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문제 정의
- 본 연구는 고구마 끝순의 채소적 가치를 구명키 위하여, 끝순 추출물의 페놀화합물 함량, 식중독균인 Listeria monocytogenes, Salmonella Typhimurium에 대한 항균 활성, 그리고 식품안전성과 관련된 돌연변이원성 및 항돌연변이원성 등을 조사하였다.
제안 방법
- 고구마 끝순 EtOH 추출물의 용매분획별 항균 활성을 조사하기 위하여 예비실험을 한 결과 항균활성을 나타냈던EtOAc 및 BuOH 추출물을 ethyl alcohol에 1, 2, 5, 10 mg/disk 농도로 희석하여 항균활성을 측정하였다. 추출물의 농도가 높아질수록 항균활성 효과가 증가하였고, 용매분획 별로는 buthyl alcohol에 비하여 ethyl acetate에서 다소 높은 항균활성을 나타냈다(Table 4).
- 고구마 끝순의 돌연 변이원성은 Salmonella Typhimurim 변이균주인 TA 98과 TA100을 이용하여 Maron방법(Ames & Maron, 1983)을 변형하여 실시하였다. 물질대사를 활성화시키지 않는 직접법의 경우 standard plate incorporation test로 시행하였다.
- 고구마 용도 다양화와 지상부의 채소적 가치를 구명키 위하여, 괴근에서 자라난 싹 중 부드러운 잎과 잎자루를 포함한 줄기끝 10 cm의 끝순을 수확하여, 끝순 추출물의 페놀화합물 함량, 식중독균인 Listeria monocytogenes, Salmonella Typhimurium에 대한 항균 활성, 식품안전성과 관련된 돌연변이원성 및 항돌연변이원성 등을 조사한 결과는 다음과 같다.
- 6)하였고, 남은 잔사에 80% MeOH 200 ml를 가하여 동일한 방법으로 2회 반복 추출하였다. 또한 조추출물을 분액여두에서 n-hexane, chloroform, ethyl acetate, butanol, water 등의 용매를 사용하여 극성도에 따라서 순차분획하고 저온감압원심분리기 (UNIVAPO 100H, Uniequip Co., Germany)로 농축하여 용 매별 획분을 얻었다(Fig. 1)
- 멸균된 glass cap tube에 추출된 시료 1.25, 2.5 mg/plate을 가하고 이어서 변이원물질을 각각 50 ㎕씩 첨가하였다. 여기에 전배양시킨 Salmonella Typhimurim TA 98 또는 TA 100을 100 ㎕ 를 가한 다음 0.
- 미생물 L. monocytogenes KCTC 3569와 S. Typhimurium KCTC 2515를 TSB에 18시간 키운 균주를 약 1.3xl02 CFU/ m/이 되게 준비하고, 추출시료는 0.1 m2씩 TSB배지 10 m/에넣은 후 4시간마다 배양액을 채취하여 Butterfielde phosphate buffer에 10배로 희석한 후 TSA 배지에 0.1 m/ 분주하여 spread 하고 37 ℃ incubatoi에서 24시간 배양한 후 균수를 조사하였다.
- 미생물 Listeria monocytogenes KCTC 3569와 Salmonella Typhimurium KCTC 2515를 Tryptic Soy Broth(TSB) 너H 지에서 18시간 키운 다음, 균주를 약 lxl08 CFU/m/ 되게 희석하여 Tryptic Soy Agar(TSA) petri dish에 0.1 m/씩 분주하고 spread하였다. 상온에서 약 30분간 TSA plate를 건조시 킨후 멸균된 paper disk(직경 8 mm, Toyo Roshi Kaisha, Ltd)를 놓고, 용매별로 추출한 시료를 각기 농도를 달리하여 10 ㎕씩 점적한 다음 공기 중에서 용매를 완전히 건조시켰다.
- 이때 각 용매들을 대조구로 사용하였다. 시료를 loading시킨 petri dish를 상온에서 30분간 방치한 후 뒤집어서 30℃ 배양기에서 24시간 배양한 후 Vernier calipers(Califers, Mitutoyo Co., Japan)를 이용하여 성장 저해환의 직경을 측정하였다.
- 용매별로 추출한 시료(Fig. 1)를 농도별(5, 10, 20 mg/mZ) 로 희석하였다. 희석 용매는 BuOH 및 EtOAc는 그 자체로 액체배지 상에서 미생물에 대한 강한 inhibition을 가지므로 ethyl alcohol에 희석하여 시료로 사용하였다.
