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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 기 연구들의 문제점을 해결하고 안정적이고 효율적인 형질전환방법을 확립하기 위하여 Agrobacterium 과 배축 절편을 공동배양한 후 캘러스7 부정근 T 신초를 유도하는 방법으로 형 질전환시스템을 확보하였기 에 보고하고자 한다.
제안 방법
- '정상' 배추의 배축절편을 선발마커로서 paromomycin 저항성 유전자를 갖고 있는 pPTN290으로 각각 형질전환된 EHA101, LBA4404, GV3101 균주와 공동배양한 후 캘러스 유도 배지에서 형질전환캘러스를 얻은 후, 뿌리유도배지에서 부정근을 그리고 신초유도배지에서 신초를 각각 순차적으로 유도하였다. 형질전환캘러스 형성은』gr沥acWi/m균주에 따라 차이가 있었으며, 특히 EHA101 균주에 공동배양된 배 축 절편으로부터 최대 6.
- 2% sucrose와 0.8% agar가 첨가된 MS기본배지 (Murashige and Skoog 1962)에 페트리디쉬 당 10개의 종자를 치상하고 25℃, 암상태에서 5일 동안 발아시켰다. 배지는 고압 멸균 전 1 N HC1 과 1 N KOH로 pH 5.
- 형질전환식물체는 토양으로 옮겨 온실에서 순화한 후 각각 T2종자를 수확하였다. 7개의 독립 형질전환계통 (T, ) 으로부터 얻은 T2세대에 대한 후대 검증은 종자를 발아시켜얻은 유식물체에서 GUS반응을 수행하였다. 각 형질전환 계통으로부터 얻은 Tz종자 일부를 무작위로 선발하여 24시간 동안 증류수에 침적한 후 2일 동안 거즈 처리를 하여 발아시켰다.
- CaMV35S프로모터, /3-glucuronidase (GUS)유전자와 선발 마커로서 paromomycin-resistance유전자 (pPTN290)를 freeze- thaw방법으로 EHA101, LBA4404 및 GV3101균주에 각각 형질전환 하였다 (Jefferson et al. 1987). 50 mg/L streptomycin과 50 mg/L spectinomycin이 첨가된 LB액체배지 50 ml에 각각의 colony를 접종하여 28℃로 8시간 이상 배양한 후 대수기 증식기 (0&。= 0.
- 8)에 옮겨 6-8주 동안 2주 간격으로 암상태에서 계대배양 하면서 캘러스를 충분하게 증식한 후 1차 GUS 분석을 수행하여 형질전환 캘러스를 선별하였다. GUS 양성반응을 보인 캘러스를 호르몬이 첨가되지 않은 뿌리유도배지(%MS salt, MS vitamins, 2% sucrose, 100 mg/L paromomycin, 100 mg/ L cefotaxime, pH 5.8)에 옮겨 다시 암상태로 4주 동안 2주 간격으로 계대배양하면서 부정근을 유도하였으며, 형성된 부정근의 일부를 취하여 2차 GUS분석을 수행하여 뿌리 배양체의 형질전환여부를 판단하였다. GUS양성반응을 보인 뿌리를 5 mm 크기로 만들어 신초유도배지 에 (MS salt, B5 vitamin, 4 mg/L AgNOs, 4 mg/L 6-benzyladenine, 3 mg/L alphanaphthaleneacetic acid, 100 mg/L paromomycin, 100 mg/L cefotaxime, 3% sucrose, pH 5.
- 8)에 옮겨 다시 암상태로 4주 동안 2주 간격으로 계대배양하면서 부정근을 유도하였으며, 형성된 부정근의 일부를 취하여 2차 GUS분석을 수행하여 뿌리 배양체의 형질전환여부를 판단하였다. GUS양성반응을 보인 뿌리를 5 mm 크기로 만들어 신초유도배지 에 (MS salt, B5 vitamin, 4 mg/L AgNOs, 4 mg/L 6-benzyladenine, 3 mg/L alphanaphthaleneacetic acid, 100 mg/L paromomycin, 100 mg/L cefotaxime, 3% sucrose, pH 5.8) 옮격 6-8주 동안 2주 간격으로 16시간 광주기 조건 (46 nmol m%')으로 배양하였다. 형질전환 뿌리절편체로부터 형성된 신초원기를 분리하여 신초신장배지 ('/jMS salt, MS vitamins, 2% sucrose, 100 mg/L cefotaxime,pH 5.
- 1987). GUS용액에 침지한 모든 시료는 24시간 후 70% 알코올 용액으로 탈색 시킨 후 GUS 양성 반응을 보인 식물체의 빈도를 조사하였다. 대조구로서는』仞仞 과 공동배양하지 않은 식물체의 잎 절편을 사용하였다.
