본 연구는 돼지 체외수정란 생산효율을 향상시켜 돼지의 품종개량, 형질전환 돼지생산 등과 멸실위험에 처해 있는 유전자원의 보존을 위한 기술로 활용하기 위해 미성숙 난포란의 적정 체외성숙 시간을 알아보고, 배양액의 종류 및 체외 배양시의 산소 농도에 따른 체외수정란의 생산 효율을 확인한 결과는 다음과 같다. 1. 돼지 미성숙 난포란의 체외성숙 시간별 제2감수분열중기(M II)까지 성숙된 비율이 체외성숙 38, 40, 42시간째에 각각 61.1%, 42.9% 및 69.6%를 나타내어 그 비율이 70% 미만으로 낮은 반면, 체외성숙 44, 46, 48시간째에 각각 73.7%, 94.1% 및 100%의 체외성숙률을 나타내어 최소한 44시간 이상의 체외성숙이 필요한 것으로 조사되었다. 2. 체외배양액의 종류에 따른 배반포 발달률이 NCSU-23 18.8%, PZM-5 16.3%를 나타내어 유의적인 차이를 보이지 않았으며(p>0.05), 산소분압에 따른 배반포 발달률이 5% 산소분압에서 11.9%, 20%의 산소분압에서 15.8%를 나타내어 두 군간의 유의한 차이는 보이지 않았다(p>0.05). 3. 체외배양 7일째 발달된 배반포 수정란의 총세포수는 40개 내 외를 나타내었다. 이상의 결과, 돼지 미성숙 난포란의 체외성숙 시간은 44시간 정도가 적정한 것으로 확인되었으며, 서로 다른 배양액과 산소농도가 돼지 체외수정란의 배발달에 있어서 유의적인 차이를 나타내지는 못하였다.
본 연구는 돼지 체외수정란 생산효율을 향상시켜 돼지의 품종개량, 형질전환 돼지생산 등과 멸실위험에 처해 있는 유전자원의 보존을 위한 기술로 활용하기 위해 미성숙 난포란의 적정 체외성숙 시간을 알아보고, 배양액의 종류 및 체외 배양시의 산소 농도에 따른 체외수정란의 생산 효율을 확인한 결과는 다음과 같다. 1. 돼지 미성숙 난포란의 체외성숙 시간별 제2감수분열중기(M II)까지 성숙된 비율이 체외성숙 38, 40, 42시간째에 각각 61.1%, 42.9% 및 69.6%를 나타내어 그 비율이 70% 미만으로 낮은 반면, 체외성숙 44, 46, 48시간째에 각각 73.7%, 94.1% 및 100%의 체외성숙률을 나타내어 최소한 44시간 이상의 체외성숙이 필요한 것으로 조사되었다. 2. 체외배양액의 종류에 따른 배반포 발달률이 NCSU-23 18.8%, PZM-5 16.3%를 나타내어 유의적인 차이를 보이지 않았으며(p>0.05), 산소분압에 따른 배반포 발달률이 5% 산소분압에서 11.9%, 20%의 산소분압에서 15.8%를 나타내어 두 군간의 유의한 차이는 보이지 않았다(p>0.05). 3. 체외배양 7일째 발달된 배반포 수정란의 총세포수는 40개 내 외를 나타내었다. 이상의 결과, 돼지 미성숙 난포란의 체외성숙 시간은 44시간 정도가 적정한 것으로 확인되었으며, 서로 다른 배양액과 산소농도가 돼지 체외수정란의 배발달에 있어서 유의적인 차이를 나타내지는 못하였다.
During in vitro culture of mammalian oocytes and embryos, the cells are exposed to the risks that cause cell injury or death. Numerous studies have been reported that the cell injury may be induced by the action of free radicals generated by auto-oxidation. This study was undertaken to investigate t...
