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문제 정의
- 학교 음용수는 면역성이 약한 성장기 학생들에게 제공되므로 음용수의 공급시설이 열악하거나 관리상태가 비위생적이면 수질이 저하되고 학생들에게 질병을 일으킬 수 있다(16). 따라서 본 연구에서는 정수기의 관리상태를 조사하기 위해 전라북도 군산지역의 초등학교에서 음용수로 사용되고 있는 정수기 물을 대상으로 종속영양세균과 총대장균군, 그리고 병원성 세균의 균체수를 계수하였고, 출현미생물을 동정하였다. 이러한 연구는 향후 정수기 물의 관리에 필요한 기초자료로 사용되길 기대한다.
제안 방법
- 16S rDNA 염기서열을 분석하기 위해 증폭된 PCR 산물은 전기영동한 후, Gel Extraction kit (Bioneer, Korea)를 이용하여 정제하였다. 유전자 서열 분석은 miDNA 유전체 연구소(Korea) Bigdye 3.
- 총 대장균군(total coliform)의 측정은 PetriFilm™ Coliform Count Plate (3M, USA)를 동일 시료에 대해 3회 사용하여 평균을 사용하였고, 최확수법(MPN)을 병행 하였다. MPN법은 Lactose broth (Difco, USA)를 이용하였으며 추정시험과 확정시험, 그리고 완전시험을 거쳐 최종 확정하였다.
- PCR 증폭은 thermal cycler GenAmp PCR system 9700 (Applied Biosystems, USA)를 사용하여 수행하였다. PCR 증폭 과정은 predenaturation 과정으로 94℃에서 10분간 수행하였고, 94℃에서 30초간 denaturation, 55℃에서 30초간 primer annealing, 72℃에서 75초 extension을 총 30회 반복하고, 72℃에서 7분간 최종 반응시켰다. 증폭된 PCR 산물은 0.
- 0) 5 µl, 250 mM MgCl2 4 µl, 10 mM dNTP 1 µl, 10 pmol primer 5 µl, 그리고 1 Unit의 Taq polymerase (TaKaRa, Japan)를 넣은 후, 여기에 20 ng의 template DNA를 첨가하고 ddH2O로 최종 반응량을 50 µl로 맞추었다. PCR 증폭은 thermal cycler GenAmp PCR system 9700 (Applied Biosystems, USA)를 사용하여 수행하였다. PCR 증폭 과정은 predenaturation 과정으로 94℃에서 10분간 수행하였고, 94℃에서 30초간 denaturation, 55℃에서 30초간 primer annealing, 72℃에서 75초 extension을 총 30회 반복하고, 72℃에서 7분간 최종 반응시켰다.
- 종속영양세균의 측정 종속영양세균의 측정은 현장에서 멸균된 채수병에 넣어 4℃를 유지하여 운반한 시료를 R2A agar (Difco, USA)에 도말하여 21℃에서 5일간 배양하여 나타난 균체수를 계수하였다. R2A agar는 빈영양상태의 배지로 음용수의 종속영양세균 측정에 용이하므로(1) 본 연구에서는 종속영양세균을 측정하는 주배지로 삼아 실험을 실시하였다. 이때 미생물 측정 단위는 colony-forming units (CFUs)로 측정하였다.
- 본 연구는 전북 군산시의 초등학교 중 정수기 물을 음용수로 사용하는 학교 10개교를 임의 추출하여 본 연구를 수행하였다. 각 대상학교에 설치된 정수기 중 사용빈도가 높은 정수기를 2대씩 선정하여 총 20개의 정수기 물과 이들 정수기의 원수가 되는 수돗물 10개를 2007년 7월부터 12월까지 총 5차례 채수하였다. 시료는 물을 약 1분간 흘려보낸 후 멸균된 500 ml 용기에 채수한 후 4℃로 냉장 보관한 상태로 실험실로 운반하여 곧바로 실험을 실시하였다.
- 병원성 장내세균인 Salmonella와 Shigella의 존재유무를 알아보기 위하여 Bismuth sulfite agar (Difco, USA)와 Xylose lysine desoxycholate agar (Difco, USA)에 시료를 도말하여 35℃에서 24시간 배양하였다.
