우리나라의 전통발효식품의 기초가 되는 곡자는 날곡류에 Aspergillus속, Rhizpous속 등 곰팡이류 , 효모 기타 미생물이 자연적으로 번식하여 효소를 함유하는 것이고, 입국은 곡류를 증자한 후 Aspergillus속, Rhizopus,속 등 곰팡이를 번식시켜 효소를 함유하는 것이다. 식품첨가물공전 천연첨가물 중 국(입국) 시험항목에서 잡균(Penicillium속)의 오염확인이 어려워 새로운 곰팡이 시험법의 확립이 필요하다. 그래서 곰팡이 특유의 포자, 분생자병 또는 균사의 격벽유무 등의 관찰이 용이한 slide culture법을 확립하였다. Slide culture 법은 slide glass위에 정방형의 잘라진 배지를 놓고, 양쪽 모서리에 포자를 접종하고 배양되는 과정동안 포자, 균사체 및 격벽 등을 관찰하였다. Slide culture법을 이용하여 대표적인 식품 관련 곰팡이의 형태학적 특징을 확인하여, 시중에서 유통되는 수입 또는 국내 생산되는 곡자, 입국 등을 수거하여 Penicillium속 오염 여부를 모니터링하였으며, 그 결과 Penicillium속의 오염율은 0%였음을 확인하였다. 최종적으로 식품첨가물공전의 국 중 잡균시험법 등 곰팡이시험법 제 개정의 기초자료로 활용하고자 한다.
우리나라의 전통발효식품의 기초가 되는 곡자는 날곡류에 Aspergillus속, Rhizpous속 등 곰팡이류 , 효모 기타 미생물이 자연적으로 번식하여 효소를 함유하는 것이고, 입국은 곡류를 증자한 후 Aspergillus속, Rhizopus,속 등 곰팡이를 번식시켜 효소를 함유하는 것이다. 식품첨가물공전 천연첨가물 중 국(입국) 시험항목에서 잡균(Penicillium속)의 오염확인이 어려워 새로운 곰팡이 시험법의 확립이 필요하다. 그래서 곰팡이 특유의 포자, 분생자병 또는 균사의 격벽유무 등의 관찰이 용이한 slide culture법을 확립하였다. Slide culture 법은 slide glass위에 정방형의 잘라진 배지를 놓고, 양쪽 모서리에 포자를 접종하고 배양되는 과정동안 포자, 균사체 및 격벽 등을 관찰하였다. Slide culture법을 이용하여 대표적인 식품 관련 곰팡이의 형태학적 특징을 확인하여, 시중에서 유통되는 수입 또는 국내 생산되는 곡자, 입국 등을 수거하여 Penicillium속 오염 여부를 모니터링하였으며, 그 결과 Penicillium속의 오염율은 0%였음을 확인하였다. 최종적으로 식품첨가물공전의 국 중 잡균시험법 등 곰팡이시험법 제 개정의 기초자료로 활용하고자 한다.
Koji is steamed rice that has had koji-kin, or koji mold spores, cultivated onto it. The isolation, culture, and microscopic examination of molds in the koji require the use of the selective media and special microscopic slide techniques. If simple wet mount slides of molds were attempted, it became...
Koji is steamed rice that has had koji-kin, or koji mold spores, cultivated onto it. The isolation, culture, and microscopic examination of molds in the koji require the use of the selective media and special microscopic slide techniques. If simple wet mount slides of molds were attempted, it became apparent that wet mount slides made from mold colonies usually don't reveal the arrangement of spores that is so necessary in identification. The process of merely transferring hyphae to a slide breaks up the hyphae and sporangiophores in such a way that identification becomes very difficult. The slide culture method is superior to wet mounts in that the hyphae, sporangiophores, and spores remain more or less intact when transferred. The procedure that will be used to produce a mold culture on a slide that can be observed directly on the slide. We investigated the contamination rate of penicillium spp. on the 21 kinds of koji distributed at Korea. The contamination rate of Penicillium spp. were not detected at 21 products by slide culture method. These results will be used to reestablish a mold determination of koji and food in Food Additives Code.
