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문제 정의
- 이전의 연구에서 이미 dynamin-2가 Ras에 의해 암화된 NIH3T3(Ras) 세포에서 Ras 신호 전달 단백질인 Grb2와의 결합이 확인되었는데[28], 본 연구에서는 이 두 단백질 간의 결합이 각각의 단백질 양의 증가에서 유래하는지 확인하기 위하여 이들의 발현을 비교해 보았다. 그 결과 dynamin-2의 경우 mRNA가 NIH3T3 세포에 비해 NIH3T3(Ras) 세포에서 약 100배 증가하였음을 확인하였고 단백질 발현 또한 증가하였음을 볼 수 있었으나, Grb2는 두 세포에서 mRNA와 단백질 발현의 차이를 볼 수 없었다.
제안 방법
- 10 ug의 분리한 RNA를 6℃에서 5분간 반응 후, 50 unit 의 moloney murine leukemia virus reverse transcriptase를 이용하여 reverse transcription을 수행하였고, dynamin-2와 Grb2특이적인 primer를 이용하여 PCR을 수행하였다. Dynamin-2에 대한 forward primer로 5'-CCACTGGACAACCTC AAGAT-3', reverse primer로 5'~GGTGCTGAGAAGGAGG ATGT-3'을 사용하였고 (dyanmin-2 fragment, 725 bp), Grb2 에 대한 forward primer로 5七GAAGCCATCGCCAAATATG A-3; reverse primer로 5'-TTAGACGTTCCGGTTCACGG-3’을 사용하였다 (Grb2 fragment 651 bp).
- 1% Triton X-100으로 5분간 처리한 후, 비특이적 항체의 반응을 억제하기 위하여 10% BSA (PBS)로 10분간 처리하였다. Anti-mouse dynamin-2로 일차항체로 처리한 후 anti-mouse FITC-conjugated IgG로 2 차 항체를 1시간 반응시켰다. 반응을 마친 세포는 cold PBS 로 수세 한 후 Fluorescent Mounting Medium (DAKO)을 사용하여 포매 하였다.
- Dynamin-2화 Grb2 각각의 PCR fragment 보다 조금 작은 DNA competitor fragments를 PCR MIMIC™ construction kit (Clontech)을 이용하여 만들었다. Dynamin-2의 competitor를 만들기 위하여 v-erbB fragment (Clontech)를 template로 사용하였으며, forward primer로 5'-CCACTGGACA ACCTCAAGATCAAGTTTCGTGAGAGCTGATTG3 reverse primer로5'-GGTGCTGAGAAGGAGGATGTTTGAGTCCA TGGGGAGCTTT3을 사용하여 476 bp의 competitor를 얻게 되었다.
- ">transfei하였다. Membranee 5% skim milk (PBST)로 incubation 한 후, 1차 항체로 dynamin-2 (Upstate Biotechnology Inc.) 와 Grb2 (Upstate Biotechnology Inc.)를 이용하였고, 2차 항체로는 HRP-conjugated antibody (Upstate Biotechnology Inc, )를 사용하여 ECL kit (Amersham)로 단백질의 발현을 확인하였다.
- Mouse genome으로부터 dynamin-2의 promoter 부위 3, 000bp> cloning 하여 pCAT-Basic vector 에 옮겼으며 (pCAT2-3000)z sequencing 하고 PCR을 이용하여 여러 종류의 deletion mutants (pCAT2-2000, pCAT2-1000z pCAT2-500, pCAT2-400, pCAT2-300, pCAT2-200z pCAT2-100)를 제작하였다. Promoter activity를 측정하기 위해서 CAT assay를 수행하였다.
- NIH3T3(Ras) 세포에서 dynamin-2 mRNA의 발현이 증가함을 확인하였으므로 어떠한 전사인자가 dynamin-2 유전자 발현에 중요한 역할을 하는지 알아보고자 dynamin-2의 promotei를 pCAT-Basic vector에 cloning한 후, 여러 종류의 5Z-deletion mutants를 제작하고 이들의 promoter activity (CAT activity)를 NIH3T3(Ras) 세포에서 확인하였다 (Fig. 4A). 각각의 deletion mutant에 대한 promoter activity를 정량해본 결과 start codon (AUG)로부터 300-bp upstream을이상을 포함하고 있는 constiuct들 (pCAT2-300, pCAT2-400z pCAT2-500, PCAT2-1000, pCAT2-2000, pCAT2-3000) 은 모두 상당한 활성을 나타내고 있으나 200-bp만을 가지고 있는 construct (pCAT2-200)의 경우 그 활성이 현저히 감소함을볼 수 있었다 (Fig- 4B).