During in vitro culture of mammalian oocytes and embryos, the cells are exposed to the risks that cause cell injury or death. Numerous studies have been reported that the cell injury may be induced by the action of free radicals generated by auto-oxidation. This study was undertaken to investigate the optimal culture condition system for in vitro culture of porcine embryos. We first evaluated the effect of culture media on the porcine embryo development. NCSU-23 and PZM-5, culture medium tested, were failed to produce significant difference on the rate of blastocyst formation. In NCSU-23, the developmental rate was slightly higher than that in PZM-5. During in vitro maturation (IVM), fertilizaton (IVF), and culture (IVC) under 5 or 20% oxygen ($O_2$), the rates of cleavage and development were insignificantly different from each other under our culture condition (20% $O_2$, in NCSU-23), the mean cell number per blastocyst was $40{\pm}10$. These results showed that medium and $O_2$ concentration had no significant effect on the development of porcine embryos.
During in vitro culture of mammalian oocytes and embryos, the cells are exposed to the risks that cause cell injury or death. Numerous studies have been reported that the cell injury may be induced by the action of free radicals generated by auto-oxidation. This study was undertaken to investigate the optimal culture condition system for in vitro culture of porcine embryos. We first evaluated the effect of culture media on the porcine embryo development. NCSU-23 and PZM-5, culture medium tested, were failed to produce significant difference on the rate of blastocyst formation. In NCSU-23, the developmental rate was slightly higher than that in PZM-5. During in vitro maturation (IVM), fertilizaton (IVF), and culture (IVC) under 5 or 20% oxygen ($O_2$), the rates of cleavage and development were insignificantly different from each other under our culture condition (20% $O_2$, in NCSU-23), the mean cell number per blastocyst was $40{\pm}10$. These results showed that medium and $O_2$ concentration had no significant effect on the development of porcine embryos.
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문제 정의
그러나 돼지 난자의 체외성숙과 배발달에 있어서 적절한 체외배양 조건은 연구자들에 따라 그 결과가 동일하지 않다. 따라서 본연구는 돼지 미성숙 난포란의 체외발달에 적합한 배양조건을구명하고자 실시하였다.
많은 연 구자들은 양질 의 돼 지 체 외수정 란 확보를 위 하6 불완전한 체외배양 조건을 개선하고자 하였다. Cosby 등(1988) 과 Joenje(1989)는 돼지 체외수정란 생산이 어려운 이유를 처외배양 시 수정란이 높은 농도의 산소에 노출되기 때문이라 고 설명하였는데, 수정란의 체외배양은 난관 내보다 높은 *소농도에 노출되 기 때문에 과량의 활성 산소(reactive oxyge i species, ROS)가 발생되고, 이들 유리산소기(oxygen free ra-dical)들은 산화 스트레스를 초래하여 미토콘드리아의 호흡 ? 제 작용, 세포막의 유동성 감소, 각종 효소의 불활성화 ?: DNA와 RNA의 손상을 초래하는 등 난포란의 성숙 및 체외발달을 저해하는 것으로 알려져 있다.
본 연구는 돼지 체외수정란 생산효율을 향상시켜 돼지의 품종개량, 형질전환 돼지생산 등과 멸실위험에 처해 있는 유 전자원의 보존을 위한 기술로 활용하기 위해 미성숙 난포란의 적정 체외성숙 시간을 알아보고, 배양액의 종류 및 체외 배양 시의 산소 농도에 따른 체외수정란의 생산 효율을 확인한 결과는 다음과 같다.
본 연구는 양질의 돼지 체외수정란 생산을 위한 체외배양체계를 개선하기 위한 일환으로 배양액 및 산소농도의 효과를 조사하였다. 돼지 체외수정 란 배 양시 배 양액과 산소농도는 배 발달에 있어서 유의한 차이를 보이지 않았다.
제안 방법
1% BSA가 첨가된 mTBM에서 이루어졌다. 44시간 동안 체외성숙된 돼지 난포란은 0.1% hyaluronidase가 함유된 D-PBS 용액에 넣어 난구세포를 제거하고 mTBM 용액으로 세 정 하였다. 세정 후, 30개의 성숙 난자는 수정용 mTBM 100 ul 소적에서 정자 주입 시까지 배양되었다.