Koji is steamed rice that has had koji-kin, or koji mold spores, cultivated onto it. The isolation, culture, and microscopic examination of molds in the koji require the use of the selective media and special microscopic slide techniques. If simple wet mount slides of molds were attempted, it became apparent that wet mount slides made from mold colonies usually don't reveal the arrangement of spores that is so necessary in identification. The process of merely transferring hyphae to a slide breaks up the hyphae and sporangiophores in such a way that identification becomes very difficult. The slide culture method is superior to wet mounts in that the hyphae, sporangiophores, and spores remain more or less intact when transferred. The procedure that will be used to produce a mold culture on a slide that can be observed directly on the slide. We investigated the contamination rate of penicillium spp. on the 21 kinds of koji distributed at Korea. The contamination rate of Penicillium spp. were not detected at 21 products by slide culture method. These results will be used to reestablish a mold determination of koji and food in Food Additives Code.
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문제 정의
또한 분류군의 범위가 분류군마다 다른 경우가 많아서 Penicillium 같은 속은 다른 종이라도 ITS, D1-D2부분 이 100% 동일해서 더 빠른 진화속도를 가진 유전자나, 형태학적인 방법을 함께 병행해야 하는 경우도 있다.W6) 따라서 본 연구에서는 분생자병의 형태, 정낭 및 경자의 형태, 격벽의 유무, 분생자의 형태 및 색깔 등의 관찰이 용이한 slide culture법을 식품첨가물공전의 국의 잡균 시험법과 비교 검토하고, 국내 종국에 대한 모니터링을 실시하여 시험법을 검증하고, 곰팡이 시험법 개정의 기초자 료로 활용하고자 한다.
이를 방지하기 위해 식품첨가물의 국에서의 Penicillium 속 오염여부를 정확히 판단하는 것이 중요하다. 따라서, 국, 종국에서 잡균을 더 용이하고 정확하게 구별하기 위해 본 연구에서 확립된 slide culture법의 유용성을 파악하고자 모니터링을 실시하였다.
Slide culture 이용한 곰팡이의 형태학적 분류는 식품 제조과정 중이나, 보관 중에 오염되어 인체에 유해할 수 있는 곰팡이를 사전에 검출하여 위해물질로부터 안전을 지키는데 도움이 될 것이다. 또한 이러한 곰팡이 이물 검사 법을 통해 국외, 국내 식품에서 곰팡이 검사가 활성화되도록 유도하고 식품안전성 확보 및 관리 방안 수립에 기초자료로 이용되게 하고자 한다.
본 논문은 2006년도 식품의약품안전청 연구사업인 “Slide culture을 이용한 곰팡이(mold) 시험법 확립 및 검증” 결과의 일부이며, 연구비의 지원에 감사하는 바이다.
제안 방법
분자생물학적 종동정은 여러 유전자를 이용할 수 있으나, 현재 전 세계적으로 축적되어 있는 데이터베이스가Ribosomal RNA유전자의 ITS(Intemal transcribed spacer) 및 Large ribosomal RNA의 D1-D2 부분에 대하여 이루어져 왔기 때문에, 이 두 부분을 기본 단위로 염기서열을 분석한다. 종 다양성을 보기 위해서든지 아니면 이 두 부분의 염기서열이 종 수준을 구별할 정도로 변이가 안 일어난 분류군의 경우에는 RFLP(restriction fragment length polymorphism), AFLP(Amplified fragment length poly-morpism) 등의 방법을 이용한 DNA finger printing 방법을 사용하기도 한다.
곰팡이 분리배양에 사용되어지는 배지는 potato dextrose agar, sabouraudes agar, cornmeal agar 및 Czapek solution agar가 사용되어진다. 실험과정 은 slide 위에서 직접 곰팡이 배양이 가능하도록 멸균된 PDA배지 조각(정방형, 5 mm)에 곰팡이 colony로부터 포자를 접종하였다. 접종된 slide를 수분이 공급된 petri dish 에 넣어서 20~25℃에서 배양하면서 현미경 관찰을 실시한다.