- 4)로 전체 700 ㎕가 되도록 하였다. 이것을 37℃ 에서 20분간 진탕배양한 후상기의 돌연변이원성 실험과 같은 방법으로 실험하여 생긴 복귀돌연변이수를 세어 항돌연변이 작용을 살펴보았다. 고구마 끝순의 농도와 변이원물질의 농도는 예비실험을 통하여 결정하였으며, 항돌연변이 활성은 변이원물질의 활성에 대한시료의 억제율(inhibition, %)로 표현하였다<FDA, 1995).
- 상온에서 약 30분간 TSA plate를 건조시 킨후 멸균된 paper disk(직경 8 mm, Toyo Roshi Kaisha, Ltd)를 놓고, 용매별로 추출한 시료를 각기 농도를 달리하여 10 ㎕씩 점적한 다음 공기 중에서 용매를 완전히 건조시켰다. 이때 각 용매들을 대조구로 사용하였다. 시료를 loading시킨 petri dish를 상온에서 30분간 방치한 후 뒤집어서 30℃ 배양기에서 24시간 배양한 후 Vernier calipers(Califers, Mitutoyo Co.
- 4)로 전체 700 ㎕가 되도록 하였다. 이를 37℃ 에서 20분간 진탕 배양한 후 His/Bio이 첨가된 2 m/ Top Agar (45℃)에 넣고 잘 혼합한 후 미리 조제해 놓은 minimal glucose agar plate위에 도말한 후 37℃에서 48시간 배양하여 생긴 복귀돌연변이(His* revertant colony)수를 조사하여 돌연 변이원성의 유무를 판정하였다.
대상 데이터
- 2는 Oxoid(England)에서 구입하였다. Histidine, biotin을 비롯한 사용된 모든 시약은 Sigma-Aldrich회사(U.S.A.)에서 구입하였다.
- 시험재료는 작물과학원 목포시험장 포장에 고구마 하얀미 품종을 직파하여 괴근에서 자라난 싹 중 부드러운 잎과 잎자루를 포함한 줄기끝 10 cm의 끝순을 수확하여 동결건조(SFDSM12, Samwon Co., Korea)한 후 시험재료로 사용하였다.
- 실험 미생물은 균주 Salmonella Typhimurium 변이 균주 중 frame shift 변이균주인 TA 98과 base-pair substitution 변이균주인 TA100은 Moltox회사(Boone, NC, U.S.A.)로부터 구입하여 Ames(1975)의 방법에 따라 histidine 요구성, deep rough(rfa) 돌연변이, crystal violet 감수성, UV 감수성 (zzvrB), R-fhctor에 의한 ampicillin 내성, 자연발생 복귀 돌연변이수 등의 유전적 특징을 확인한 후에 본 실험에 이용하였다.
- 실험 시약은 직접 돌연변이원으로(direct mutagen) 2-Amino fluorene(2-AF), 2-Nitro fluorene(2-NF), methyl methane sulfonate(MMS)와 균주 및 양성 돌연변이물질을 용해 및 희석하는데 사용된 DMSO는 Sigma-Aldrich(U.S.A)에서, Vogel- onner minimal glucose agar plate, top agar, nutrient broth 및 bacto agar는 Difbo(USA)에서, 그리고 Oxoid nutrient No. 2는 Oxoid(England)에서 구입하였다. Histidine, biotin을 비롯한 사용된 모든 시약은 Sigma-Aldrich회사(U.
- 1에서 용매별로 추출한 시료를 여러 비율(1, 2, 5, 10 mg/m/)로 추출용매로 희석하였다. 예비 실험 결과 hexane, chloroform, water extracts는 항균활성이 나타나지 않았기 때 문에, 활성을 보였던 butanol 및 ethyl acetate 추출물를 시료로 사용하였다.
- )로 여과하고 Table 1 의 분석조건으로 함량을 분석하였다. 페놀화물분석을 위하여 표준품은 gallic acid, chlorogenic acid, gentisic acid, caffeic acid, cumaric acid, ferulic acid, benzoic acid, syringic acid, salicylic acid, tannic acid 등 10종을 Sigma사로부터 구입하였다.
이론/모형
- Ames Assay를 개량한 preincubation법에 따라 항 돌연변이원성을 실험하였고 돌연변이 유발물질로 TA98을 위해서는 2-NF, TA100균주를 위해서는 MMS을 사용하였다. 멸균된 glass cap tube에 추출된 시료 1.
