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문제 정의
- 본 연구에서는 microsatellite Poli9-8TUF marker의 검증을 위해 특정 line 혹은 가계가 아닌 일반 양식장에서 사육되는 임의의 개체들을 대상으로 유전자 마커와 LCDV 내성 형질과의 linkage disequilibrium을 조사하였다. 한편 QTL 연구에 있어서의 핵심은 marker와 형질 유전자와의 상대적 거리가 가깝게 위치해 있는 markei■를 찾아야 recombination 확률을 줄일 수 있어 임의의 집단이나 가계에서도 maHsr로서 활용할 수 있어 marker assisted selection (MAS) 육종을 가능하게 한다.
제안 방법
- Microsatellite DNA의 di-nucleotide repeat에 따른 다형 (polymorphism)으로 다양한 genotype pattern이 조사되며 이들 분석을 위해 ABI 3100 sequencer에서 GeneScan Size standard marker 400HD ROX를 이용하여 GeneScan 및 Genotyper software0]] 의해 각 marker에서의 allele size를 결정하여 개체의 genotype을 분석하였다.
- 넙치 LCDV 질병관련 유전자에 의한 감염개체 진단 넙치 체표 및 지느러미 부위의 종양 조직으로부터 LCDV를 순수 분리하고 바이러스 DNA를 증폭시켜 LCDV 전체 염기 서열 해석을 통해 기존의 LCDV 유전체와 비교하였다. 그 중 질병관련 유전자 정보 분석 및 확보를 위해 유전자 선별을 생물정보학적 방법을 이용한 annotation을 수행하였고 최종적으로 질병관련 유전자 리스트를 확보하였다. 선정된 질병관련 유전자 중 NIF/NLI interacting factor 유전자를 선택하여 LCDV를 신속하게 진단할 수 있는 유전자 marker로 채택하여 넙치가 LCDV에 감염되었는지 여부를 조사하였다.
- , 1996)에 의해 분리하였다. 넙치 LCDV 질병관련 유전자에 의한 감염개체 진단 넙치 체표 및 지느러미 부위의 종양 조직으로부터 LCDV를 순수 분리하고 바이러스 DNA를 증폭시켜 LCDV 전체 염기 서열 해석을 통해 기존의 LCDV 유전체와 비교하였다. 그 중 질병관련 유전자 정보 분석 및 확보를 위해 유전자 선별을 생물정보학적 방법을 이용한 annotation을 수행하였고 최종적으로 질병관련 유전자 리스트를 확보하였다.
- 1% (총 457마리 중 19마리)에 해당하는 개체들만 LCDV-fire로 판별이 됨으로보아 수평 감염 경로를 갖고 있을 가능성을 시사한다. 넙치 LCDV-내성 후보 유전자 marker의 genotyping 질병내성 유전자 마커를 확인하기 위해 microsatellite DNA marker Polil21TUF, Poli9-8TUF, Polil30TUF를 대상으로 genotyping을 실시하여 LCDV-내성 및 LCDV-발병 집단으로 나누어 allele frequency를 비 교하였다 (Fig. 2). 유전자 marker.
- (2006)는 LCDV-내성 관련 QTL이 linkage group 15 에 존재함을 보고하였다. 본 연구에서는 linkage group 15에 있는 두 개의 marker (Polil21TUF와 Poli9-8TUF)와 그외 다른 연관 군에 있는 임의의 MS marker Polil30TUF를 선택하여 각각의 marker와 LCDV 병 어군과 LCDV 정상군으로 구분된 random 집단에서의 개체들을 genotyping 에 의한 allele Hquency를 조사하였고 두 집단의 유전적 차이는 GENEPOP (Raymond and Rousset 1995) 프로그램을 사용하여 유 의성 검증을 하였다.
- 그 중 질병관련 유전자 정보 분석 및 확보를 위해 유전자 선별을 생물정보학적 방법을 이용한 annotation을 수행하였고 최종적으로 질병관련 유전자 리스트를 확보하였다. 선정된 질병관련 유전자 중 NIF/NLI interacting factor 유전자를 선택하여 LCDV를 신속하게 진단할 수 있는 유전자 marker로 채택하여 넙치가 LCDV에 감염되었는지 여부를 조사하였다. 선정된 NIF/NLI interacting factor 유전자 sequence는 forward primer 5'-gATTCg CCATCAAAAggTTg-3'와 reverse primer 5, -TgTCATCAACgATgCTTTgC-3, 으로 0.