- 1 (Applied Biosystems, USA)의 염기서열 결정방법으로 ABI PRISM 3130 XL Genetic Analyzer (Applied Biosystems, USA)을 이용하여 수행하였으며, 유전자 서열 분석을 위한 primer로는 27F, 1492R을 이용하여 양쪽 방향 모두 염기서열 해독을 실시하였다. 세균들의 16S rDNA의 부분 염기서열을 Blast network service를 이용하여 EMBL/GenBank database의 염기서열을 비교하여 속명을 확정하고(17), BioEdit (version 7.0.5.3)을 이용하여 Ribosomal Database Project (RDP) II database의 표준 균주의 염기서열과 비교함으로써 계통분류학적 유연관계를 분석하였다. 각각의 16S rDNA의 부분 염기서열의 배열은 BioEdit (version 7.
- 세균의 16S rDNA를 증폭하기 위하여 universal primer인 27F 와 1492R을 사용하여(18) PCR을 수행하였다. PCR 조건은 10× PCR buffer (50 mM KCl, 0.
- 각 대상학교에 설치된 정수기 중 사용빈도가 높은 정수기를 2대씩 선정하여 총 20개의 정수기 물과 이들 정수기의 원수가 되는 수돗물 10개를 2007년 7월부터 12월까지 총 5차례 채수하였다. 시료는 물을 약 1분간 흘려보낸 후 멸균된 500 ml 용기에 채수한 후 4℃로 냉장 보관한 상태로 실험실로 운반하여 곧바로 실험을 실시하였다.
- 16S rDNA 염기서열을 분석하기 위해 증폭된 PCR 산물은 전기영동한 후, Gel Extraction kit (Bioneer, Korea)를 이용하여 정제하였다. 유전자 서열 분석은 miDNA 유전체 연구소(Korea) Bigdye 3.1 (Applied Biosystems, USA)의 염기서열 결정방법으로 ABI PRISM 3130 XL Genetic Analyzer (Applied Biosystems, USA)을 이용하여 수행하였으며, 유전자 서열 분석을 위한 primer로는 27F, 1492R을 이용하여 양쪽 방향 모두 염기서열 해독을 실시하였다. 세균들의 16S rDNA의 부분 염기서열을 Blast network service를 이용하여 EMBL/GenBank database의 염기서열을 비교하여 속명을 확정하고(17), BioEdit (version 7.
- R2A agar는 빈영양상태의 배지로 음용수의 종속영양세균 측정에 용이하므로(1) 본 연구에서는 종속영양세균을 측정하는 주배지로 삼아 실험을 실시하였다. 이때 미생물 측정 단위는 colony-forming units (CFUs)로 측정하였다.
- 종속영양세균의 측정 종속영양세균의 측정은 현장에서 멸균된 채수병에 넣어 4℃를 유지하여 운반한 시료를 R2A agar (Difco, USA)에 도말하여 21℃에서 5일간 배양하여 나타난 균체수를 계수하였다. R2A agar는 빈영양상태의 배지로 음용수의 종속영양세균 측정에 용이하므로(1) 본 연구에서는 종속영양세균을 측정하는 주배지로 삼아 실험을 실시하였다.
- 증폭된 PCR 산물은 0.7% agarose gel (SeaKem®LE, TaKaRa)에서 전기영동 한 후 ethidium bromide (0.5 µg/ml) 용액에 5분간 염색한 후 UV 분광광도계 Gel Doc XR system (Bio-Rad, USA)을 이용하여 260 nm 파장에서 약 1.5 kb에 해당하는 DNA 밴드를 확인하였다(21).
대상 데이터
- 본 연구는 전북 군산시의 초등학교 중 정수기 물을 음용수로 사용하는 학교 10개교를 임의 추출하여 본 연구를 수행하였다. 각 대상학교에 설치된 정수기 중 사용빈도가 높은 정수기를 2대씩 선정하여 총 20개의 정수기 물과 이들 정수기의 원수가 되는 수돗물 10개를 2007년 7월부터 12월까지 총 5차례 채수하였다.
