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문제 정의
- 본 연구에서는 전통식 및 개량i] 고추장에서 분리된 Bacillus spp. 들을 이용하여 혈전용해활성 및 면역활성과 같은 건강기능 활성이 높은 균주를 탐색하고, 탐색된 균주를 고추장에 첨가함으로써 건강기능활성 고추장을 제조할 목적으로 실험을 수행하였다.
가설 설정
- 2)Culture diluted ten times.
- C: TPP 0014. D: commercial kochujang + TPP 6이3. E: TPP 6013.
제안 방법
- 05%)을 균체에 떨어뜨려 푸른색으로 변하는지 여부를 확인하였다(22). API 50 CHB kit를 이용한 미생물 동정 방법은 1차적으로 동정한 결과에 따라 선택된 지시약이 포함된 kit medium에 균을 멸균 swab을 이용하여 접종 후 strip에 분주하여 24시간 경과 후 판독하여 API analytical profile index로 동정하였다.
- Interleukin la 생성눙: 세포가 부착 후 시료를 처리하여 20시간 동안 배양한 상등액 중의 interleukin-la(IL-la)정량은 Dong 등 (25)에 의한 방법을 변형하여 측정하였다. 즉, 반응성 질소종 생성능 측정 시와 동일한 절차로 RAW 264.
- 이것을 1000 rpm에서 10분간 원심분리 후 상층액을 제거하고 DMSO 150µL 를 첨가하여 생성된 fbmazan 결정을 용해시킨 후, 540nm에서 ELISA reader로 흡광도를 측정하였다. MTT assay에 의해 측정된 대조군과 실험군의 O.D. 값을 다음과 같이 아래의 계산식에 의해 세포독성율을 구하였다.
- Macrophage like cell line인 RAW 264.7 cell(한국세포주은행: KCLB, Seoul, Korea)이 생성한 nitric oxide(NO), interleukin-la (IL시 a) 그리고 tumor necrosis fhctor(TNF-a)양을 측정하여 선별된 미생물 균주의 면역세포 활성능을 조사하였다. 시료는 혈전용해능 실험결과 lysed zone이 크게 형성된 3개의 균주를 100℃에서 30분 처리 후 농도별로 희석하여 사용하였다.
- Nitric oxide: Microplate assay를 이용하여 RAW 264.7 cell의 배양 상등액 중의 nitric oxide(NO) 생성 농도를 정량함으로써 측정 하였다(24). 즉, 96-well plate에 RAW 264.
- Tumor necrosis factor 생성능: 고추장에서 분리한 미생물이 거식 세포의 TNF 생성능을 증진시키는지를 알아보기 위해 고추장 분리 균주를 IL-la 분석 시와 같은 절차로 처리한 후 ELISA를 이용하여 분석하였다. 즉, microtiter plate에 표준 TNF 또는 배양한 균액 및 biotinylated anti-mouse TNF를 50 rL씩 well에 주입하고 실온에서 2시간 배양하였다.
- 제공 받았다. 각각의 회사 공장에서 제조된 시료 20 kge 당일 한국식품연구원으로 고속버스를 이용하여 우송되었으며, 고추장이 제조된 날을 발효 0일째로 하고 각각의 고추장을 30P에서 60일간 발효시키면서 0, 7, 14, 21, 28, 60일에 각각의 고추장 시료의 중심 부분으로부터 시료를 채취하였다.
- 개량i] 및 전통식 고추장에서 순수분리한 균의 단백질 분해능의 측정은 Harrigm과 McCance 방법(21)의 변형된 방법으로 수행하였는데, skim milk 1% 첨가된 표준한천 배지에 균을 접종하여 배양한 후 생성된 집락 주변이 투명해지는 정도를 측정하여 단백질 분해력을 조사하였다.
- soy broth, Difbo)에 배양하여 배양액의 혈전용해능 분석을 실시하였다. 고추장에 균주를 첨가하였을 때의 혈전용해능의 측정을 위하여 시판 고추장을 10배 희석한 후, 고추장 희석액 내의 균이 10' CFU/g 수준이 되도록 조제하여 혈전용해능을 측정하였다. 혈전용해능은 fibrin plate법(31)의 변형된 방법을 사용하였는데, 0.
- 단백질 분해력 측정 결과를 바탕으로 선별된 균주를 TSB (trypticase soy broth, Difbo)에 배양하여 배양액의 혈전용해능 분석을 실시하였다. 고추장에 균주를 첨가하였을 때의 혈전용해능의 측정을 위하여 시판 고추장을 10배 희석한 후, 고추장 희석액 내의 균이 10' CFU/g 수준이 되도록 조제하여 혈전용해능을 측정하였다.
