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문제 정의
- , 1998). 본 연구에서는 해조류의 photosensitizer 물질을 이용한 적조방제 연구의 일환으로서 우선 해조류 추출물에 빛 (장파장 자외선 및 가시광선)을 조사하여 그 활성이 나타나는 새로운 항 적조물질들을 탐색하고자 한다.
- 항 적조물질은 해양이라는 공간에 살포되어지므로 빛에 대한 안정성 또한 중요한 요소이며, 이 물질들이 빛에 의하여 그 활성이 증가되어지면더욱 효과적이다. 따라서 적조방제를 위한 물질로서의 photosensitizer 물질 탐색은 새로운 유용 활성물질을 찾을 가능성이 높으며, 본 연구에서 항 적조활성 효과가 가장 높게 나타난 감태와 방사무늬김에 대한 연구가 더 진행되어 새로운 활성 물질을 찾고자 한다.
제안 방법
- 메탄올 추출물과 물추출물로 나누어 광 (photo)을 처리한 후 적조생물증식에 미치는 영향을 조사하였다. 우선 해조류들을 채집하여 분류한 뒤 수돗물로 세척한 후 2-3일간 충분히 응달에서 말린 후 분쇄하였다.
- 이때 사용된 항생물질은 Table 1의 실험과 같이 각종 항생물질들의 농도별로 적조생물의 생육도를 조사하여 정상적인 생육에 영향을 미치지 않은 농도들을 조사한 후 이들의 혼합항생물질 즉 Ampicillin (1, 560“g/mL) + Nystatin (6, 250“g/ mL) + Neomycin (1, 560“g/mL) + Kanamycin (6, 250 /zg/mL) 으로 구성하였다. 생육에 영향을 미치지 않은 각각의 항생제를 혼합하였을 경우 개별적인 항생제농도보다는 다소 낮은 농도에서 생육에 영향을 미치지 않았다 (data not shown).
- polykrikoides에 아무런 영향을 주지 않은 2% 이하로 조정하여 사용하였다 (data not shown). 적조생물에 대한 활성은 상대성장비 (Relative growth rate)로 나타내었으며, 상대성장비는 빛에 노출시킨 추출물을 포함한 배지에 배양된 세포수를 빛에 노출시키지 않은 추출물을 포함한 배지에 배양된 세포수로 나누어 계산하였으며, 5회 반복실험을 실시하였다.
- 장파장 자외 선 (365 nm; Spectroline ENF-24, NY, USA) 과가시광선 (coolwhite, TL-D super80, Philips)에 의한 해조류 주출물의 C. polykrikoides에 대한 활성변화는 3가지 방법으로 나누어 조사하였다. 제 1 방법: 96 well-plate의 각 well 당해 조류 주줄물 (40 mg/mL) 1 “L와 적조생물 (5, 000 cells/mL) 을 넣고 최종부피가 200“L되게 PES 배지로 조정한 후 자외선, 가시광선, 자외선+가시광선을 각각 4 Kjoule이 되도록 노출하였다.
- polykrikoides에 대한 활성변화는 3가지 방법으로 나누어 조사하였다. 제 1 방법: 96 well-plate의 각 well 당해 조류 주줄물 (40 mg/mL) 1 “L와 적조생물 (5, 000 cells/mL) 을 넣고 최종부피가 200“L되게 PES 배지로 조정한 후 자외선, 가시광선, 자외선+가시광선을 각각 4 Kjoule이 되도록 노출하였다. 제 2 방법 : 해조류 추출물 (40mg/mL) 1 "L 와 PES 배지를 96 well-plate에 넣은 毛 자외선, 가시광선, 자외선+가시광선을 각각 4 KJoule。] 되도록 노출한 다음, 적조생물 (5, 000 cells/mL)을 접종하고 최종 부피가 200 “L가 되 게 하였다.
- 제 2 방법 : 해조류 추출물 (40mg/mL) 1 "L 와 PES 배지를 96 well-plate에 넣은 毛 자외선, 가시광선, 자외선+가시광선을 각각 4 KJoule。] 되도록 노출한 다음, 적조생물 (5, 000 cells/mL)을 접종하고 최종 부피가 200 “L가 되 게 하였다. 제 3 방법: 자외선 및 가시광선에 의하여 활성이 증가된 해조류들만을 대상으로하여 그 추출물 (40 mg/mL) 1 와 PES배지를 96 well-plate에 넣은 후, 자외선, 가시광선을 각각 4 Kjoule이 되도록 노출한 다음, 암흑의 상태에서 0, 1, 3, 5시간을 방치한 후, 적조생물 (5, 000cells/mL)을 접종하여 최종부피가 200 “L가 되게 하였다.