이론/모형
- 3)을 이용하여 Ribosomal Database Project (RDP) II database의 표준 균주의 염기서열과 비교함으로써 계통분류학적 유연관계를 분석하였다. 각각의 16S rDNA의 부분 염기서열의 배열은 BioEdit (version 7.0.5.3)를 사용하여 결정하였다. 계통수(phylogenetic tree)는 neighbor-joining method를 이용하는 프로그램인 MEGA 4 (version 4.
- 3)를 사용하여 결정하였다. 계통수(phylogenetic tree)는 neighbor-joining method를 이용하는 프로그램인 MEGA 4 (version 4.0.1)를 사용하여 작성하였다(20). 본 연구에서 동정된 균주는 GenBank에 EU730903, EU730905~EU730912, EU730914~EU730933, EU730935~EU730947로 등록되었다.
- 총 대장균군(total coliform)의 측정은 PetriFilm™ Coliform Count Plate (3M, USA)를 동일 시료에 대해 3회 사용하여 평균을 사용하였고, 최확수법(MPN)을 병행 하였다.
성능/효과
- A, B, D, E, F학교의 수돗물에서는 종속영양세균이 검출되지 않은 반면, 정수기 통과 후 최소 8.0±4.4×10 CFU/ml에서 최대 3.4±0.1×103 CFU/ml까지 증가된 결과를 나타냈다.
- B학교와 F학교의 수돗물은 종속영양세균이 검출되지 않았으나 정수기 통과 후 현저히 많은 종속영양세균이 검출되었는데 특히 B학교의 정수기 물은 9.4±2.8×102 CFU/ml (B1)과 3.3±0.6×103 CFU/ml (B-2)의 결과를 나타냈다.
- 검사기간 중 채수된 정수기 물에서 세균을 분리하여 분자생물학적인 방법으로 동정한 결과, Alphaproteobacteria group 17종, Betaproteobacteria group 6 종, Gamaproteobacteria group 3 종, Firmicutes group 7 종, Actinobacteria 6 종, Bacteroidetes 2종, Sphingobacteria 1종으로 나타났다(Table 1).
- 한편, Firmicutes group에 속하는 균주로는 Bacillus, Staphylococcus, Brevibacillus가 동정되었고, Actinobacteria group에 속하는 균주로는 Microbacterium, Lapillicoccus, Micrococcus, Arthrobacter, Janibacter가 동정되었다. 또한 Bacteroidetes group에 속하는 균주로는 Flavobacterium, Chryseobacterium가 동정되었고, Sphingobacteria group에 속하는 균주로는 Hymenobacter가 동정되는 등 총 26개 속에 속하는 세균들이 동정되었다(Fig. 2).
- 1)를 사용하여 작성하였다(20). 본 연구에서 동정된 균주는 GenBank에 EU730903, EU730905~EU730912, EU730914~EU730933, EU730935~EU730947로 등록되었다.
- 본 연구에서 정수기와 수돗물에서 조사기간 중 병원성 세균은 검출되지 않았다. 그리고 검출된 세균의 대부분은 일반 환경에 다량 존재하는 미생물로서 병원성을 나타내지 않는다.
- 또한 노후한 급 · 배수관의 사용으로 미생물의 증식 가능성과 기타 중금속의 용출 등으로 인한 수질변화 가능성이 있다(5). 실험 결과, 정수기 인입수인 수돗물의 종속영양세균수 초과율 또한 높은 것을 알 수 있는데 우리나라 상수도의 정수과정에서의 세균 제거효율은 대장균군에 대해서는 100%, 종속영양세균의 경우 96%, 총세균수에 있어서는 77% 정도로서 소독공정에 의하여 제거되지 않는 세균이 많은 것으로 알려져 있다. 또한 박 등(6)의 연구에 의하면, 정수 처리된 물이 배급수 계통에서는 최대 110배의 종속영양세균수 증가를 보였고, 정수에서는 검출되지 않던 장내세균이 배급수 계통에서는 비교적 많은 수가 검출됨을 보고했으며 이는 배급수관 내부에서 소독에 의해 손상되었던 손상세균이 재생장한 결과라 밝히고 있다.