실험과정 은 slide 위에서 직접 곰팡이 배양이 가능하도록 멸균된 PDA배지 조각(정방형, 5 mm)에 곰팡이 colony로부터 포자를 접종하였다. 접종된 slide를 수분이 공급된 petri dish 에 넣어서 20~25℃에서 배양하면서 현미경 관찰을 실시한다. 배양 1일 후부터 균사생성방법, 포자의 생성여부, 포자낭병의 형태 및 분생자병의 생성을 관찰하면서 푸른 곰팡이 (Penic#m속) 오염여부를 확인한다.
접종된 slide를 수분이 공급된 petri dish 에 넣어서 20~25℃에서 배양하면서 현미경 관찰을 실시한다. 배양 1일 후부터 균사생성방법, 포자의 생성여부, 포자낭병의 형태 및 분생자병의 생성을 관찰하면서 푸른 곰팡이 (Penic#m속) 오염여부를 확인한다. 과정을 간단히 요약하여 도식화하면 Table 1, Fig.
확립된 slide culture법이 Penicillium 속 외의 곰팡이 균주의 형태학적 관찰에도 유용하게 이용될 수 있는지 검토하기 위해 식품관련 대표적 곰팡이를 문헌조사하고, KoreanCollection for Type Cultures (KCTC)에서 각 곰팡이 종을 분양받아 slide culture를 이용하여 현미경 특징을 관찰하였다. 식품에 관련된 대표적 곰팡이 중에서 곰팡이 생산균주들을 중심으로 Asperg#us속(5종), Penicillium속종'), Rhizopus속(4종)등 16속 28종을 분양받아 관찰하였으며, 각 균주의 최적배지와 배양온도는 Table 2와 같다.
식품에 관련된 대표적 곰팡이 중에서 곰팡이 생산균주들을 중심으로 Asperg#us속(5종), Penicillium속종'), Rhizopus속(4종)등 16속 28종을 분양받아 관찰하였으며, 각 균주의 최적배지와 배양온도는 Table 2와 같다. 국내 유통되는 곡자, 입국 모니터링으로 잡균(PeniciHium 속)의 오염실태조사 새로운 시험법을 이용하여 수입 또는 국내 유통되는 곡자, 입국 등을 수거하여 황국, 백국 등과 잡균의 형태학적 특징 및 미세구조를 비교하여 잡균의 오염실태를 조사하였다.
Slide culture법을 이용한 대표적 곰팡이의 형태적학적 관찰 본 slide culture법이 일반적 곰팡이의 형태학적 관찰에도 적합한지 알아보기 위해, 분양받은 각 균주를 PDA배 지를 포함한 최적 배지상에 3점 접종하여, 최적 배양 온도에서 2-7일간 배양하면서 집락의 특징 (plate상의 surface color, backside color)을 관찰하였다(Fig. 5). 또한, Slideculture법을 이용하여 배양 1일 후부터 현미경으로 관찰하였고, microscopic features인 포자의 형태, 색깔, 격벽의 유무 및 분생자병 등의 미세구조를 관찰하였으며, 이를 바탕으로 곰팡이 분류에 이용할 수 있다.
5). 또한, Slideculture법을 이용하여 배양 1일 후부터 현미경으로 관찰하였고, microscopic features인 포자의 형태, 색깔, 격벽의 유무 및 분생자병 등의 미세구조를 관찰하였으며, 이를 바탕으로 곰팡이 분류에 이용할 수 있다.Slide culture를 이용하여 Aspergillus속(5종'), Pemcillium 소6종), Rhizopus속 등 10속 19종을 관찰하였으며 그 중에서 몇몇의 형태학적 관찰시균의 특징은 다음과 같다.
또한, Slideculture법을 이용하여 배양 1일 후부터 현미경으로 관찰하였고, microscopic features인 포자의 형태, 색깔, 격벽의 유무 및 분생자병 등의 미세구조를 관찰하였으며, 이를 바탕으로 곰팡이 분류에 이용할 수 있다.Slide culture를 이용하여 Aspergillus속(5종'), Pemcillium 소6종), Rhizopus속 등 10속 19종을 관찰하였으며 그 중에서 몇몇의 형태학적 관찰시균의 특징은 다음과 같다.