대상 데이터
- 한국 연안에 대량으로 서식하는 해조류들을 대상으로 녹조류 4종 [청각 (G泌fragile), 잎파래 (Enteromorpha linza), 홑파래 (Monostroma nitidum), 구멍 갈파래 (Ulva pertusa)], 갈조류 14종 [긴불레기말 (CoZpom两a bullosa), 불레기말 (C. sinuosa), 감태 (EcHom'a cava), 미 역 쇠 (E〃darac/me binghamiae), 톳 (Hizikia fusiformis), 넓 패 (Ishige sinicold), 다시마 (Laminaria japonica), 개 다시 마 (Kjellmaniella crassifolia), 알송이모자반 (Sargassum confusum), 괭생 이모자반 (S. homeri), 비 틀대모자반 (S. sagamianuni), 지중이 (S. thunbergii), 고리 매 {Scytosiphon lomentaria), 미 역 (Undaria pinnatifida)] 과 홍조류 10종 [까막살 {Carpopeltis affinis), 진두발 (Chondrus ocellatus), 작은구슬산호말 pilulifera), 애 기 돌가사리 (Gigartina intermedia), 개 지누아리 (firateloupia prolongata), 미 끌도박 (G. turuturu), 가시 우무 (Hypnea charoides), 도박 (Pachymeniopsis ellipticd), 방사무늬 김 (Porphyra yezonensis), 보라우무 latiuscula)、을 실험대상으로 하였다.
- 22“m로 여과하여 사용전까지 -20°C 에서 보관하였다. 메탄올추출물과 물추출물은 살균된 자연 해수에 희석하여 본 실험에 사용하였다.
- 적조생 물로서 의 Cochlodinium polykrikoides는 국립 수산과학원에서 분양받았고, 항생물질이 포함된 Provasoli's enriched seawater배지 (PES, Provasoli, 1968)에 무균적으로 배양하였다. 이때 사용된 항생물질은 Table 1의 실험과 같이 각종 항생물질들의 농도별로 적조생물의 생육도를 조사하여 정상적인 생육에 영향을 미치지 않은 농도들을 조사한 후 이들의 혼합항생물질 즉 Ampicillin (1, 560“g/mL) + Nystatin (6, 250“g/ mL) + Neomycin (1, 560“g/mL) + Kanamycin (6, 250 /zg/mL) 으로 구성하였다.
데이터처리
- 실험결과는 one-way ANOVA test를 실시한 후 Duncan"s multiple range test를 실시하여 평균 간의 유의성 (p < 0.05)을 SPSS program (Ver. 10.1)으로 검정하였다.
이론/모형
- 우선 해조류들을 채집하여 분류한 뒤 수돗물로 세척한 후 2-3일간 충분히 응달에서 말린 후 분쇄하였다. 해조류 추출물은 Jin et al. (1997)의 방법을 이용하여 메탄올 추출물은 메탄올 1L 당해 조류 분말 20 g를 빛이 차단된 곳에서 하루동안 추출하고 3회 반복하였다. 37P에서 메탄올을 증발 제거시킨 추출물 40 g당 메탄올 1 L 비율로 녹인 후 0.
성능/효과
- 빛 노출의 3가지 방법으로 해조류추출물에 빛을 주었을 때 적조생물에 대한 사멸효과를 조사한 결과, 제 1방법 (Table 2)인 해조류추출물과 적조생물을 동시에 자외선, 가시광선, 자외선+가시광선을 각각 노출하였을 때, 각종 해조류의 물 추출물 경우에는 빛에 의한 활성 변화가 없었다. 하지만, 메탄올 추출물의 경우에는 빛에 대한 영향으로 녹조류의 경우에는 청각, 잎파래, 홑파래에 빛을 주지 않은 경우 보다 빛 (가시광선)에 노출되었을 경우에 2배정도의 활성이 증가되었다.
- 경우에는 빛에 의한 활성 변화가 없었다. 하지만, 메탄올 추출물의 경우에는 빛에 대한 영향으로 녹조류의 경우에는 청각, 잎파래, 홑파래에 빛을 주지 않은 경우 보다 빛 (가시광선)에 노출되었을 경우에 2배정도의 활성이 증가되었다. 갈조류의 경우 긴불레기말에 자외선을 노출되었을 경우에 2배의 효과증가가 있었으며, 가시광선에는 별 효과가 없었다.
- 하지만, 메탄올 추출물의 경우에는 빛에 대한 영향으로 녹조류의 경우에는 청각, 잎파래, 홑파래에 빛을 주지 않은 경우 보다 빛 (가시광선)에 노출되었을 경우에 2배정도의 활성이 증가되었다. 갈조류의 경우 긴불레기말에 자외선을 노출되었을 경우에 2배의 효과증가가 있었으며, 가시광선에는 별 효과가 없었다. 불레기말는 자외선+가시광선에 노출되었을 때 약 2.