- 따라서 정수기 내의 종속영양세균 발생 정도에 미치는 계절변화의 영향은 미미한 것으로 보이며, 이것은 이(12)와 김 등(4)의 연구와도 일치하는 결과이다. 실험 기간 중 정수기에서 검출된 종속영양세균수와 그 원수인 수돗물의 종속영양세균수를 비교하여 보면, 수돗물에서의 종속영양세균수보다 정수기 물에서 현저히 높은 결과가 나왔다. 특히 B학교와 F학교 및 J학교의 경우에서 보면 실험 기간 동안 수돗물에서는 검출세균이 없거나 적게 검출되었으나 정수기 물에서는 종속영양세균이 다량 검출되는 양상을 볼 수 있었다.
- 조사기간 중 PetriFilm™ Coliform Count Plate (3M, USA)와 MPN 실험법으로 대장균군을 조사하였으나 모든 학교 정수기 물에서 검출되지 않았다. 장내 병원성균인 Salmonella 속, Shigella 속의 균들을 검출하기 위한 선택배지로 사용된 Bismuth sulfite agar (Difco, USA)와 Xylose lysine desoxycholate agar (Difco, USA)를 사용하여 배양한 결과 모든 학교의 정수기 물에서 해당 균이 검출되지 않았다.
- 출현 속을 살펴보면, Alphaproteobacteria group에 속하는 균주로는 Sphingomonas, Methylobacterium, Caulobacter, Novosphingobium, Bosea, Brevundimonas, Aminobacter가 동정되었고, Betaproteobacteria group에 속하는 균주로는 Ralstonia, Mitsuaria, Variovorax, Acidovorax, Massilia가 동정되었으며, Gamaproteobacteria group에 속하는 균주로는 Pseudomonas, Acinetobacter, Aeromonas가 동정되었다. 한편, Firmicutes group에 속하는 균주로는 Bacillus, Staphylococcus, Brevibacillus가 동정되었고, Actinobacteria group에 속하는 균주로는 Microbacterium, Lapillicoccus, Micrococcus, Arthrobacter, Janibacter가 동정되었다.
- 출현 속을 살펴보면, Alphaproteobacteria group에 속하는 균주로는 Sphingomonas, Methylobacterium, Caulobacter, Novosphingobium, Bosea, Brevundimonas, Aminobacter가 동정되었고, Betaproteobacteria group에 속하는 균주로는 Ralstonia, Mitsuaria, Variovorax, Acidovorax, Massilia가 동정되었으며, Gamaproteobacteria group에 속하는 균주로는 Pseudomonas, Acinetobacter, Aeromonas가 동정되었다. 한편, Firmicutes group에 속하는 균주로는 Bacillus, Staphylococcus, Brevibacillus가 동정되었고, Actinobacteria group에 속하는 균주로는 Microbacterium, Lapillicoccus, Micrococcus, Arthrobacter, Janibacter가 동정되었다. 또한 Bacteroidetes group에 속하는 균주로는 Flavobacterium, Chryseobacterium가 동정되었고, Sphingobacteria group에 속하는 균주로는 Hymenobacter가 동정되는 등 총 26개 속에 속하는 세균들이 동정되었다(Fig.
후속연구
- 그러므로 일선 학교에서는 저수조 사용을 지양하고 직결 급수를 사용토록 해야 하며 노후 된 급 · 배수관의 교체와 함께 적절한 정수기종의 선택 및 정수기 여과기의 교체가 각 정수기마다 그 사용여건에 맞게 적절한 시기에 이루어져야 한다. 또한 정수기내의 청소방법 및 안전한 사용법 지도 등 위생관리를 위한 노력이 이루어져야 하고, 끓인 음용수 공급 등의 보다 안전한 음용수의 급수를 위한 대안을 강구하여야 할 것이다.
- 따라서 본 연구에서는 정수기의 관리상태를 조사하기 위해 전라북도 군산지역의 초등학교에서 음용수로 사용되고 있는 정수기 물을 대상으로 종속영양세균과 총대장균군, 그리고 병원성 세균의 균체수를 계수하였고, 출현미생물을 동정하였다. 이러한 연구는 향후 정수기 물의 관리에 필요한 기초자료로 사용되길 기대한다.
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