- GUS유전자의 안정적 발현과 후대에서의 분리비를 확인하기 위하여 7개의 독립적인 형질전환체로부터 얻은 T2 종자를 발아시킨 후 유식물체에서 GUS유전자의 발현빈도를 조사하여 X?-검정에 따라 멘델의 분리비를 조사한 결과 EB018-05, EB022-07, EB026-36, EB005-21-1의 경우는 3:1분리법칙에 따라 유전되고 있으나, EB005-21-2, EB005-21-3, EB013-86은 기대치에서 크거 벗어나고 있음을 보여 주었다 (Table 2, Figure II). 이는 각 형질전환계통의 genome에 g”s유전자가 single 또는 multiple copy로 삽입되어 유전되고 있음을 추측할 수 있다.
- PPTN290벡터의 선발마커인 nptH유전자 발현 형질전환체를 얻기 위하여 실험 당 약 200개 배축절편을 25 ml의 Agrobacterium용액에 30분 동안 침지 한 후 공동배양용 배지(MS salt, MS vitamins, 3% sucrose, 0.5% phyto-agar, 5 mg/L acetosyringone, pH 5.4)에 20개씩 치상하여 3일 동안 공동 배양하였다. 공동배양 후 배축절편을 3-5회 멸균수로 수세한 후캘러스 유도배지 (%MS salt, B5 vitamin, 5 mg/L acetosyringone, 1 mg/L 2, 4-D, 3% sucrose, 400 mg/L cefotaxime, 100 mg/L paromomycin, pH 5.
- SgroZwcWi”成과 공동배양된 배축절편으로부터 유도된 캘러스 (T)), 부정근 (Ti) 및 유식물체 (T2)을 취하여 37℃에서 5-bromo-4-chloro-3-indole-glucuronidase용액 에 침 지 하였다 (Jefferson et al. 1987). GUS용액에 침지한 모든 시료는 24시간 후 70% 알코올 용액으로 탈색 시킨 후 GUS 양성 반응을 보인 식물체의 빈도를 조사하였다.
- 7개의 독립 형질전환계통 (T, ) 으로부터 얻은 T2세대에 대한 후대 검증은 종자를 발아시켜얻은 유식물체에서 GUS반응을 수행하였다. 각 형질전환 계통으로부터 얻은 Tz종자 일부를 무작위로 선발하여 24시간 동안 증류수에 침적한 후 2일 동안 거즈 처리를 하여 발아시켰다. 유식물체가 1 cm 이상 자랐을 때 GUS분석을 수행하여 GUS양성반응 개체와 음성반응 개체의 멘델의 분리 법칙에 의한 분리비를 조사하였다.
- 4)에 20개씩 치상하여 3일 동안 공동 배양하였다. 공동배양 후 배축절편을 3-5회 멸균수로 수세한 후캘러스 유도배지 (%MS salt, B5 vitamin, 5 mg/L acetosyringone, 1 mg/L 2, 4-D, 3% sucrose, 400 mg/L cefotaxime, 100 mg/L paromomycin, pH 5.8)에 옮겨 6-8주 동안 2주 간격으로 암상태에서 계대배양 하면서 캘러스를 충분하게 증식한 후 1차 GUS 분석을 수행하여 형질전환 캘러스를 선별하였다. GUS 양성반응을 보인 캘러스를 호르몬이 첨가되지 않은 뿌리유도배지(%MS salt, MS vitamins, 2% sucrose, 100 mg/L paromomycin, 100 mg/ L cefotaxime, pH 5.
- 국내 재배품종인 “정상배추” 종자를 70% 알코올에 1분간, 2% sodium hypochlorite용액에 15 분간 표면 살균 하였다. 2% sucrose와 0.
- 8로 조정하였다. 배양 5일 후 발아된 배추 유식물체로부터 경단분열조직이 포함되지 않게 1 cm 크기 의 배축 절편을 절단 한 후 Agrobacterium을 이용한 형 질 전환실험에 사용하였다.
- 각 형질전환 계통으로부터 얻은 Tz종자 일부를 무작위로 선발하여 24시간 동안 증류수에 침적한 후 2일 동안 거즈 처리를 하여 발아시켰다. 유식물체가 1 cm 이상 자랐을 때 GUS분석을 수행하여 GUS양성반응 개체와 음성반응 개체의 멘델의 분리 법칙에 의한 분리비를 조사하였다.
- 8) 옮격 6-8주 동안 2주 간격으로 16시간 광주기 조건 (46 nmol m%')으로 배양하였다. 형질전환 뿌리절편체로부터 형성된 신초원기를 분리하여 신초신장배지 ('/jMS salt, MS vitamins, 2% sucrose, 100 mg/L cefotaxime,pH 5.8)에 옮겨 유식물체를 얻었으며, 이때 잎절편의 일부에서 3차 GUS분석을 수행하여 최종적으로 형질전환체를 확인하였다. 형질전환식물체는 토양으로 옮겨 온실에서 순화한 후 각각 T2종자를 수확하였다.