- 1983)을 변형하여 실시하였다. 물질대사를 활성화시키지 않는 직접법의 경우 standard plate incorporation test로 시행하였다. 멸균된 glass cap tube에 추출된 시료 1.
성능/효과
- 1. 고구마 끝순에는 6종의 페놀화합물이 함유되어 있었으며, 그 중 chlorogenic acid와 caffeic acid의 함량이 총페놀함량의 89~93%로 대부분을 차지하였다. 또한 용매분획별 페놀화합물 함량은 ethyl acetate 및 buthyl alcohol 추출물이 다른 용매추출물에 비하여 월등히 높았다.
- 2. 고구마 끝순의 80% ethanol 조추출물의 수율은 12.5 g 이 었고, 용매분획별로는 water 분획물이 8.9 g으로 가장 많았으며, 다음은 chloroform 분획물이 1.6 g이었고, 나머지 용매분획물은 0.7 ~ 1.1 g의 수율을 나타내었다.
- 3. 고구마 끝순에는 6종의 페놀화합물이 함유되어 있었으며, 그 중 chlorogenic acid와 caffeic acid의 함량이 총페놀함량의 89 ~93%로 대부분을 차지하였다. 또한 용매분획별 페놀화합물 함량은 ethyl acetate 및 buthyl alcohol 추출물이 다른 용매추출물에 비하여 월등히 높았다.
- 4. Listeria monocytogenesethyl acetate 및 buthyl al-coh이 추출물을 첨가한 결과 16시간까지는 3 log 이상 균의성장을 억제하였으며 특히 20 mg/ml butanol 추출물은.균의성장을 억제시키다 12시간 이후에는 완전히 균을 사멸시키는것으로 나타났다.
- 5. 고구마 끝숱 추출물의 Salmonella Typhimurium TA98및 TA100에 대한 돌연변이 활성을 조사한 결과 TA98은 29~33 CFU/plate이었고, TA100은 159~ 188 CFU/plate로 돌연변이 활성이 없었다.
- 6. 직접 돌연변이원 물질인 2-NF와 MMS를 처리하여 복귀돌연변이수를 측정한 결과 ethyl acetate 및 buthyl alcohol에서 돌연변이로 인한 복귀변이원성 집락수가 낮게 나타남으로써 고구마 끝순 추출물이 항돌연변이 활성이 있는 것으로 나타났다.
- 3과 같았다. Listeria monocytogenes에 대한 EtOAc추출물 첨가에서는 12시간 까지는 3 log 이상 균의 성장을 억제 시켰으며 24 시간 배양 후에도 대조구에 비하여 끝순 추출물 첨가가 1~1.5 log 균수의 억제를 하는 것으로 나타났다. 또한 BuOH 주출물을 이용한 경우 20 mg/m/ 농도에서는 12시간이 경과하면서 Listeria 균이 완전히 사멸되었고, 10 mg/m/ 농도에서도 8시간까지는 균의 성장을 억제하며 긴 lag phase를 보이다가 이후 균의 성장이 서서히 이루어 졌으나 대조군과 비교하여12시간 후 3 log 이상 억제를 시킨 것으로 나타났으며, 5 mg/ m/의 추출물 농도에서도 10 mg/m/ 추출물의 경우와 균의 성장 억제에 비슷한 양상을 보여주었다(Fig.
- Salmonella Typhimurium TA98 및 TA 100에 대한 돌연변이 활성을 조사한 결과(Table 6), TA98은 모든 첨가구에서29~33 CFU/plate이었고, TA100 또한 159-188 CFU/plate로 Table 5에서 나타난 자연발생 복귀수와 큰 차이가 없어 돌연변이 활성이 없는 것으로 나타났다.
- 고구마 끝순 추출물의 돌연변이원성 억제 작용을 검토하기 위해 Ames test에서 양성반응을 나타내며 돌연변이를 유발하는 직접 변이원 물질인 2-NF와 MMS를 처리하여 복귀돌연변이수를 측정한 결과 5가지 추출물 중 ethyl acetate 및 buthyl alcohol에서 돌연변이로 인한 복귀변이원성 집락수가 낮게 나타남으로써 항돌연변이 활성이 있는 것으로 판단되었다(Table 7).
- , 2002). 고구마 끝순추출물을 분석한 결과 10종의 페놀화합물 중 chlorogenic acid와 caffeic acid가 특히 많이 함유된 것으로 보아 금후 기능성 채소로 이용 가능성이 있음을 알 수 있다.
