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문제 정의
- 이러한 목표 달성을 위해 본 연구에서는 체계적으로 배추 원형질체 분리로부터 초기 세포분열 유도 micro-callus 형성, callus colony 생장, 그리고 callus colony로부터 신초 재분화유도에 이르는 각 단계에 다양한 처 리를 함으로써 그 효과에 대한 정보를 얻는 한편 배추 단독 원형질체로부터 얻어진 callus를 배양함으로써 재분화 신초 획득 효율을 향상시키고자 하였다.
제안 방법
- 원형질체 배양 시작 7일 후 6개 배추 인자형 (노랑봄, 조생추석, 향풍, 국보65일, 서울 원예20021호)에 대한 각각의 처리별 세포분열율을 조사하는 한편, PGR 조성이 동일한 8p-KM 수정배지를 각 배양물에 3 mL씩 첨가하였다. 8p-KM 수정 기본배지는 KM배지 (Kao and Michayluk 1975) 에 glucose와 sucrose를 각각 50 mM, mannitol 0.1 M, mannose, fructose, ribose, xylose, rhamnose, cellobiose를 각각 250 mg/L, casamino acid 250 mg/L 및 coconut water 10 mL/L 를 첨가하고 pH를 5.8로 조정하여 조제하였다. 원형질체배양 시작 14일 후 6개 배추 인자형에 대한 micro-callus 생장을 처리별로 조사하고 동일한 생장조절제 조성의 MS 수정배지 (MS 배지, sucrose 50 mM, mannitol 50 mM, PVP K40 500 mg/L, pH 5.
- 2);">olㆍm-2ㆍs-1)/8시간 암의 일장 하에서 25℃로 배양하였다. Micro-callus를 plating 한 2주 후 callus colony의 생장을 조사하였으며 노랑봄배추 callus colony는 유래한 종류별로 구분하여 재분화 유도를 위한 재료로 사용하였다. PGR (BA, zeatin, NAA) 이 혼용 첨가되고 sucrose 30 g/L과 gelrite 2 g/L가 첨가된 pH 5.
- Micro-callus를 plating 한 2주 후 callus colony의 생장을 조사하였으며 노랑봄배추 callus colony는 유래한 종류별로 구분하여 재분화 유도를 위한 재료로 사용하였다. PGR (BA, zeatin, NAA) 이 혼용 첨가되고 sucrose 30 g/L과 gelrite 2 g/L가 첨가된 pH 5.8 MS 배지를 재분화 유도를 위한 배지로 사용하였으며, petri-dish 당 6-10개의 callus colony를 이식하였고 배양환경은 callus colony 유도 시와 동일하였다. 신초와 뿌리 분화는 배양 3주 후 조사하였다.
- 노랑봄 품종의 callus colony를 대상으로 유래한 배지 code별로 구분한 후 (See the medium codes in table 2) BA, zeatin 및 NAA가 단용 또는 혼용 첨가된 MS배지에 치상하여 callus colony의 반응을 조사하였다 (Table 3, Figure 3Be). Code D 배지에서 유래한 callus colony는 callus의 지속과 약간의 갈변현상만 관찰되 었을 뿐 신초 또는 뿌리 재분화는 관찰 할 수 없었다 (Figure 3Bc lower dishes).
- 1%; Sigma-Aldrich, USA)로 구분하여 사용하였다. 모든 용액은 pore size 0.2 |im membrane filter로 멸균후 사용하였으며, 처리당 5개 플라스크를 사용하여 매 시간마다 각 플라스크로부터 2개 표본을 취한 후 haemacytometer를 이용하여 현미경 하에서 분리된 원형질체의 수를 계산하였다. 효소처리가 완료된 현탁액은 250 ㎛ 채로 거른 후 그 여과액에 NN69 무기 염과 sucrose 0.
- 발아한 배추 실생으로부터 파종 후 1주일에 하배축, 2주일에 떡잎 및 3주일에 본잎을 채취하여 세절한 후 CaCl2ㆍH2O 50 mM과 mannitol 0.3 M이 첨가된 pH 5.8 용액에서 16시간 동안 암상태로 전처리 하였다. 전처리된 절편을 효소 조합을 달리한 NN69 무기염 (Nitsch and Nitsch 1969), sucrose 0.
- 배추 3개 인자형으로부터 얻어진 micro-callus 현탁액 3 mL를 취하여 BA, zeatin, NAA 등 PGR과 ethylene생합성 경로와 밀접한 관계를 가지고 있는 polyamine 및 ethylene 생합성 억제제의 하나인 AVG 등을 달리 첨가한 l1종의 고체배지에 plating 한 후 callus colony의 생장을 조사하였다 (Table 2). 노랑봄 품종은 code D 배지 (BA 2.