- 즉, 목적 형질 유전자와 근접해 있는 유전자 marker를 찾는 것이 관건이 된다. 이미 밝혀 진 Poli9-8TUF marker와 LCDV-내성 형질과의 상대적 유전거리는 14.7cM으로 형질을 관여하는 목적 유전자와 Poli9-8TUF 유전자 marker와는 상당한 거리가 있음에 착안하여 같은 linkage group에 있는 다른 유전자 마커 Polil21TUF 및 전혀 관련이 없는 임의의 유전자 마커 PO1H30TUF를 대상으로 LCDV 감염 및 발병 집단과 정상 집단에서 유전자형 분포를 비교하여 형질과 연관성 있는 유전자 marker를 조사하였다.
대상 데이터
- 실험에 사용한 넙치는 우리나라 양어장 7군데에서 LD 병어 및 정상어의 지느러미를 샘플하여 알코올에 보관하여 실험에 사용하였다. 체표나 지느러미 등에 LC가 형성되어 있는 넙치를 병어로, 외관상 환부를 형성하지 않는 넙치를 정상 어로 간주하여 샘플하였다 (Table 1).
이론/모형
- 체표나 지느러미 등에 LC가 형성되어 있는 넙치를 병어로, 외관상 환부를 형성하지 않는 넙치를 정상 어로 간주하여 샘플하였다 (Table 1). 샘플된 지느러 미 는 genomic DNA 추출을 위하여 TNES-urea buffer에 저장한 후 Pro-K 및 phenol 추출법 (Asahida et al., 1996)에 의해 분리하였다. 넙치 LCDV 질병관련 유전자에 의한 감염개체 진단 넙치 체표 및 지느러미 부위의 종양 조직으로부터 LCDV를 순수 분리하고 바이러스 DNA를 증폭시켜 LCDV 전체 염기 서열 해석을 통해 기존의 LCDV 유전체와 비교하였다.
성능/효과
- 이와 같은 결과는 선정된 질병관련 유전자는 넙치에는 존재하지 않고 LCDV에만 존재하는 유전자임을 알 수 있었으며 바이러스 DNA에는 넙치 유전자의 오염은 없는 것으로 확인되었다. LCDV가 발병한 양식장의 넙치인 경우 육안으로 발병된 개체들 뿐 만아니라 발병개체와 동일 수계에 있는 정상 개체인 경우도 207마리 중 188마리에서 LCDV 유전자가 검출되었다 (Table 1). 이들 결과는 외관상 정상개체이지만 바이러스에 상당수가 감염되었을 것으로 예상되며 일차적으로 LCDV-free 개체 선별을 위해 NIF/NLI interacting factor 유전자를 이용할 수 있다.
- Poli9-8TUF인 경우 7개의 allele이 존재하고 있었고 두 집단간 allele frequecny는 비슷하였으며 Polil30TUF 인 경우는 12개의 allele로 분포되면서 두 집단의 차이는 볼 수 없었다. 그러나 Polil21TUF 인 경우 존재하고 있는 17개의 allele 중 113 allele 이 특이적으로 LCDV-내성 집단에 높은 빈도로 존재하고 있었으며 (p<0.0001) 두 집단을 유의적으로 분리할 수 있었다. 넙치 집단의 유전적 다양성 분석에 의하면 Polil21TUF locus에서의 allele 빈도를 조사한 보고에 의하면 113 allele 빈도인 경우 넙치 자연집단인 경우 0.
- 또한 자연수계에서는 LCDV 질병이 발견되지 않음에 착안하여 자연산 넙치의 genomic DNA를 이용하여 분석한 결과 LCDV 바이 러스 유전자가 전혀 존재하지 않았다. 이와 같은 결과는 선정된 질병관련 유전자는 넙치에는 존재하지 않고 LCDV에만 존재하는 유전자임을 알 수 있었으며 바이러스 DNA에는 넙치 유전자의 오염은 없는 것으로 확인되었다.