- Listeria monocytogenesethyl acetate 및 buthyl al-coh이 추출물을 첨가한 결과 16시간까지는 3 log 이상 균의성장을 억제하였으며 특히 20 mg/ml butanol 추출물은.균의성장을 억제시키다 12시간 이후에는 완전히 균을 사멸시키는것으로 나타났다. Salmonella Typhimurium에 대해서도 고구마 끝순 추출물은 0.
- 돌연변이 및 항돌연변이원성을 검정하기 전에 실험에 사용할 균주인 Salmonella Typhimurium TA98과 TA 100 변이 균에 대한 유전적인 특성을 확인한 결과 Fig. 4와 같이 histidine 요구성이며, 또한 amphicillin 항생제에 저항성을 나타내며, crystal violet에 감수성이 있는 것으로 보아 변이균임이 확인되 었다.
- 5 log 균수의 억제를 하는 것으로 나타났다. 또한 BuOH 주출물을 이용한 경우 20 mg/m/ 농도에서는 12시간이 경과하면서 Listeria 균이 완전히 사멸되었고, 10 mg/m/ 농도에서도 8시간까지는 균의 성장을 억제하며 긴 lag phase를 보이다가 이후 균의 성장이 서서히 이루어 졌으나 대조군과 비교하여12시간 후 3 log 이상 억제를 시킨 것으로 나타났으며, 5 mg/ m/의 추출물 농도에서도 10 mg/m/ 추출물의 경우와 균의 성장 억제에 비슷한 양상을 보여주었다(Fig. 2).
- 대략 180 CFU/plate이었다. 또한 돌연변이 유발원(MMS, 2-NF)을 첨가한 결과 TA98은 4, 452 CFU/plate, TA100은 2, 123 CFU/plate 이었다.
- 차지하였다. 또한 용매분획별 페놀화합물 함량은 ethyl acetate 및 buthyl alcohol 추출물이 다른 용매추출물에 비하여 월등히 높았다(Table 3). 식물체에 존재하는 phen이성 물질의 구조는 1,000여 종 이상으로 보고되고 있는데, 수산기로 치환된 방향족 화합물을 가지고 있어 인체 내에서 생성된 활성 산소를 제거함으로써 질병과 노화을 방지할 수 있는기능성이 보고되고 있다(Kim & Kim, 1977).
- 고구마 끝순에는 6종의 페놀화합물이 함유되어 있었으며, 그 중 chlorogenic acid와 caffeic acid의 함량이 총페놀함량의 89~93%로 대부분을 차지하였다. 또한 용매분획별 페놀화합물 함량은 ethyl acetate 및 buthyl alcohol 추출물이 다른 용매추출물에 비하여 월등히 높았다.
- 이상과 같은 결과를 살펴볼 때 고구마 끝순에는 돌연변이유발원 같은 독성이 없으면서, 체내 세포에 직접영향을 미치는 직접돌연변이대한 억제효과도 인정되어 식용으로 사용할 경우 안전성이 있는 것으로 판단되었으며, 이와 같은 결과는Yoshimoto et a/.(2002)의 보고와 같이 고구마 끝순에 풍부하게함유된 polyphenolic compound의 생리활성 효과로 사료된다.
- 자연발생 복귀 특성을 확인한 결과(Table 5) TA98은 rever- tant 집락수가 약 30 CFU/plate이 었고, TA100은 revertant 집락수가 대략 180 CFU/plate이었다. 또한 돌연변이 유발원(MMS, 2-NF)을 첨가한 결과 TA98은 4, 452 CFU/plate, TA100은 2, 123 CFU/plate 이었다.
- 위하여 예비실험을 한 결과 항균활성을 나타냈던EtOAc 및 BuOH 추출물을 ethyl alcohol에 1, 2, 5, 10 mg/disk 농도로 희석하여 항균활성을 측정하였다. 추출물의 농도가 높아질수록 항균활성 효과가 증가하였고, 용매분획 별로는 buthyl alcohol에 비하여 ethyl acetate에서 다소 높은 항균활성을 나타냈다(Table 4).
- 표준물질로 사용된 10종의 페놀화합물 중 고구마 끝순에는 6종의 페놀화합물이 함유되어 있었으며, 그 중 chlorogenic acid와 caffeic acid의 함량이 총페놀함량의 89 ~93%로 대부분을 차지하였다. 또한 용매분획별 페놀화합물 함량은 ethyl acetate 및 buthyl alcohol 추출물이 다른 용매추출물에 비하여 월등히 높았다(Table 3).
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