- 3A), 가임 서울배추 내혼 계통, TuMV 저항성 원예 20021 내혼 계통 및 시판 일대잡종 4개 품종을 사용하였다. 배추 종자를 Han과 Kim (1990)의 방법에 따라 표면살균한 후 하배축 채취용은 CaClㆍ2H2O 30 mM이 첨가되고 agar 1.5%로 굳힌 배지에 떡잎 및 본잎 채취용은 sucrose 10 g/L가 첨가 되고 agar 0.8%로 굳힌 MS배지 (Murashige and Skoog 1962)에 각각 파종하였으며 배지의 pH는 고압멸균 전에 5.8 로 조정하여 사용하였다. 파종한 종자는 16시간 명 (50 μ molㆍm-2ㆍs-18시간 암의 일장 하에서 25℃로 배양하여 발아시켰다.
- 2008). 본 실험 에서도 가임 서울배추 내혼 계통 실생의 떡잎, 하배축 및 본잎을으로부터 분리한 원형질체를 2, 4-D, NAA 및 BA 등의 조성이 다른 4종류의 액체 배지에서 언급한 바와 같이 광조절을 하면서 배양 (명배양)한 후 세포분열율과 micro-callus 생장을 조사하였다 (Table 1). 세포분열율과 micro-callus 생장 모두 2, 4-D 1.
- 1988). 본 실험에서는 가임 서울배추를 포함한 2개 내혼 계통과 노랑봄배추 등 시판 일대잡종 4품종의 떡잎에서 분리한 원형질체를 2, 4-D 1.0 mg/L, NAA 0.5 mg/L 및 BA 1.0 mg/L가 첨가된 배지에 현탁하고 광조건을 달리하여 배양한 후 세포분열율과 micro-callus 생장을 조사하였다 (Figure 2). 배추의 인자형과 광조건에 따라 세포분열율과 micro-callus 생장 양상이 달리 나타났는데, 가임 서울배추의 원형질체를 명배양 하였을 때 세포분열율이 33.
- 2008; Jee and Chung 1989a), 식물 조직의 종류에 따라 단위 무게 또는 부피 당 세포의 수가 다르다는 것은 일반적 사실이다. 본 연구에서는 Ogura CMS 서울배추 기내 실생의 하배축, 떡잎 및 본잎을 재료로 이용하여 2가지 효소액 처리 후 각 조직의 단위 무게당 분리되는 원형 질체 수를 효소처리 20시간 까지 조사하였다 (Figure 1). 본잎 조직의 경우 효소액 A (cellulose R-10 1%, macerozyme R-10 0.
- 본 연구에서는 배추의 고수율 원형질체 분리 조건을 제시하는 한편 분리된 원형질체로부터 초기 세포분열 유도를 비롯하여 이어지는 micro-callus로의 생장, callus colony 획득 및 callus colony로부터 신초 재분화 과정에 미치는 다양한 처리의 효과를 구명하였다. 특히, 원형질체 배양 초기인 세포분열과 micro-callus 생장 단계에서부터 배추 인자형에 따라 차이가 있음을 입증하였으며, 최종적으로는 최고 4.
- 원형질체 배양 시작 17일 후 노랑봄, 조생추석 및 서울배추의 micro-callus가 포함된 배양물 3 mL를 균일하게 취하여 삼투압을 낮추고 다양한 첨가물이 포함된 11종의 수정 MS 배지 (MS배지, sucrose 37.5 mM, mannitol 112.5 mM, agarose type VII 12.5 g/L, pH 5.8)가 담긴 87x15 mm petri-dish에 plating하였다. 배양물은 16시간 명 (50 ㎛ 5 ㎛ol)/8시간 암 조건으로 이동하였다. 원형질체 배양 시작 7일 후 6개 배추 인자형 (노랑봄, 조생추석, 향풍, 국보65일, 서울 원예20021호)에 대한 각각의 처리별 세포분열율을 조사하는 한편, PGR 조성이 동일한 8p-KM 수정배지를 각 배양물에 3 mL씩 첨가하였다. 8p-KM 수정 기본배지는 KM배지 (Kao and Michayluk 1975) 에 glucose와 sucrose를 각각 50 mM, mannitol 0.
