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문제 정의
- 우리나라에서 재배되는 수박, 오이, 호박 등 박과 작물의 대부분이 종자전염성 바이러스인 CGMMV, ZGMMV, KGMMV 3종에 의하여 지속적으로 피해가 발생하고 바이러스의 특성상 집단 민원이 자주 발생하므로 전국적으로 임상진단 요청이 꾸준히 요구되는 실정에 있다. 따라서 박과 작물의 종자 전염성 바이러스의 효과적 진단법 개발이 요구되며 이에 따라 중앙 연구기관 뿐만 아니라 농업현장의 지도 연구기관에서도 누구나 이용할 수 있는 간편하고 정밀하며 빠른 시간 내에 감염여부를 알 수 있는 유전자 진단기술의 필요성이 매우 크므로 박과작물의 종자전염바이러스 3종을 동시에 간편하게 진단할 수 있는 새로운 기술을 국내 최초로 개발하여 보고하고자 한다.
제안 방법
- 유전자 진단을 위한 열처리 조건은 48。。에서 45분, 94℃에서 2분 처리한 후 94℃에서 30초, Tm에서 30초, 721에서 90초 처리를 35회 하였으며 최종적으로 72。。에서 7분 처리하였다. Tm 온도는 55℃, 58℃ 및 60℃, 3 처리로 실험하였다. 전기영동은 1.
- 方em/m加灿a)로부터 분리한 total RNA를 이용한 실험결과 CGMMV-C724, KGMMV-K513, ZGMMV-Z407A의 T11 조합이 최적의 결과를 보였으므로 이 조합을 이용하여 박과 작물 종류별 동시진단 VC/RT-PCR 유전자 진단을 하였다. VC/RT-PCR 동시진단법을 개발하기 위하여 6종의 박과작물에 세가지 바이러스를 각각 접종하여 감염주를 유지하였다. 감염된 박과작물을 즙액 추출 완충액을 넣어 갈아 즙액을 1.
- 1 이었다. 각각의 프라이머는 CGMMV 등 3종 바이러스의 동시진단을 할 경우에 프라이머 간의 간섭현상이 없는 조합을 선발하기 위하여 이용하였다.
- VC/RT-PCR 동시진단법을 개발하기 위하여 6종의 박과작물에 세가지 바이러스를 각각 접종하여 감염주를 유지하였다. 감염된 박과작물을 즙액 추출 완충액을 넣어 갈아 즙액을 1.5 ml 튜브에 넣어 준비 한 후 진단용 프라이머 혼합 조합액 (T11)에 각각의 단독 바이러스를 진단하고 또한 각 작물에 대해 각각의 세 가지 바이러스 즙액을 동량섞어 임의의 3종 바이러스 감염 즙액을 만들어 triplex 진단을 하였다. VC/RT-PCR 유전자진단을 한 결과 박과 작물 종자전염 바이러스 3종류는 감염 식물체로부터 전체 핵산을 분리할 필요없이 식물체 즙액을 직접 PCR 튜브에 직접 처리하여 유전자 진단을 할 경우에도 모두 특이 밴드가 형성되어 진단이 잘 되었다.
- 담배 (N. 方em/m加灿a)로부터 분리한 total RNA를 이용한 실험결과 CGMMV-C724, KGMMV-K513, ZGMMV-Z407A의 T11 조합이 최적의 결과를 보였으므로 이 조합을 이용하여 박과 작물 종류별 동시진단 VC/RT-PCR 유전자 진단을 하였다. VC/RT-PCR 동시진단법을 개발하기 위하여 6종의 박과작물에 세가지 바이러스를 각각 접종하여 감염주를 유지하였다.
- 박과 작물에 발생하는 종자전염 바이러스 3종에 대하여 각각 4개의 프라이머를 제작하였다(Table 1). 프라이머 제작에 이용한 프로그램은 DNASTAR Lasergene 7.
- 박과 작물에 발생하는 종자전염성 막대형 바이러스인 CGMMV, KGMMV, ZGMMV 3종의 단독 및 동시 VC/ RT-PCR 유전자 진단법을 개발하였다. CGMMV 등 3종의 바이러스에 대한 동시진단용 조합선발을 위하여 12 조합 중에서 동시 진단용 프라이머 조합 CGMMV-C724, KGMMV-K513, ZGMMV-Z407A를 선발하였다.