- 미생물의 분리는 미생물 계수에 이용된 표준한천배지(SPC agar. Difco, Sparks, MD, USA)로부터 생성된 모든 집락(약 50개 기준)을 순수분리하였으며, 순수분리된 미생물은 균 집락 형태관찰과 위상차 현미경을 통한 미생물 형태의 관찰, Gram 염색, catalase test, oxidase test를 실시하여 1차적으로 미생물을 분류하였고, 그 결과를 바탕으로 2차적으로 API 50 CHB kit(BioMerieux, Marcy- 1'Etoile, France)를 이용하여 동정하였다. Gram 염색은 Harrigan과 McCance 방법(21)으로 수행하였고, catalase test는 슬라이드 글라스 위에 시험균주를 도말하고, 3% 과산화수소 용액을 떨어뜨려 기포 발생 유무를 관찰하는 방법으로 그리고 oxidase test는 시험균주를 여과지 위에 도말하고 oxidase 측정 시약(AWMMtetrame- thyl-p-phenylediamine-dihydrochloride 0.
- 활성측정은 제조한 fibrin plate에 paper disc(8 mm, Toyo Roshi, Tokyo, Japan)를 놓고 균주 배양액을 30)jL를 점적하고 37>C에서 6시간 동안 반응 후 생성된 투명한 부위의 직경을 조사하였고, 타원형인 경우 가장 긴지름(4)과 가장 짧은 지름(d2)을 측정하여 lyzed zone의 면적(#)을 계산하였다. 생성된 효소의 활성은 plasmin(Sigma, St. Louis, MO, USA)을 농도별로 조제하여 fibrin plate에 30gL씩을 가하여 형성된 lyzed zone 의 면적을 측정한 후 plasmin의 활성의 표준곡선과 비교하여 μg 으로 환산하였다.
- 18 M H2SO4 100 gL 씩 가해 발색반응을 정지시켰다. 이것을 ELISA reader로 파장 540 nm에서 흡광도를 측정하여 작성한 표준곡선에서 IL-la 함량을 계산하였다.
- 여기에 상기의 기질용액을 처리하고 반응정지액으로 발색반응을 정지시켰다. 이것을 ELISA reader로 파장 540nm에서 흡광도를 측정하여 작성한 표준곡선에서 TNF 함량을 계산하였다.
- 5% H)PO4, Sigma)을 첨가하여 실온에서 10분간 반응시켰다. 이때 ELISA reader(Molecular Devices, Union city, CA, USA) 540nm에서 흡광도를 측정하여 sodium nitrite의 검량선으로부터 NO 대사물인 nitrite의 생성정도를 산출하였다.
- 혈전용해능 측정 결과 활성이 가장 높게 나타난 3균주를 이용하여 면역세포 활성화 능력을 조사하였다. 선택된 균주는 전통식 고추장으로 분리된 TPP 0014, TPP 6013 그리고 TPP 6015이다.
- 고추장에 균주를 첨가하였을 때의 혈전용해능의 측정을 위하여 시판 고추장을 10배 희석한 후, 고추장 희석액 내의 균이 10' CFU/g 수준이 되도록 조제하여 혈전용해능을 측정하였다. 혈전용해능은 fibrin plate법(31)의 변형된 방법을 사용하였는데, 0.01 M phosphate buffered saline(pH 7.25)에 fibrino- gen을 0.6%가 되도록 용해시킨 후 petri dish에 10mL을 분주하고 thrombin 20 unit을 가하여 균일한 두께의 fibrin clot을 형성시킨 후 실온에서 30분 방치하여 혈전용해효소 활성 측정에 사용하였다. 활성측정은 제조한 fibrin plate에 paper disc(8 mm, Toyo Roshi, Tokyo, Japan)를 놓고 균주 배양액을 30)jL를 점적하고 37>C에서 6시간 동안 반응 후 생성된 투명한 부위의 직경을 조사하였고, 타원형인 경우 가장 긴지름(4)과 가장 짧은 지름(d2)을 측정하여 lyzed zone의 면적(#)을 계산하였다.
- 6%가 되도록 용해시킨 후 petri dish에 10mL을 분주하고 thrombin 20 unit을 가하여 균일한 두께의 fibrin clot을 형성시킨 후 실온에서 30분 방치하여 혈전용해효소 활성 측정에 사용하였다. 활성측정은 제조한 fibrin plate에 paper disc(8 mm, Toyo Roshi, Tokyo, Japan)를 놓고 균주 배양액을 30)jL를 점적하고 37>C에서 6시간 동안 반응 후 생성된 투명한 부위의 직경을 조사하였고, 타원형인 경우 가장 긴지름(4)과 가장 짧은 지름(d2)을 측정하여 lyzed zone의 면적(#)을 계산하였다. 생성된 효소의 활성은 plasmin(Sigma, St.
대상 데이터
- 시료는 혈전용해능 실험결과 lysed zone이 크게 형성된 3개의 균주를 100℃에서 30분 처리 후 농도별로 희석하여 사용하였다. RAW 264.7 cell linee 10% fetal bovine serum(Gibco, Rockville, MD, USA)과 100x streptomycin-penicillin(Gibco) ]%가 첨가된 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium, with or without phenol red, Gibco) 에배양하였으며, 고착성 (anchorageedependent)을 가지는 세포를 cell scraper(Nunc, Rochester, NY, US A)로 회수, 부유시켜서 사용하였다.