- Fuji 등에 의해 보고된 Poli9-8TUF locus에서 표현형 변이의 50%를 차지하여 LCDV 내성 형질을 단독으로 지배한다고 했다. 본 연구 결과에서는 LCDV-내성과 관련된 유전자는 Polil21TUF와 더 가까운 위치에 있을 것으로 예상되었고 linkage group 15 연관군내 어딘가에 LCDV-내 성 형 질을 좌우하는 유전자가 존재할 확률이 아주 높다고 할 수 있다. 향후 BAC clone을 이용한 gene target 연구 및 interval mapping등을 통하여 LCDV 내성관련 목적 유전자를 탐색하는데 본 연구결과가 유용한 유전정보로서 활용 가치가 높다고 할 수 있다.
- 육안으로 확인된 LCDV 발병개체에서 LCDV 질병관련 유전자로 선정된 NIF/NLI interacting factor 유전자 존재 여부를 확인하기 위한 PCR 증폭 결과 100% 해당 유전자가 존재하고 있었다. 또한 자연수계에서는 LCDV 질병이 발견되지 않음에 착안하여 자연산 넙치의 genomic DNA를 이용하여 분석한 결과 LCDV 바이 러스 유전자가 전혀 존재하지 않았다.
- (2006)에 의해 발표되었다. 이 논문에서는 LCDV-내성 line과 LCDV-감수성 line에서 만들어진 넙치의 역교배 가계를 이용한 QTL-mapping 결과, 넙치 유전자 지도상 linkage group 15에 있는 Poli9-8TUF 유전자 marker가 단일 위치에서 내성 형질의 발현을 50% 지배하는 유전자 marker임을 보고하였다.
- 이들 결과는 외관상 정상개체이지만 바이러스에 상당수가 감염되었을 것으로 예상되며 일차적으로 LCDV-free 개체 선별을 위해 NIF/NLI interacting factor 유전자를 이용할 수 있다. 이상의 결과에 따르면 단순한 single PCR법에 의해 LCDV에 감염된 개체와 fire한 개체를 용이하게 판별할 수 있었으며 Fig. 1에서와 같이 감염개체와 발병 개체에서 LCDV 바이러스 증식정도에 따라 바이러스 유전자 복제 수의 차이로 인한 PCR 산물량에 차이가 있음을 알 수 있었다. 동일 사육환경에서 LCDV 질병이 발병하면 사육개체들 대부분은 바이러스에 노출되어 전체 개체 중 4.
- 또한 자연수계에서는 LCDV 질병이 발견되지 않음에 착안하여 자연산 넙치의 genomic DNA를 이용하여 분석한 결과 LCDV 바이 러스 유전자가 전혀 존재하지 않았다. 이와 같은 결과는 선정된 질병관련 유전자는 넙치에는 존재하지 않고 LCDV에만 존재하는 유전자임을 알 수 있었으며 바이러스 DNA에는 넙치 유전자의 오염은 없는 것으로 확인되었다. LCDV가 발병한 양식장의 넙치인 경우 육안으로 발병된 개체들 뿐 만아니라 발병개체와 동일 수계에 있는 정상 개체인 경우도 207마리 중 188마리에서 LCDV 유전자가 검출되었다 (Table 1).
- , 2006). 이처럼, 본 연구에 서 관찰된 LCDV-내 성 집 단에서 의 113 bp allele 빈도는 0.28이라는 높은 빈도를 나타내고 있었고 일반 넙치 집단과도 현저한 차이를 나타내고 있음을 알 수 있었다.
- Fuji et al (2006)에 의해 이미 밝혀진 Poli9-8TUF marker는 본 연구에서는 LCDV-내 성형 질과 아무런 상호 연관성이 없는 linkage equillibrium 상태 였다. 즉, Poli9-8TUF marker와 LCDV-내성관련 QTL의 상대적 유전 거리는 14.7 cM으로 형질을 관여하는 목적 유전자와 유전자 marker는 상당한 거리가 있었음으로 임의의 집단이나 다른 가계에서도 동일한 효과를 나타낼 수 있는 유전자 marker 는 될 수 없음을 확인하였다.
후속연구
- 본 연구 결과에서는 LCDV-내성과 관련된 유전자는 Polil21TUF와 더 가까운 위치에 있을 것으로 예상되었고 linkage group 15 연관군내 어딘가에 LCDV-내 성 형 질을 좌우하는 유전자가 존재할 확률이 아주 높다고 할 수 있다. 향후 BAC clone을 이용한 gene target 연구 및 interval mapping등을 통하여 LCDV 내성관련 목적 유전자를 탐색하는데 본 연구결과가 유용한 유전정보로서 활용 가치가 높다고 할 수 있다.
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