- 박과작물에 종자전염하는 3종 바이러스에 이병된 담배(N. bent/mmiana)에서 Qiagen 키트를 이용하여 전체 핵산을 분리하였으며 이 핵산을 RT-PCR 유전자 진단의 표준으로 이용하였다. 종자전염 바이러스 각각 3종류의 프라이머를 이용하였으며 동시진단을 할 경우 세가지 바이러스를 구별할 수 있도록 증폭산물의 크기를 고려하여 임의로 조합(Table 2)을 만들어 Tm 온도를 55℃, 58℃ 및 60。(2에서 처리하여 진단한 결과 55。。와 58。(2에서 T7과 T8의 조합에서 CGMMV와 KGMMV가 동시에 진단이 되었다(Fig.
- 세가지 바이러스를 동시에 진단할 수 있는 triplex 프라이머 조합 T11 을 이용하여 단독감염 진단과 세 종류의 바이러스 감염 식물체를 동시에 진단하는 VC/RT-PCR을 수행하였다. Fig.
- 즉, CGMMV 프라이머 는 T7에 사용된 C724, KGMMV 프라이머는 T1의 K688, T2, T7 및 T8에 사용된 K513 프라이머, ZGMMV는 T3과 T4에 사용한 Z407A 와 T5와 T6의 Z407B 프라이머이다. 이들을 이용하여 새로운 T10, T11 및 T12 조합(Table 3)을 설정하였으며 동시진단 결과 3종 바이러스가 모두 잘 진단이 된 T11 조합(Fig. 2의 사각형)을 선발하였다(Fig. 2). 이와 같이 만든 조합의 경우에는 Tm 55℃, 58℃ 및 60℃ 모두에서 프라이머간에 간섭작용이 발생하지 않고 동시진단이 가능하였다.
- Tm 온도는 55℃, 58℃ 및 60℃, 3 처리로 실험하였다. 전기영동은 1.2% Agarose 젤을 이용하여 100 V 에서 30분 동안 전기영동하였으며, EtBr로 염색하여 사진 촬영하였다.
대상 데이터
- 분양받은 KGMMV를 이용하였다. CGMMV 등 3종의 바이러스는 담배(Mcc用benthamicma、)를 공통 기주로 이용하여 바이러스 분리주를 보관 및 사용하였으며, 기주 식물인 박과 작물에서의 활용성을 확보하기 위하여, 수박(Cz加"〃"s vulgaris), 박(Lagenaria leucantha), 오이 (Cucumis sativus), 멜론(C. meld), 애호박moschata 'Aihobag'), 쥬키니 호박(C"C"r滅a pepo 'Zucchini')을 감염주로 사용하여 진단에 이용하였다.
- 유전자 진단법을 개발하였다. CGMMV 등 3종의 바이러스에 대한 동시진단용 조합선발을 위하여 12 조합 중에서 동시 진단용 프라이머 조합 CGMMV-C724, KGMMV-K513, ZGMMV-Z407A를 선발하였다. CGMMV 등 3종에 대한 triplex VC/RT-PCR 유전자 진단법은 브匕 수박, 오이, 멜론, 쥬키니 호박, 애호버匕 담배 (TV benthamiana) 작물의 식물체 즙액과 프라이머 간에 간섭현상 없이 특이적으로 진단되었다.
- CGMMV 수박 분리주와 ZGMMV 는 쥬키니호박 분리주(Ryu 등, 2000) 그리고 서울여대에서 분양받은 KGMMV를 이용하였다. CGMMV 등 3종의 바이러스는 담배(Mcc用benthamicma、)를 공통 기주로 이용하여 바이러스 분리주를 보관 및 사용하였으며, 기주 식물인 박과 작물에서의 활용성을 확보하기 위하여, 수박(Cz加"〃"s vulgaris), 박(Lagenaria leucantha), 오이 (Cucumis sativus), 멜론(C.
- 1). 프라이머 제작에 이용한 프로그램은 DNASTAR Lasergene 7.1 이었다. 각각의 프라이머는 CGMMV 등 3종 바이러스의 동시진단을 할 경우에 프라이머 간의 간섭현상이 없는 조합을 선발하기 위하여 이용하였다.