- 8 용액 등량을 혼합한 후, 혼합액을 15 mL conical tube 에 담아 100 xg에서 7분간 분획하였다. 원형질체가 포함된 상징액을 취하여 W5 용액 (CaCl2-2H2O 125 mM, NaCI 154 mM, KC1 5 mM, glucose 5 mM, pH 5.6) (Menczel and Wolfe 1984)으로 희석한 후 100 xg에서 5분간 원심분리하는 방법으로 원형질체를 2회 세척하였다.
- 8로 조정하여 조제하였다. 원형질체배양 시작 14일 후 6개 배추 인자형에 대한 micro-callus 생장을 처리별로 조사하고 동일한 생장조절제 조성의 MS 수정배지 (MS 배지, sucrose 50 mM, mannitol 50 mM, PVP K40 500 mg/L, pH 5.8)를 6 mL씩 추가 첨가하였다. MS 수정배지 추가 첨가 직 후 배양물을 약 3 mL씩 균일하게 4등분하여 새로운 60x10 mm petri-dish로 옮겨 배양하였다.
- 본 실험의 결과 분리되는 원형질체의 수는 효소액 처리시간에 따라 정의 상관관계를 나타내지 않으므로 cellulase나 pectinase와 같은 효소에 의해 조기에 분리된 원형질체가 피해를 입는 것을 최소화 하기 위해서는 적정 시간 동안만 처리하는 것이 필수적이라고 판단된다. 이와 같은 결과를 토대로 배추 본잎의 경우 효소액 A로 5시간 처리, 떡잎의 경우 효소액 A로 7시간 처리, 하배축의 경우 효소액 B로 7시간 처리하는 것을 고수율 원형질체 분리를 위한 효소액 조성과 처리시간으로 설정하고 다음 실험에 활용하였다.
- 8 용액에서 16시간 동안 암상태로 전처리 하였다. 전처리된 절편을 효소 조합을 달리한 NN69 무기염 (Nitsch and Nitsch 1969), sucrose 0.1 M, mannitol 0.7 M (하배축) 또는 0.3 M (떡 잎과 본잎), MES (Sigma-Aldrich, USA) 10 mM, albumin bovine (Sigma-Aldrich, USA) 0.2%, pH 6.2 용액에 넣어 50 rpm으로 진탕하면서 27℃ 암상태에서 최장 20시간까지 배양하였다. 효소는 효소액 A (cellulose.
대상 데이터
- 농촌진흥청 원예연구소에서 보유한 Ogura CMS 서울배추(Fig. 3A), 가임 서울배추 내혼 계통, TuMV 저항성 원예 20021 내혼 계통 및 시판 일대잡종 4개 품종을 사용하였다. 배추 종자를 Han과 Kim (1990)의 방법에 따라 표면살균한 후 하배축 채취용은 CaClㆍ2H2O 30 mM이 첨가되고 agar 1.
- 2 용액에 넣어 50 rpm으로 진탕하면서 27℃ 암상태에서 최장 20시간까지 배양하였다. 효소는 효소액 A (cellulose. R-10 1%; Yakult Honsha Co., Japan, macerozyme R-10 0.5%; Yakult Honsha Co., Japan)와 효소액 B (cellulose R-10 1%, macerozyme R-10 0.4%, pectolyase 0.1%; Sigma-Aldrich, USA)로 구분하여 사용하였다. 모든 용액은 pore size 0.
이론/모형
- MS 수정배지 추가 첨가 직 후 배양물을 약 3 mL씩 균일하게 4등분하여 새로운 60x10 mm petri-dish로 옮겨 배양하였다. Petri-dish는 매일 2회씩 가볍게 흔들어 줌으로써 배양물이 petri-dish 바닥에 부착하는 것을 방지하였다 모든 수정 배양액 조성은 Jee와 Chung (1989a; 1989b; 1989c)의 보고를 참고하였다.