- NIH3T3(Ras) 세포에서 dynamin-2 단백질의 발현 증가가 dynamin-2 mRNA의 발현 증가로부터 유래하는지 확인하기 위하여 competitive RT-PCR을 수행하였다. 이를 위해 NIH3T3 세포와 NIH3T3(Ras) 세포로부터 추출한 0.
- NIH3T3와 Ras oncoge이 과발현되도록 transfection하여 제작한 NIH3T3(Ras) 세포를 Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM, 10% FBS, penicillin G, streptomycin sulfate, amphotericin B, 2-mercaptoethanol)을 이용하여 37℃ 5% CO2 배양기에서 키웠다.
- Dynamin-2에 대한 forward primer로 5'-CCACTGGACAACCTC AAGAT-3', reverse primer로 5'~GGTGCTGAGAAGGAGG ATGT-3'을 사용하였고 (dyanmin-2 fragment, 725 bp), Grb2 에 대한 forward primer로 5七GAAGCCATCGCCAAATATG A-3; reverse primer로 5'-TTAGACGTTCCGGTTCACGG-3’을 사용하였다 (Grb2 fragment 651 bp). PCR 반응은 시료들을 94℃에서 5분간 변성시킨 후, 94℃30초; 55℃ 30초; 72℃ 1분 30초의 과정을 35회 반복하였고, 마지막으로 72℃ 에서 5분간 처리하였다. PCR 결과물은 1.
- 각 실험에서 transfection efficiency를 보정해 주기위해 pCMV-Pgal vector를 함께 transfection하였으며, p-galactosidase activity를 측정하여 보정하였다. p-galac-tosidase activity는 10 ul의 cell extract를 2.5 mM의 chlorophenol red-p-D-galactopyranoside (CPRG) 와 1.25 mM 의 MgCb와 섞고 37℃에서 1시간 반응 후 574 run에서 홉광도를 측정하여 확인하였다.
- Chloramphenicol-5] acetylation 정도는 PhosphoImager를 이용하여 정량하였다. 각 실험에서 transfection efficiency를 보정해 주기위해 pCMV-Pgal vector를 함께 transfection하였으며, p-galactosidase activity를 측정하여 보정하였다. p-galac-tosidase activity는 10 ul의 cell extract를 2.
- 2)에 10 분간 고정하였다. 고정된 세포를 0.1% Triton X-100으로 5분간 처리한 후, 비특이적 항체의 반응을 억제하기 위하여 10% BSA (PBS)로 10분간 처리하였다. Anti-mouse dynamin-2로 일차항체로 처리한 후 anti-mouse FITC-conjugated IgG로 2 차 항체를 1시간 반응시켰다.
- 하지만 dynamin-2와 Grb2의 발현 자체가 증가한 것인지, 아니면 이들 두 단백질간의 상호작용만이 증가한 것인지는 현재까지 알려진 바가 없다. 따라서 본 연구에서는 이들 세포에서 두 단백질의 발현을 먼저 관찰하였다. 정상적인 NIH3T3 세포와 Ras에 의해 암화된 NIH3T3(Ras) 세포에서 이들 단백질의 발현을 생화학적 인 방법 인 western blot으로 확인한 결과 Grb2 의 경우 발현의 차이를 볼 수 없는 반면 dynamin-2는 NIH3T3(Ras) 세포에서 그 발현이 현저히 증가함을 확인하였다 (Fig.
- competitive RT-PCR을 수행하였다. 이를 위해 NIH3T3 세포와 NIH3T3(Ras) 세포로부터 추출한 0.5 ug의 RNA를 주형으로 하여 cDNA를 합성하고, 다양한 농도의 internal standard (재료 및 방법 참고)와 함께 PCR을 수행하였다. 그 결과 NIH3T3 세포에서는 0.
- 반응을 마친 세포는 cold PBS 로 수세 한 후 Fluorescent Mounting Medium (DAKO)을 사용하여 포매 하였다. 준비 된 시료는 confocal laser scanning microscope (TCS400, LEICA, Inc.)를 사용하여, 각 세포 내 dynamin-2 단백질의 위치를 확인 관찰하고/ SCANware 5.0 (LEICA, Inc.) progiam을 사용하여 사진을 얻은 후, Adobe Photoshop software (Adobe Photosystems, Inu)로 분석하였다.
대상 데이터
- Dynamin-2와 Grb2 단백질의 발현을 확인하기 위해, NIH3T3와 NIH3T3(Ras) 세포를 사용하였다. NIH3T3와 NIH3T3(Ras) 세포를 10 cm dish에 분주하여 배양하고 scrapper# 이용하여 모은 뒤 lysis buffer (50 mM Tris-HCt pH 75 0.