1% 및 100%의 체외성숙률을 나타내어 최소한 44시간 이상의 체외성숙이 필요한 것으로 조사되었다. 46시간 또는 48시간의 성숙 시간은 높은 비율의 MU 난자를얻을 수는 있지만 난자의 노화를 초래할 수 있기 때문에 본 연구에서는 체외성숙 시간을 44시간으로 고정하였다. Fig.
염색방법으로는 PI 염색을 실시하기 전 배반포를 4% paraformaldehyde에 30분간 정치시켜 고정시킨 후, 고정된 배반포를 유리 슬라이드에 올려놓고 PBS로 배반포를 세정한 후 PI와 RNase를 함께 처리하여 30분간 배양하였다. PBS로 수정란을 세정한 후 커버를 덮어 배반포가 움직이지 않도록 눌러서 공초점 현미경(Olympus, Tokyo, Japan)으로 총세포수를 계산하였다.
돼지 난포란을 5%와 20% 산소분압에서 체외성숙 및 체외수정시킨 후 체외 발달시켜 난할률과 배반포 발달률을 조사하였다. Fig.
체외배양하였다(Table 1). 돼지 미성숙 난포란을 호르몬이첨가된 NCSU-23 배양액에서 22시간 배양시킨 후 호르몬이없는 NCSU-23 배양액으로 옮겨 16시간에서 26시간까지 배양하였다.
돼지 미성숙 난포란의 체외성숙 시간을 결정하기 위하여 38시간부터 48시간까지 성숙 시간을 달리하여 미성숙 난포란을 체외배양하였다(Table 1). 돼지 미성숙 난포란을 호르몬이첨가된 NCSU-23 배양액에서 22시간 배양시킨 후 호르몬이없는 NCSU-23 배양액으로 옮겨 16시간에서 26시간까지 배양하였다.
회수한 난자는 TALF-HEPES 배양액으로 3희 세정하고, 체외성숙용 배양액으로 1희 세정하였다. 세정된 미성숙 난포란을 4-well dish 각 well당 50개씩 넣어 39.0℃, 20%의 산소가 공급되는 배양기(95% air, 5% CO2) 또는 39.0℃, 5% 산소가 공급되는 배양기(90% N2, 5% 6, 5% CO2)에서 배양하였다. 호르몬이 첨가된 배양액에서 22시간 배양한 후, 호르몬만을 제외한 배양액으로 옮겨 22~26시간 더 배양하였다.
수정능이 획득된 활력도가 높은 정자의 최종농도를 1.5 X 102 * * 5 sperm/ml로 조정하여 수정용 소적에 넣어 6시간 동안 39.0 ℃ 의 5% CO2 또는 5% 02 배양기에서 수정을 유도하였다.
도축 즉시 난소를 적출하여 100 units/ ml의penicillin G와 100 “g/ml의 streptomycin 함유된 30 ℃ 내외의 생리식염수에 담아 1-2시간 내에 실험실로 운반하였다. 운반된 난소는 불필요한 조직을 잘라낸 후 항생제가 첨가된 생리식염수로 3-4회 세척한 후 18 gauge 주사 바늘이 부착된 10 ml 주사기를 이용하여 흡입법(aspiration)으로 난포란을 채취하였다. 채취한 난포란은 Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (D-PBS)에 0.
아 실험실로 운반한 후 정소상체 미부의 정액으로부터 분리하였다. 채취된 정액은 0.1% BSA가 함유된 D-PBS 용액을 이용하여 1,500 rpm에서 5분간 2-3회 원심분리하여 정장물질 및 오염물을 제거하였다. 세정 후 하단에 남은 정자 침전물에 modified Tris-buffered medium(mTBM) 배양액을 넣어 39.