대상 데이터
- 1987). 50 mg/L streptomycin과 50 mg/L spectinomycin이 첨가된 LB액체배지 50 ml에 각각의 colony를 접종하여 28℃로 8시간 이상 배양한 후 대수기 증식기 (0&。= 0.6-1.0)의 균을 사용하였다
- GUS용액에 침지한 모든 시료는 24시간 후 70% 알코올 용액으로 탈색 시킨 후 GUS 양성 반응을 보인 식물체의 빈도를 조사하였다. 대조구로서는』仞仞 과 공동배양하지 않은 식물체의 잎 절편을 사용하였다.
성능/효과
- Agrobacterium 균주에 따른 형질전환캘러스 발생 빈도를 비교해 보면 EHA31에서 6.1%, LBA4404에서 2.4% 그리고 GV3101 에서 4.7%의 GUS 양성반응을 보였고, 이러한 캘러스로부터 부정근은 각각 60.7%, 8.3%, 20.5% 그리고 부정근으로부터 형질전환체는 각각 38.2%, 0%, 85.7%의 발생 빈도를 나타냈다 (Table 1). 이와 같이 Ngr沥acW如仞균주에 따라 형질전환 캘러스 부정근 및 형질전환체의 발생빈도는 뚜렷한 차이를 보였으며, 특히 EHA101 (6.
- 형질전환식물체는 특별한 형태적 이상 없이 온실에서 정상적으로 자라 T2 종자를 얻을 수 있었다. GUS방법으로 7개의 후대 유식물체를 분석한 결과 g必유전자가 안정적으로 발현하고 있음을 확인 하였고, 배추 genome에 single 또는 multiple copy로 전달되고 있음을 추측할 수 있었다.
- 1988)과 일치되고 있음을 보여 주었다. 따라서 배추의 형질전환은 배 축 절편으로부터 직접 신초발생을 유도하는 배양 시스템을 이용하는 것 보다는 캘러스유도- 뿌리유도—형질전환체 생산 등의 배양과정을 이용하는 것이 매우 효율적이며, 특히 이러한 방법은 각 단계에서 도입유전자의 발현을 확인 함으로서 도입유전자의 “escape”나 “chimeric”현상을 초기에 차단하여 안정적이고 재현성 있게 형질전환체를 생산할 수 있는 방법임을 알 수 있었다.
- 1%까지 얻어졌다. 또한 각각의 형질전환캘러스 클론으로부터 형질전환 부정근과 신초 발생은 EHA101 균주에서 60.7%와 38.2%, LBA4404에서 8.3%와 0%, GV3101에서 20.5%와 85.7%까지 각각 얻을 수 있었다. 형질전환식물체는 특별한 형태적 이상 없이 온실에서 정상적으로 자라 T2 종자를 얻을 수 있었다.
- 1 cm크기의 배축 절편을 잘라 Xgr沥ac也切m과 공동배양한 후 paromomycin항생제가 첨가된 캘러스 유도 배지에서 6-8주동안 배양하였다. 배양 2주 후부터 배축 절편 절단 부위로부터 캘러스가 형성되기 시작 하였으며, 배양 6-8째에공동배양한 배축절편의 2.4-6.1%에서 부드러운 노란색 또는 갈색의 형질전환 캘러스를 얻을 수 있었다. 형질 전환 캘러스 클론 (102개)을 호르몬이 첨가되지 않은 뿌리유도배지에 옮겨 4주 동안 암상태로 배양 할 경우 /gro/wc切物m균주에 따라 8.
- 7%의 발생 빈도를 나타냈다 (Table 1). 이와 같이 Ngr沥acW如仞균주에 따라 형질전환 캘러스 부정근 및 형질전환체의 발생빈도는 뚜렷한 차이를 보였으며, 특히 EHA101 (6.1%), LBA4404 (2.4%) 및 GV31 이 (4.7%)의 경우 이전 본 연구진에 의해 보고된 배 축 절편 체로부터 직접 신초형성을 통한 최대 형질전환체 발생빈도 (0.7%)보다 훨씬 높은 것으로 나타났다. 이러한 결과는 많은 작물의 경우균주에 따라 감염성이 다를 수 있으며 (Simmonds and Donaldson 2000, Lee et al.
- 1%에서 부드러운 노란색 또는 갈색의 형질전환 캘러스를 얻을 수 있었다. 형질 전환 캘러스 클론 (102개)을 호르몬이 첨가되지 않은 뿌리유도배지에 옮겨 4주 동안 암상태로 배양 할 경우 /gro/wc切物m균주에 따라 8.3%-60.7%까지 부정근이 발생되었으며, 이러한 부정근으로부터 형질전환식물체는 최대 85.7%에서 얻을 수 있었다 (Figure 1). 반면 선발배지에서 생장을 하지 않거나 점차 갈변되면서 괴사되는 배축절편의 경우 캘러스 클론을 얻지 못하였다.
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