod me 완전히 순수 정제되었다고는 볼 수 없다. 그러나 SDS-PAGE와 비변성 PAGE로부터 다른 SOD들과 크기를 비교해 본 결과 Uno-Ql ion exchange 크로마토그래피 상의 band 중 작은 단백질이 SOD 활성을 가지는 것으로 나타났다. SOD 분리정제 단계를 Table 1에 정리하였다.
- 의 CuZn-SOD (6), Streptomyces으\ Ni-SOD들은 열에 불안정하다고 보고되었다(24). 다양한 온도에서 정제된 SOD 의 활성을 측정해 본 결과, 20-30℃ 사이에서 가장 높은 활성을 보이며 온도가 올라갈수록 활성이 급격하게 감소하여 40℃ 이상에서 50%로 떨어지고, 60℃에서는 그 활성이 전혀 나타나지 않았다. 이 결과는 대조군으로 이용한 E.
- 이 결과는 SOD Ⅲ 정제표 (Table 1)와 비교하였을 때와 유사함을 알 수 있다. 또한 xanthine oxidase의 활성을 50% 이상 억제하는 SOD의 양을 넣었을 때는 직선상의 상관관계가 떨어짐을 볼 수 있었다.
- 하지만 KCN과 AO?는 SOD Ⅲ을 10% 이하 억제시켰다(Table 2). 또한 비교 단백질로 사용한 E. coil의 Mn-SOD의 경우에도 NaNa에 의해서 활성이 억제되었지만 cyanide와 H2O2 에 의해서는 그렇지 않아 정제한 SOD Ⅲ는 Mim-SOD형이라는 것을 알 수 있었다. 또한 정제한 SOD Ⅲ가 금속 이온에 영향 을받는 지 알아보기 위해 우선 EDTA에 영향을 받는지 먼저 확인하였다.
- 또한 정제된 SOD들의 열에 대한 안정성을 조사해본 결과 SOD Ⅲ는 45℃에서 활성이 50% 감소되는 Tq이 7-8분으로 짧아 열에 대해 불안정 하였다. 반면에 대조군으로 이용한 E.
- 6). 또한 최적의 SOD 활성온도는 2VC인 것으로 나타났다. 정제한 SOD를 각기 다른 pH를 갖는 완충용액을 사용하여 SOD 활성을 측정한 결과, pH 7.
- 분리한 SOD들의 종류를 알 수 있는 NaN3, H2O2, KCN을 이용한 inhibitor의 효과를 살펴보았는데 SOD Ⅲ는 10 mM NaN3 에 의해서 56% 억제되었으며 HQz와 KCN에 의해서는 10% 미만으로 억제되었다. 일반적으로 CuZn-SOD의 경우 H2O2> KCN 에 의해 억제되며 Mn-SOD의 경우 NaNa에 의해 억제된다.
- KS 301 균주로부터 분리 정제한 SOD를 기초과학지원연구소에 의뢰하여 N-말단 아미노산 서열을 분석하였다. 분석 결과를 National Center for Biotechnology Information (NCBI)의 Basic Local Alignment Search Tool (BLAST)를 이용하여 다른 알려진 균주들의 SOD 아미노산 서열과의 유사도를 살펴보았을 때 SOD Ⅲ는 분석한 13개의 N-말단 아미노산 서열중 9개의 N-말단 아미노산 서열이 Psudomonas ovalis 및 Vibrio cholerae의 SOD들과 같아 가장 유사하였다(Table 3).
- 하지만 cambilalistic SOD들은 양상이 다양하다. 정제한 SOD Ⅲ는 10 mM NaNg에서 56% 활성이 억제되었다. 하지만 KCN과 AO?는 SOD Ⅲ을 10% 이하 억제시켰다(Table 2).
- 의 SOD도 활성을 위한 최적온도가 낮음을 알 수 있다. 정제한 SOD는 pH 7.0에서 가장 높은 활성을 가지는 매우 좁은 최적 pH 범위를 갖는 것으로 보였으며 이는 pH 3~9까지의 pH 범위를 가지는 Desulfovibrio gjgas의 Fe-SOD (11)와 ph7~10의 범위를 가지는 Fasciola hepatica의 CuZn-SOD (15)들과 상이하게 나타났다.
- 또한 최적의 SOD 활성온도는 2VC인 것으로 나타났다. 정제한 SOD를 각기 다른 pH를 갖는 완충용액을 사용하여 SOD 활성을 측정한 결과, pH 7.0에서 가장 높은 활성을 보인 반면, pH 6.0 이하에서는 활성이 거의 나타나지 않았으며 pH 8.0 이상에서도 그 활성이 급격하게 감소함을 알 수 있었으므로 매우 좁은 최적 pH 범위를 가졌다고 볼 수 있다(결과 미제시).
- 정제한 SOD의 분자량은 SDS-PAGE, MALDI-TOF, Superose- 12 gel filtration 크로마토그래피를 실시하여 분자량을 측정한 결과 SOD Ⅲ는 2개 이상으로 이루어진 복합체라는 것을 알 수 있었다. Fe-SOD인 경우에는 40 kDa 크기의 dimer나 90 kDa 크기의 tetramer들로 주로 이루어져 있는데 Desulfovibrio gigas의경우 22 kDa으로 이루어진 homodimei이며, Ni-SOD인 Streptomyces coelicolor의 경우에는 13.
- KS 301 은 최소한 서로 다른 다섯 가지의 SOD들을 가지는 것으로 사료된다. 즉, Solution assay 상에서의 가장 활성이 높은 분획은 gel overlay assay상에서 가장 굵은 활성 띠로 나타났으며 또한 SDS-PAGE와 비교하였을 경우에도 서로 다른 크기의 SOD 단백질 활성 띠를 발견할 수 있었다. 측정 결과 발견한 다섯 가지의 활성들을 SOD I, Ⅱ, Ⅲ, IV, V라고 명명하고 각각 정제 과정에 이용하였다(Fig.
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