국내에서 제조되거나 수입된 곡자, 입국을 시중에서 유상수거 또는 무상 분양받아 총 21건에 대해 slide culture시험법을 이용하여 잡균의 오염실태를 조사하였다. 기존의 식품첨가물의 잡균 시험법과는 달리 곰팡이 미세구조 의 형태적 관찰이 용이함을 확인하였다.
대상 데이터
확립된 slide culture법이 Penicillium 속 외의 곰팡이 균주의 형태학적 관찰에도 유용하게 이용될 수 있는지 검토하기 위해 식품관련 대표적 곰팡이를 문헌조사하고, KoreanCollection for Type Cultures (KCTC)에서 각 곰팡이 종을 분양받아 slide culture를 이용하여 현미경 특징을 관찰하였다. 식품에 관련된 대표적 곰팡이 중에서 곰팡이 생산균주들을 중심으로 Asperg#us속(5종), Penicillium속종'), Rhizopus속(4종)등 16속 28종을 분양받아 관찰하였으며, 각 균주의 최적배지와 배양온도는 Table 2와 같다. 국내 유통되는 곡자, 입국 모니터링으로 잡균(PeniciHium 속)의 오염실태조사 새로운 시험법을 이용하여 수입 또는 국내 유통되는 곡자, 입국 등을 수거하여 황국, 백국 등과 잡균의 형태학적 특징 및 미세구조를 비교하여 잡균의 오염실태를 조사하였다.
이론/모형
14. Microscopic appearance of Aspergillus kawachii(A), Aspergillusoryae(B), Rhizopus 속 and Aspergilllus 속 (C), Rhizopus 속 (D) from koji, using slide culture method.
성능/효과
이와는 달리, Slide culture 방법을 이용한 경우 슬라이드 상의 Agar block에서 대략적인 특유의 균총 색깔이나, 향기, 색소분비 등을 관찰할 수 있어 황국에서 푸른색의 잡균의 오염여부를 육안으로 확인하는데 용이하였다. 또한 현미경으로 관찰했을 때는, 분생자와 분생자병, 포자와 포자낭병 및 균사 등의 형태가 삼차원적인 원형을 유지하고 있어 형태학적인 차이를 보이는 황국과 잡균 즉, Penic#ium속 오염여부을 쉽게 확인할 수 있을 것이다(Fig.4).
황국의 현미경상의 특징을 살펴보면, 전형적인 누룩곰팡 이 형태를 보여주고 있으며 국의 잡균인 Pemcillium 속의 곰팡이와는 다른 형태를 확인할 수 있었다. 이 새로운 시험법인 슬라이드 배양이 곰팡이의 형태학적 특징인 포자낭병의 형태, 분생자의 형태, 정낭 및 경자의 형태 및 격벽의 유무 등의 관찰에 용이한 방법임을 알 수 있었고, 식품첨가물공전의 이물 (곰팡이)시험법으로 적용 가능성을 확 인하였다.
황국의 현미경상의 특징을 살펴보면, 전형적인 누룩곰팡 이 형태를 보여주고 있으며 국의 잡균인 Pemcillium 속의 곰팡이와는 다른 형태를 확인할 수 있었다. 이 새로운 시험법인 슬라이드 배양이 곰팡이의 형태학적 특징인 포자낭병의 형태, 분생자의 형태, 정낭 및 경자의 형태 및 격벽의 유무 등의 관찰에 용이한 방법임을 알 수 있었고, 식품첨가물공전의 이물 (곰팡이)시험법으로 적용 가능성을 확 인하였다.
최적 배지상에서의 집락의 특징과 slide culture에서의 현미경 관찰을 통해서 대표적 곰팡이의 구별이 가능하였으며, 이는 slide culture 방법이 국, 종국에서의 잡균 (Penicillium spp.) 뿐만 아니라, 식품에서의 곰팡이 이물검사 등에도 이용될 수 있음을 보여준다.