- (Clontech)을 이용하여 만들었다. Dynamin-2의 competitor를 만들기 위하여 v-erbB fragment (Clontech)를 template로 사용하였으며, forward primer로 5'-CCACTGGACA ACCTCAAGATCAAGTTTCGTGAGAGCTGATTG3 reverse primer로5'-GGTGCTGAGAAGGAGGATGTTTGAGTCCA TGGGGAGCTTT3을 사용하여 476 bp의 competitor를 얻게 되었다. 동일한 방법으로 Grb2 특이적 primer를 이용하여 595 bp의 Grb2 competitor를 얻었다.
이론/모형
- Promoter activity를 측정하기 위해서 CAT assay를 수행하였다. CAT assay를 수행하기위한 cell extracts를 만들기위해 각각의 deletion mutant로 transfection한 세포들을 150ul의 0.
- 전체 RNA는 NIH3T3 세포와 NIH3T3(Ras) 세포로부터 acid guanidium thiocyanate-phenol-rhloroform (AGPC) 방법을 이용하여 분리하였다[3]. 분리한 RNA는 A260을 측정하여 정량하였다.
성능/효과
- Competitive PCR을 이용하여 mRNA의 발현 정도를 확인하였을 때, 단백질 발현 정도와 마찬가지로 dynamin-2의 경우 NIH3T3(Ras) 세포에서 약 100배의 증가를 확인하였지만 Grb2의 경우 차이를 볼 수 없었다. Dynamin-2 의 promoter 활성을 NIH3T3(Ras) 세포에서 관찰한 결과 start codon으로부터 300 bp에서 200 bp upstream에 dynamin-2의 promoter 활성을 조절하는 부위가 존재함을 확인할 수 있었다.
- PCR 반응은 시료들을 94℃에서 5분간 변성시킨 후, 94℃30초; 55℃ 30초; 72℃ 1분 30초의 과정을 35회 반복하였고, 마지막으로 72℃ 에서 5분간 처리하였다. PCR 결과물은 1.5% agarose gel에 전기영동과 EtBr 염색으로 확인하였다.
- 이러한 결과를 종합하여 볼 때 NIH3T3 세포에 비해 NIH3.T3(Ras) 세포에서 dynamin-2의 발현이 현저히 증가하였음을 볼 수 있었고, 이 증가한 dynamin-2는 Grb2와 결합하므로 Ras 신호 전달 과정에 관여하거나 암세포의 이동 혹은 endocytosis의 증가를 유발할 것으로 예측할 수 있다.
- 4A). 각각의 deletion mutant에 대한 promoter activity를 정량해본 결과 start codon (AUG)로부터 300-bp upstream을이상을 포함하고 있는 constiuct들 (pCAT2-300, pCAT2-400z pCAT2-500, PCAT2-1000, pCAT2-2000, pCAT2-3000) 은 모두 상당한 활성을 나타내고 있으나 200-bp만을 가지고 있는 construct (pCAT2-200)의 경우 그 활성이 현저히 감소함을볼 수 있었다 (Fig- 4B). 이러한 결과는 start codon으로부터 200-bp와 300-bp upstream 사이에 dynamin-2의 promoter activity를 결정하는 중요한 전사인자들의 결합 위치가 존재함을 의미하는 것이다.
- 1A). 공초점 레이저현미경을 통해 관찰된 dynamin-2는 NIH3T3 세포에서 세포질 내에 전반적으로 분포하고 있었으며, 특히 핵 주변에서 그 발현이 세포질에 집중되어 있음이 확인되었다 (Fig. IB, left panel). 반면 NIH3T3 (Ras) 세포에서는 NIH3T3 세포에 비하여 발현이 증가되었음을 볼 수 있었으며, 세포질 가운데 특히 세포막 쪽에 그 발현이 집중되어 있음을 관찰할 수 있었다 (Fig.
- 5 ug의 RNA를 주형으로 하여 cDNA를 합성하고, 다양한 농도의 internal standard (재료 및 방법 참고)와 함께 PCR을 수행하였다. 그 결과 NIH3T3 세포에서는 0.002 attommole의 internal standard와 함께 PCR을 수행하였을 때 dynamin-2 PCR 산물 (725-bp) 과 internal standard PCR 산물 (476-bp) 의 양이 거의 비슷하였으나, NIH3T3(Ras) 세포에서는 0.2 attommole의 internal standard와 함께 PCR을 수행하였을 때두 산물의 양이 비슷함을 관찰할 수 있었다 (Fig. 2). 이러한 결과는 dynamin-2의 mRNA 양이 NIH3T3 세포에 비해 NIH3T3(Ras) 세포에서 약 100배 증가하였음을 의미하는 것이다.