성능/효과
- 3% 빈도의 배추 단독 원형질체 배양을 통한 식물체 재분화 결과는 본 연구의 최종 목적인 웅성불임 세포질잡종 (cybnd) 획득을 위한 원형질체 융합 연구에 적용하기에는 충분하지 않은 빈도일 수 있다. 그러나 본 연구의 결과는 과거 보고된 배추 단독 원형질체 배양을 통한 재분화 효율에 비하면 상당히 개선된 결과이며 다량의 callus colony를 비교적 손쉽게 획득할 수 있는 방법을 제시하였다는 측면에서 의미 있다고 사료된다. 본 연구에서 얻어진 callus colony를 재료로 보다 다양한 외생 PGR 조합 처리, ethylene 억제제의 사용 및 Murata와 Orton (1987)이 언급한 바와 같이 배지 내 당 조절 등을 검토한다면 보다 향상된
- Han과 Kim (1990) 및 Lian과 Lim (2001)은 배추 원형질체를 단독 배양하거나 융합친으로 활용하기 위해 원형질체를 분리할 때 본잎을 재료로 이용하는 것이 그 수율이 높을지라도 초기 세포분열과 이어지는 micro -callus 생장을 위해서는 떡잎을 재료로 하는 것이 보다 효과적이며, 초기 세포분열율이 높다고 하더라도 이것이 다음 단계인 micro-callus 생장으로 반드시 이어지지 않는 다는 것을 나타낸다고 할 수 있다. 또한 인자처리의 강도 (ω2)를 분석한 결과 예측한 바와 같이 세포분열 및 micro-callus 생장 모두에 PGR의 영향이 약 66%로 가장 크고 다음으로 절편의 종류에 따른 영향이 각각 13%와 15%였다. 따라서 배추 원형질체 배양 시 초기 세포분열 유도와 지속적 micro-callus로의 생장을 위해서는 배지의 조성, 특히 PGR을 조절하는 것이 효과적이라고 할 수 있다.
- 0 mg/L가 첨가된 배지에 현탁하고 광조건을 달리하여 배양한 후 세포분열율과 micro-callus 생장을 조사하였다 (Figure 2). 배추의 인자형과 광조건에 따라 세포분열율과 micro-callus 생장 양상이 달리 나타났는데, 가임 서울배추의 원형질체를 명배양 하였을 때 세포분열율이 33.4%로 가장 양호하였으며, micro-callus 생장은 노랑봄, 조생추석 및 서울배추를 명배양 했을 때 각각 8.3, 8.3 및 8.5 score로 왕성하다는 것을 관찰할 수 있었다. 이들 3개 품종의 떡잎 유래 원형질체를 명배양 함으로써 생장한 micro-callus는 다음 실험인 고체배지에 plating하여 callus colony를 획득하기 위한 재료로 사용하였다.
- 1991), 기내 재분화가 어려운 Brassica속에서는 ethylene 의 생합성 또는 작용을 억제함으로써 재분화를 성공적으로 유도할 수 있다고 보고되었다 (Pua 1993). 본 시험에서는 ethylene 생합성 주변 경로와 연결되어 있으며 일종의 PGR로 인식되는 polyamine류 및 ACC 합성효소의 활성을 저해함으로써 ethylene 생합성을 직접 억제하는 AVG를 callus colony 생장배지에 첨가하였으나 효과가 없거나 고농도에서 callus colony의 생장이 억제되는 경향을 나타내었다. 그러나 본 연구의 다음 실험에서와 같이 callus colony로부터 신초 재분화를 유도하는 단계에서 다량의 cytokinin을 배지에 첨가하였음에도 불구하고 ethylene 억제제의 효과를 검토하지 않았다 (Table 3).
- 2008). 본 실험의 결과 분리되는 원형질체의 수는 효소액 처리시간에 따라 정의 상관관계를 나타내지 않으므로 cellulase나 pectinase와 같은 효소에 의해 조기에 분리된 원형질체가 피해를 입는 것을 최소화 하기 위해서는 적정 시간 동안만 처리하는 것이 필수적이라고 판단된다. 이와 같은 결과를 토대로 배추 본잎의 경우 효소액 A로 5시간 처리, 떡잎의 경우 효소액 A로 7시간 처리, 하배축의 경우 효소액 B로 7시간 처리하는 것을 고수율 원형질체 분리를 위한 효소액 조성과 처리시간으로 설정하고 다음 실험에 활용하였다.
- 2000). 본 연구에서 얻어진 최고 4.3% 빈도의 배추 단독 원형질체 배양을 통한 식물체 재분화 결과는 본 연구의 최종 목적인 웅성불임 세포질잡종 (cybnd) 획득을 위한 원형질체 융합 연구에 적용하기에는 충분하지 않은 빈도일 수 있다. 그러나 본 연구의 결과는 과거 보고된 배추 단독 원형질체 배양을 통한 재분화 효율에 비하면 상당히 개선된 결과이며 다량의 callus colony를 비교적 손쉽게 획득할 수 있는 방법을 제시하였다는 측면에서 의미 있다고 사료된다.