- 알송이모자반은 가시광선에서 2배 증가하였으며, 괭생이 모자반는 자외선+가시광선에 동시 노출되었을 경우에 2배 증가하였다. 비틀대모자반, 지충이 및 고리매는 가시광선에서 모두 2배의 활성이 증가하였다. 나머지 갈조류는 빛에 대한효과가 없었고, 미역쇠는 빛에 관계없이 적조생물에 대하여 강한 살조효과를 나타내었다.
- 홍조류의 경우 까막살은 가시광선에 의해서 약 3배, 애기돌가사리는 자외선, 가시광선 모두 2배의 활성이 증가되었다. 미끌도박, 도박는 가시광선에서 약 3배의 활성이 증가하였으며, 방사무늬김의 경우에도 가시광선에 의해서 5배의 활성이 증가하였다. 작은구슬산호말 은빛과는 관계없이 적조생물에 대하여 아주 강한 살조효과를나타내었다.
- 괭생이모자반은 자외선, 가시광선에 노출 후 2배 정도 활성이 증가되었다. 하지만 그 외의 갈조류와 홍조류의 경우에는 대체적으로 적조생물을 접종한 후 빛에 노출하는 것보다 활성이 감소하는 것으로 나타났다. 미끌도박은 빛에 노출하고 적조생물을 접종했을 경우가 적조생물을 접종하고 빛에 노출했을 경우보다 가시광선에서 7배정도의 활성이 감소하였다.
- 제 3방법인 자외선에 의하여 활성이 증가된 해조류들만을 대상으로 하여, 해조류 추출물을 자외선에 노출한 다음, 암흑의 상태에서 5시간동안 방치한 후 적조생물을 접종한 결과 (Table 4), 녹조류 청각의 경우 2배정도 활성이 증가되었으며자외선에 처리 후 암흑에 3시간동안 방치할 동안 활성이 점점 증가했지만 5시간 후에는 활성이 감소하였다. 홑파래 또한 자외선에 의하여 활성이 증가했지만, 암흑에 1시간 방치한 후 적조생물을 접종했을 경우에는 빛을 처리하고 바로 적조생물을 접종한 것보다 3배정도 강한 활성을 띄었다.
- 5시간 후에는 활성이 감소하였다. 홑파래 또한 자외선에 의하여 활성이 증가했지만, 암흑에 1시간 방치한 후 적조생물을 접종했을 경우에는 빛을 처리하고 바로 적조생물을 접종한 것보다 3배정도 강한 활성을 띄었다. 그러나 암흑에 1시간이상 방치했을 경우는 활성이 점점 감소했다.
- 그러나 암흑에 1시간이상 방치했을 경우는 활성이 점점 감소했다. 갈조류인 감태는 자외선에 노출했을 때가 노출하지 않을 때보다 적조생물에 대한 활성이 감소했지만, 노출 후 암흑에 3-5시간 방치 한 결과 10배정도 활성이 증가하여 작은구슬산호말 과거의 같은 활성을 가지는 것으로 나타났다. 넓패의 경우 자외선에 노출한 것과 하지 않은 것은 활성에 대한 변화가 없었지만 암흑에 1-5시간 방치 한 후에는 2-3배 더 강한 활성을 보였다.
- 홍조류인 작은구슬산호말는 자외선에 노출한 경우 다소 활성이 감소하는 것으로 나타났으며, 암흑에 방치했을 경우에도 3-4배 정도의 활성이 더 감소했다. 그리고, 해조류 추출물을 가시광선에 노출한 다음, 암흑의 상태에서 5시간동안 방치한 후 적조생물을 접종한 결과(Table 5), 녹조류인 홑파래에 빛 처리 후, 암흑에 1시간 방치 후 약 2배의 활성이 증가하였고, 암흑에 두는 시간이 지남에 따라 점점 활성은 감소했다. 갈조류인 감태의 경우도 암흑에 1시간 방치 한 후 2배정도의 강한 활성을 나타냈!;-.
- 물질들만을 분리하였다. 하지만, 고등식물의 경우 빛에 의해서 항바이러스의 활성 등이 증가되는 물질들이 많이 보고 (Hudson and Towers, 1991) 된 바와 같이, 본 연구에서도 해조류 추출물에 함유된 잠재적인 활성물질을 탐색하기 위하여 자외선 및 가시광선을 조사한 바, 본 연구에서 사용한 해조류으 약 30%정도에서 적조생물에 대하여 2-5배 정도 잠재적인 활성이 증가한 것으로 나타났으며, 감태 경우 자외선 노출 후 암흑에 3-5시간 방치 한 결과 최대 10배 정도 잠재적 활성이 증가하였다. 이는 Hudson et al.
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