성능/효과
- CGMMV 등 3종의 바이러스에 대한 동시진단용 조합선발을 위하여 12 조합 중에서 동시 진단용 프라이머 조합 CGMMV-C724, KGMMV-K513, ZGMMV-Z407A를 선발하였다. CGMMV 등 3종에 대한 triplex VC/RT-PCR 유전자 진단법은 브匕 수박, 오이, 멜론, 쥬키니 호박, 애호버匕 담배 (TV benthamiana) 작물의 식물체 즙액과 프라이머 간에 간섭현상 없이 특이적으로 진단되었다.
- 3). KGMMV-K513 프라이머로 단독 진단한 경우에는 KGMMV 특이 밴드가 형성되었으며 (Fig. 4) ZGMMV-Z407A 프라이머를 이용한 단독 진단의 경우에는 ZGMMV와 KGMMV가 동시에 진단되어 KGMMV 바이러스 접종원으로 사용한 분리 주가 오염되어 있었으나 각각의 바이러스 특이 밴드가 형성되어 특이성이 인정되었고 프라이머 간의 간섭작용이 나타나지 않았다(Fig. 5). 박과 작물 종자전염 막대형 바이러스의 프라이머들은 단독 진단에서 특이성을 나타내었고 박과 작물 종류에 따라 어떠한 간섭작용도 나타나지 않아 VC/RT-PCR 유전자 진단에 이용하는데 적합하였다.
- 5 ml 튜브에 넣어 준비 한 후 진단용 프라이머 혼합 조합액 (T11)에 각각의 단독 바이러스를 진단하고 또한 각 작물에 대해 각각의 세 가지 바이러스 즙액을 동량섞어 임의의 3종 바이러스 감염 즙액을 만들어 triplex 진단을 하였다. VC/RT-PCR 유전자진단을 한 결과 박과 작물 종자전염 바이러스 3종류는 감염 식물체로부터 전체 핵산을 분리할 필요없이 식물체 즙액을 직접 PCR 튜브에 직접 처리하여 유전자 진단을 할 경우에도 모두 특이 밴드가 형성되어 진단이 잘 되었다. CGMMV-C724 프라이머를 이용한 단독 진단의 경우 쥬키니 호박(6번)은 CGMMV가 비 기주이므로 감염되지 않아 밴드가 형성되지 않았다(Fig.
- 1997년에 수박에 CGMMV 가 전국적으로 463 ha 발생하여 막대한 경제적 손실이 발생하였으며 이때 발생한 바이러스 전염원은 중국에서 생산하여 수입한 수박 대목용 박이었다. 그 후 2002년 논산과 창원지역에서 재배한 수박 21 ha에 CGMMV7} 발생하였으며 이때 사용한 수박 종자는 바이러스에 감염되지 않았으나 대목용 박 종자의 CGMMV 감염률이 약 83%로 병 발생의 중요한 역할을 하였다. 또한 2004년과 2005년에 걸쳐 서 천, 논산, 전주지역 15 ha의 수박에 CGMMV가 발생하였으며 발생한 바이러스는 CGMMV 뿐만 아니라 진딧물 전염 바이러스인 WMV2 복합감염되어 피해가 더욱 컸었다(미발표 자료).
- 하는데 보통 1일-2일 이상 소요된다. 그러나 핵산 분리 과정이 필요없는 VC/RT-PCR 유전자 진단기술을 이용하여 식물체 즙액을 직접 PCR 튜브에 처리하므로 3- 4시간 내에 바이러스 진단이 가능하고 박과 작물에 피해를 일으키는 종자전염 바이러스 CGMMV, KGMMV, ZGNMN를 매우 간편하고 빠르게 동시에 진단할 수 있으며 진단 비용도 절감할 수 있다.
- 5). 박과 작물 종자전염 막대형 바이러스의 프라이머들은 단독 진단에서 특이성을 나타내었고 박과 작물 종류에 따라 어떠한 간섭작용도 나타나지 않아 VC/RT-PCR 유전자 진단에 이용하는데 적합하였다.
후속연구
- 6은 바이러스에 감염된 담배, 오이, 멜론, 호박, 수박의 모든 식물체를 이용한 동시 진단할 결과는 단독 진단 결과와 같이 담배(1AI), 오이(2BII), 멜론 (3CⅢ) 그리고 쥬키니호박(4DIV) 모두 프라이머 특이성이 나타났으며 식물체 종류에 의한 간섭작용이 일어나지 않았다. 다만 쥬키니 호박의 경우 CGMMV에 대해 비 기주로 알려져 있으나 감염이 오래 지속되자 CGMMV가전신감염 되어 이에 대한 보다 정확한 연구가 필요하겠다.
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