국내에서 제조되거나 수입된 곡자, 입국을 시중에서 유상수거 또는 무상 분양받아 총 21건에 대해 slide culture시험법을 이용하여 잡균의 오염실태를 조사하였다. 기존의 식품첨가물의 잡균 시험법과는 달리 곰팡이 미세구조 의 형태적 관찰이 용이함을 확인하였다. 그 결과는 Table3과 같았다(Penicillium spp.
결과적으로, 본 연구에서 확립된 slide culture법은 현미경상에서 포자나 포자 생성과정을 관찰할 수 있어, Penicillium속의 오염을 확인하는데 적합한 방법임을 확인하였다. 또한 시중에 유통되고 있는 곡자, 입국의 모니터링을 실시한 결과 Asp아잉llus속과 Rhizopus속을 관찰할 수 있었고 Pexic#ium속의 오염은 관찰되지 않았다.
결과적으로, 본 연구에서 확립된 slide culture법은 현미경상에서 포자나 포자 생성과정을 관찰할 수 있어, Penicillium속의 오염을 확인하는데 적합한 방법임을 확인하였다. 또한 시중에 유통되고 있는 곡자, 입국의 모니터링을 실시한 결과 Asp아잉llus속과 Rhizopus속을 관찰할 수 있었고 Pexic#ium속의 오염은 관찰되지 않았다.
후속연구
현재 곰팡이 분류에 있어 sequencing을 이용하는 방법이 많이 보고되고 있으나 많은 시간이 요구되며 최종적인 확인은 결국 형태학적 관찰에 의존한다. membrane 등의 재료와 새로운 장치를 이용하여 고배율이나 염색을 통해서도 곰팡이 형태의 in situ microscopic examination이 가능함이 보고되고 있으며, 배지에 따른 균사나 포자 형태 등에 대한 논문들이 보고되고 있어, 앞으로 본 연구의 slide culture법에도 적용하여 보완해 나갈 수 있을 것이다. Slide culture 이용한 곰팡이의 형태학적 분류는 식품 제조과정 중이나, 보관 중에 오염되어 인체에 유해할 수 있는 곰팡이를 사전에 검출하여 위해물질로부터 안전을 지키는데 도움이 될 것이다.
식품 중의 곰팡이를 신속 정확히 분리, 동정할 수 있는 슬라이드 배양법은 앞으로 곰팡이 독소 생성 곰팡이의 분리, 분류, 생성억제 방지와 체계적인 모니터링, 고춧가루 내의 곰팡이 연구 등에 많은 도움이 될 것으로 사료된다. 식품 중 곰팡이의 분리 동정을 신속, 정확하게 할 수 있는 slide culture법에 대한 지속적인 연구수행으로, 앞으로 곰팡이 독소연구와 곰팡이 독소의 독성평가, 곰팡이 독소 오염 예방 대책수립에 도움이 될 것이고, 고춧가루 내의 곰팡이검사와 곡류 중의 밀기울을 최근 건강 보조식품에 사용하는 경우가 있으므로 곡류를 사용한 건강보조식품에 대한 모니터링에서도 곰팡이의 형태학적 관찰이 필요할 것으로 사료된다.
식품 중의 곰팡이를 신속 정확히 분리, 동정할 수 있는 슬라이드 배양법은 앞으로 곰팡이 독소 생성 곰팡이의 분리, 분류, 생성억제 방지와 체계적인 모니터링, 고춧가루 내의 곰팡이 연구 등에 많은 도움이 될 것으로 사료된다. 식품 중 곰팡이의 분리 동정을 신속, 정확하게 할 수 있는 slide culture법에 대한 지속적인 연구수행으로, 앞으로 곰팡이 독소연구와 곰팡이 독소의 독성평가, 곰팡이 독소 오염 예방 대책수립에 도움이 될 것이고, 고춧가루 내의 곰팡이검사와 곡류 중의 밀기울을 최근 건강 보조식품에 사용하는 경우가 있으므로 곡류를 사용한 건강보조식품에 대한 모니터링에서도 곰팡이의 형태학적 관찰이 필요할 것으로 사료된다.
정원진 박사 : 곰팡이 분류, http://www.microid.co.kr/lecture/fungi_tax.htm
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