체외배양 3일 후 수정란을 10% fetal bovine serum (FBS)이 함유된 NCSU-23 배양액으로 옮겨 배양하였다. 체외 배 발달의 확인은 체외수정 후 2일째에 난할률을, 7일째에 배반포 발달률을 조사하였다.
체외배양 7일째 발달된 배반포를 PI 염색법을 이용하여 배반포의 총세포수를 조사하여 40개 내 . 외의 총 세포수를 확인할 수 있었다(Fig.
체외배양 7일째 생산된 배반포는 propidium iodide(PI)로염색을 하여 총세포수를 조사하였다. 염색방법으로는 PI 염색을 실시하기 전 배반포를 4% paraformaldehyde에 30분간 정치시켜 고정시킨 후, 고정된 배반포를 유리 슬라이드에 올려놓고 PBS로 배반포를 세정한 후 PI와 RNase를 함께 처리하여 30분간 배양하였다.
1% polyvinyl alcohol(PVA)o] 첨가된 배양액으로 2회 이상 세척 후 실체현미경하에서 회수하였다. 회수된 난포란은 0.1% PVA가 함유된 D-PBS로 3-4회 세척한 후 등급을 분류하였다. 등급의 분류는 난구세포의 부착정도와 세포질의 충실도에 따라 Wiemer 등(1991)의 난포란 등급분류 방법을 따랐다.
대상 데이터
등급의 분류는 난구세포의 부착정도와 세포질의 충실도에 따라 Wiemer 등(1991)의 난포란 등급분류 방법을 따랐다. 난구세포가 4층 이상이고 세포질이 균일한 것eGrade I, 난구세포가 2-3층인 것은 Grade 口, 난구세포가 한층이거나 나화되었으며, 세포질이 균일한 것은 Grade 皿, 전체가 나화되었고, 퇴화된 것은 Grade IV로 분류하였으며, 이들중 Grade I 과 Grade II 의 난포란만을 본 실험에 사용하였다.
본 실험에 사용된 시약은 특별한 언급이 없는 한 Sigma Chemical Company(St. Louis, MO, USA)의 제품을 사용하였다.
데이터처리
실험결과의 통계학적 분석은 Student's /-test를 이용하여 처리 구 간의 유의성을 검정하였고3<0.05), 결과들은 평균 士 표준편차로 표시하였다.
이론/모형
1% PVA가 함유된 D-PBS로 3-4회 세척한 후 등급을 분류하였다. 등급의 분류는 난구세포의 부착정도와 세포질의 충실도에 따라 Wiemer 등(1991)의 난포란 등급분류 방법을 따랐다. 난구세포가 4층 이상이고 세포질이 균일한 것eGrade I, 난구세포가 2-3층인 것은 Grade 口, 난구세포가 한층이거나 나화되었으며, 세포질이 균일한 것은 Grade 皿, 전체가 나화되었고, 퇴화된 것은 Grade IV로 분류하였으며, 이들중 Grade I 과 Grade II 의 난포란만을 본 실험에 사용하였다.
체외성숙 난자의 핵성숙 정도는 변 등(1991)이 개발한 급속염색법(Rapid staining)-g- 이용하여 Germinal Vesicle(GV), Metaphase I (M I), Metaphase U(MII)의 핵성숙 상태를 형광현미경(Olympus, Tokyo, Japan)하에서 관찰하여 판정하였다.
성능/효과
1. 돼지 미성숙 난포란의 체외성숙 시간별 제2감수분열중 기(MU)까지 성숙된 비율이 체외성숙 38, 40, 42시간째 에 각각 61.1%, 42.9% 및 69.6%를 나타내어 그 비율이 70% 미만으로 낮은 반면, 체외성숙 44, 46, 48시간째에 각각 73.7%, 94.1% 및 100%의 체외성숙률을 나타내어 최소한 44시간 이상의 체외성숙이 필요한 것으로 조사 되었다.