- 본 실험 에서도 가임 서울배추 내혼 계통 실생의 떡잎, 하배축 및 본잎을으로부터 분리한 원형질체를 2, 4-D, NAA 및 BA 등의 조성이 다른 4종류의 액체 배지에서 언급한 바와 같이 광조절을 하면서 배양 (명배양)한 후 세포분열율과 micro-callus 생장을 조사하였다 (Table 1). 세포분열율과 micro-callus 생장 모두 2, 4-D 1.0 mg/L, NAA 0.5 mg/L 및 BA 1.0 mg/L가 첨가된 배지에서 떡잎 유래 원형질체를 배양했을 때 각각 33.4%와 8.5 score로 가장 높았다. Han과 Kim (1990) 및 Lian과 Lim (2001)은 배추 원형질체를 단독 배양하거나 융합친으로 활용하기 위해 원형질체를 분리할 때 본잎을 재료로 이용하는 것이 그 수율이 높을지라도 초기 세포분열과 이어지는 micro -callus 생장을 위해서는 떡잎을 재료로 하는 것이 보다 효과적이며, 초기 세포분열율이 높다고 하더라도 이것이 다음 단계인 micro-callus 생장으로 반드시 이어지지 않는 다는 것을 나타낸다고 할 수 있다.
- 한편, 하배축 조직은 효소액 A 처리 시 원형질체의 수율이 현저히 낮아, pectin질 분해 효소의 구성을 조절하였다. 조절한 효소액 (효소액 B; cellulose R-10 1%, macerozyme R-10 0.4%, pectolyase 0.1 %)으로 하배축 절편을 처리한 결과 떡잎 조직에 효소액 A를 사용했을 때와 유사한 정도로 원형질체가 분리되었다. 재분화 배양을 위한 식물 원형질체 분리 시 Jee와 Chung (1989a)의 경우 (2-3 시간)를 제외하고 대부분 약 10-16 시간 동안 또는 overnight 하여 효소액을 처리하였다 (Sakai and Imamura 1990; Lian and Lim 2001; In et al.
- 효과를 구명하였다. 특히, 원형질체 배양 초기인 세포분열과 micro-callus 생장 단계에서부터 배추 인자형에 따라 차이가 있음을 입증하였으며, 최종적으로는 최고 4.3%의 빈도로 callus colony로부터 신초를 재분화 시켰다. 이러한 결과는 금후 배추 단독 원형질체 배양을 통한 고빈도 식물체 재분화 연구에 중요한 정보를 제공함으로써 유용하게 활용될 것으로 사료된다.
후속연구
- 또한 이미 원형질체 융합 후 여교배를 통해 얻어진 유용 CMS 배추를 일회친으로 활용하여 여교배 함으로써 상업적 일대잡종 품종의 한 쪽 친을 웅성불임성화 하는 것도 역시 상당한 시간이 소요된다. 따라서 A 게놈인 배추의 원형질체 (intact protoplast) 배양을 통한 기내 재분화 체계를 확립하고 다양한 배추과 작물의 Ogura CMS cytoplast와의 비대칭 융합 (Sakai and Imamura 1990)에 이 체계를 적용할 수 있다면 효율적으로 일대잡종 품종의 웅성불임 친을 육성할 수 있을 것이다.
- 있다. 따라서 배추 원형질체 배양 시 원형질체로부터 신초유기용 재료로 사용될 callus 형성까지 각 간계의 배양환경을 신초 분화에 유리한 방향으로 주의 깊게 조절하여야 할 것으로 판단된다. 재분화된 신초는 PGR 무첨가 MS 배지에 계대배양함으로써 양호하게 뿌리를 발생시킬 수 있었으며 (Figure 3Bh), 완전히 발근한 재분화 개체는 기내에서 감습 조절함으로써 순화시켰고 기외 이식 후 정상 식물체로 생장하였다 (Figure 3Bi).
- 언급한 고전적 육종프로그램에 답을 제공하고 Brassica 핵과 친화성을 갖도록 Ogura 세포질의 소기관 게놈을 재구성할 수 있는 아직까지의 유일한 방법은 원형질체 융합 기술의 적용일 것이다. Pelletier 등 (1983) 이후 원형질체 융합을 통해 웅성불임성을 발현하는 미토콘드리아 유전자와 제초제 triazine에 저항성을 나타내는 엽록체 유전자를 동시에 갖는 체세포잡종 B.
- 3%의 빈도로 callus colony로부터 신초를 재분화 시켰다. 이러한 결과는 금후 배추 단독 원형질체 배양을 통한 고빈도 식물체 재분화 연구에 중요한 정보를 제공함으로써 유용하게 활용될 것으로 사료된다.
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