- 이들의 발현을 비교해 보았다. 그 결과 dynamin-2의 경우 mRNA가 NIH3T3 세포에 비해 NIH3T3(Ras) 세포에서 약 100배 증가하였음을 확인하였고 단백질 발현 또한 증가하였음을 볼 수 있었으나, Grb2는 두 세포에서 mRNA와 단백질 발현의 차이를 볼 수 없었다. 또한 NIH3T3(Ras) 세포에서 dynamin-2의 promoter 분석을 수행하였으며, 그 결과 start codon으로부터 200-bp부터 300-bp upstream부위가 dynamin-2의 promoter 활성을 결정하는 부분임을 확인하였다.
- 그 결과 dynamin-2의 경우 mRNA가 NIH3T3 세포에 비해 NIH3T3(Ras) 세포에서 약 100배 증가하였음을 확인하였고 단백질 발현 또한 증가하였음을 볼 수 있었으나, Grb2는 두 세포에서 mRNA와 단백질 발현의 차이를 볼 수 없었다. 또한 NIH3T3(Ras) 세포에서 dynamin-2의 promoter 분석을 수행하였으며, 그 결과 start codon으로부터 200-bp부터 300-bp upstream부위가 dynamin-2의 promoter 활성을 결정하는 부분임을 확인하였다. 현재는 어떠한 전사인자가 dynamin-2의 promoter 활성을 조절하게 되는지 자세히 연구하고 있다.
- IB, left panel). 반면 NIH3T3 (Ras) 세포에서는 NIH3T3 세포에 비하여 발현이 증가되었음을 볼 수 있었으며, 세포질 가운데 특히 세포막 쪽에 그 발현이 집중되어 있음을 관찰할 수 있었다 (Fig. IB, right panel).
- 하지만 정상적인 세포 (NIH3T3)에 비해 Ras에 의해 암화된 세포 (NIH3T3(Ras))에서 이들 단백질의 발현이 높아지는지에 대해서는 아직 알려진 바가 없다. 본 연구에서는 먼저 NIH3T3 세포와 NIH3T3(Ras) 세포에서 dynamin-2와 Grb2 의 단백질 발현을 보았는데, dynamin-2의 경우 NIH3T3 세포에 비해 NIH3T3(Ras) 세포에서 그 발현이 현저히 증가함을 볼 수 있었지만 Grb2의 경우 두 세포에서 발현의 차이를 관찰할 수 없었다. Competitive PCR을 이용하여 mRNA의 발현 정도를 확인하였을 때, 단백질 발현 정도와 마찬가지로 dynamin-2의 경우 NIH3T3(Ras) 세포에서 약 100배의 증가를 확인하였지만 Grb2의 경우 차이를 볼 수 없었다.
- 현재는 어떠한 전사인자가 dynamin-2의 promoter 활성을 조절하게 되는지 자세히 연구하고 있다. 이러한 결과를 종합하여 볼 때 NIH3T3 세포에 비해 NIH3.T3(Ras) 세포에서 dynamin-2의 발현이 현저히 증가하였음을 볼 수 있었고, 이 증가한 dynamin-2는 Grb2와 결합하므로 Ras 신호 전달 과정에 관여하거나 암세포의 이동 혹은 endocytosis의 증가를 유발할 것으로 예측할 수 있다.
- Endocytosis 과정에 dynamin이 관여하는 것은 이미 정론화 되어 있지만, dynamin이 단지 endocytosis 기능만을 수행하는 단백질인가에 대해서는 아직 논란의 대상이 되고 있는 실정이다. 이러한 연구 결과들을 종합해 보면 dynamin-27} NIH3T3(Ras) 세포에서 증가한다는 본 연구 결과는 dynamin-2가 endocytosis 뿐만 아니라 세포의 다른 활성 (세포이동, vesicle 이동 등)에도 관여할 것임을 예측하게 한다.
- 따라서 본 연구에서는 이들 세포에서 두 단백질의 발현을 먼저 관찰하였다. 정상적인 NIH3T3 세포와 Ras에 의해 암화된 NIH3T3(Ras) 세포에서 이들 단백질의 발현을 생화학적 인 방법 인 western blot으로 확인한 결과 Grb2 의 경우 발현의 차이를 볼 수 없는 반면 dynamin-2는 NIH3T3(Ras) 세포에서 그 발현이 현저히 증가함을 확인하였다 (Fig. 1A). 공초점 레이저현미경을 통해 관찰된 dynamin-2는 NIH3T3 세포에서 세포질 내에 전반적으로 분포하고 있었으며, 특히 핵 주변에서 그 발현이 세포질에 집중되어 있음이 확인되었다 (Fig.
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