2. 체외배양액의 종류에 따른 배반포 발달률이 NCSU-23 18.8%, PZM-5 16.3%를 나타내 어 유의적인 차이를 보이지 않았으며(p>0.05), 산소분압에 따른 배반포 발달률이 5% 산소분압에서 11.9%, 20%의 산소분압에서 15.8%를 나타내어 두 군간의 유의한 차이는 보이지 않았다 0.05).
3. 체외배양 7일째 발달된 배반포 수정란의 총세포수는 40 개 내 • 외를 나타내었다. 이상의 결과, 돼지 미성숙 난포란의 체외성숙 시간은 44시간 정도가 적정한 것으로 확인되었으며, 서로 다른 배양액과 산소농도가 돼지 체외수정란의 배발달에 있어서 유의적인 차이를 나타내지 못하였다.
Fig. 2에서 보는 바와 같이 5% 산소 분압에서 배양된 수정란의 난할률과 배반포 발달률은 각각 51.7%와 11.9%를 나타낸 반면 20%의 산소 분압에서는 난할률과 배반포 발달률이 각각 62.5%와 15.8%를 나타내 어 두 군간의 유의한 차이는 보이지 않았다0>0.05).
돼지 미성숙 난포란이 정자를 만나 수정을 할 수 있는 시점인 저)2감수분열중기(MU)까지 성숙된 비율은 체외성숙 38, 40, 42시간째에 각각 61.1%, 42.9% 및 69.6%를 나타내어 그 비율이 70% 미만으로 낮은 반면, 체외성숙 44, 46, 48시간째에 각각 73.7%, 94.1% 및 100%의 체외성숙률을 나타내어 최소한 44시간 이상의 체외성숙이 필요한 것으로 조사되었다. 46시간 또는 48시간의 성숙 시간은 높은 비율의 MU 난자를얻을 수는 있지만 난자의 노화를 초래할 수 있기 때문에 본 연구에서는 체외성숙 시간을 44시간으로 고정하였다.
반면, Wright등(1976) 및 Betterbed와 Wright(1985)는 양에서, Johnston 등(1991)은 고양이에서 산소농도가 유의한 발달률의 차이를 보이지 않았다고 보고하였다. 본 연구에서는 산화 스트레스를줄이기 위해 5%의 산소농도를 20% 산소농도와 비교해 보았으나, 두 산소농도간의 유의한 차이를 확인할 수 없었다. 이는Tervit 등(1972), Thompson 등(1990), Lim 등(1999)의 연구결과와 유사하였다.
체외배양 7일째 발달된 배반포 수정란의 총세포수는 40 개 내 • 외를 나타내었다. 이상의 결과, 돼지 미성숙 난포란의 체외성숙 시간은 44시간 정도가 적정한 것으로 확인되었으며, 서로 다른 배양액과 산소농도가 돼지 체외수정란의 배발달에 있어서 유의적인 차이를 나타내지 못하였다.
체외배양 7일째 배반포로의 발달률이 NCSU-23에서 18.8%, PZM-5에서 배양하였을 때 16.3%를 나타내어 유의적인 차이를 보이지 않았다@>0.05). 난할률 역시 유의한 차이를 보이지않았다.
후속연구
본 연구를 바탕으로 배반포 수정란의 생산효율을 높이기 위하여 체외배양 조건을 개선하는 등 좀더 폭넓은 연구가 수행되어져야 할 것으로 사료된다.
구체적인 적용분야로는 형질전환 개체생산을 통한 새로운 품종개량, 질병 저항성 유전자를 보유한 형질전환 돼지 생산, 질환모델 동물개발, 이종 장기이식동물생산 등이 있으며, 멸실위험이 있는 유전자원의 보존을 위해서도 돼지 체외수정란 생산 및 이식은 꾸준하게 연구되어야 하는 생명과학 기술 분야이다. 이러한 연구를 보다 효율적으로 수행하기 위해서는 양질의 수정란을 대량으로 확보하는 것이 선행되어야 한다.
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