- 실험에 사용된 정상 세포주 CHO-K1 (hamster ovary cell line)과 대장암 세포주 SNU-C4(human colon cancer cell line)는 한국세포주은행(KCLB, Seoul, Korea)으로부터 분양받아 사용하였다. SNU-C4와 CHO-K1 cell linee 10% fetal bovine serum (Gibco)과 lOOx streptomycin-penicillin(Gibco) 1%가 첨가된 RPMI1640 medium(Gibco)에 배양하였으며, 고착성(anchorage-dependent) 을 가지는 세포를 cell scraper로 회수, 부유시켜서 사용하였다. MTT assay는 시료 20gL와 세포 배양에서 얻은 single cell suspension(5X 104 cells/mL) 180 pL를 96-well에 함께 넣어 4일 동안 37℃를 유지하면서 CO, incubatoi에서 배양하였다.
- 면역세포 활성화 능력을 조사하였다. 선택된 균주는 전통식 고추장으로 분리된 TPP 0014, TPP 6013 그리고 TPP 6015이다. 대식세포(macrophage)는 골수로부터 생산되는 면역세포로서, in vitro에서 활성화되면 정상세포와 종양세포를 식별하는 선택성(selectivity)과 비특이성 (non-selectivity)을 동시에 가지며 HQ뿐만 아니라 nitric oxide(NO), tumor necrosis factor(TNF), interleukin- la(IL-la), protease 및 arginase 등을 생성함으로써 종양세포를 살해하는 것으로 알려져 있다(23).
- 실험에 사용된 전통식 및 개량식 고추장 시료는 각각 M사와 D사로부터 제공 받았다. 각각의 회사 공장에서 제조된 시료 20 kge 당일 한국식품연구원으로 고속버스를 이용하여 우송되었으며, 고추장이 제조된 날을 발효 0일째로 하고 각각의 고추장을 30P에서 60일간 발효시키면서 0, 7, 14, 21, 28, 60일에 각각의 고추장 시료의 중심 부분으로부터 시료를 채취하였다.
- 4)으로 2회 세척하였고, 10(TC에서 30분 처리한 시료를 농도 별로 희석하여 사용하였다. 실험에 사용된 정상 세포주 CHO-K1 (hamster ovary cell line)과 대장암 세포주 SNU-C4(human colon cancer cell line)는 한국세포주은행(KCLB, Seoul, Korea)으로부터 분양받아 사용하였다. SNU-C4와 CHO-K1 cell linee 10% fetal bovine serum (Gibco)과 lOOx streptomycin-penicillin(Gibco) 1%가 첨가된 RPMI1640 medium(Gibco)에 배양하였으며, 고착성(anchorage-dependent) 을 가지는 세포를 cell scraper로 회수, 부유시켜서 사용하였다.
데이터처리
- 실험결과는 Statistics Analysis System(SAS) 프로그램을 이용하여 통계분석하였고 그 결과는 평균값과 표준편차로 나타내었다.
성능/효과
- 1'Other carbon sources which were not assimilated by all three strains were erythritol, D-arabinose, L-xylose, adonitol, p-methyl-D-xyloside, galactose, sorbose, rhamnose, dulcitol, inositol, a-methyl-D-mannoside, melibiose, inulin, melezitose, xylitol, D-turanose, D-lyxose, D-tagtose, D- fucose, L-fucose, D-arabitol, L-Arabitol, Gluconate, 2-keto-gluconate and 5-keto-gluconate. 2)Other carbon sources which were assimilated by all three strains were fructose, mannose, mannitol, esculin, celiobiose, maltose, sucrose, trehalose, starch, glycogen and gentiobiose.
- 5-keto-gluconate. 2)Other carbon sources which were assimilated by all three strains were fructose, mannose, mannitol, esculin, celiobiose, maltose, sucrose, trehalose, starch, glycogen and gentiobiose.
- 인간 대장암 유래의 암 세포주인 SNU-C4와 정상세포인 CHO-KI 에 대한 시료처리 결과, 대 장암세포인 SNU-C4에 대하여 시료농도가 높을수록 높은 저해능 을 보여주었으며, 시료농도 3mg/mL의 경우 TPP 0014, TPP 6013, TPP 6015 그리고 대조군으로 사용한 Bacillus natto 균의 경우 모두 65-78% 이상의 높은 암세포 저해활성을 보였다. CHO- K1 세포의 경우도 시료처리 농도가 높을수록 높은 저해능을 보였으나, 3mg/mL로 시료 처리 시 모든 균에서 암세포 보다 조금 낮은 65-75% 정도의 세포 독성을 나타내었다. 이와 같은 결과는 kefir grain에서 분리한 유산균이 생산하는 다당류를 암세포주인 SNU-C4와 정상세포주인 CHO-K1에 처리하였을 때의 세포독성을 조사한 Park(30)의 연구 결과와 비교 시 분리 균주들이 생산한 다당류를 130mg/mL 농도로 처리하였을 때의 SNU-C4에 대한 세포독성이 약 60-80%로 측정되어 본 실험에서의 선발 균주 세포독성이 비교적 높은 것을 확인할 수 있었다.
- 선별균주(TPP 0014, 6013, 6015)를 이용하여 macrophage 세 포(RAW 264,7) 모델계에서 IL-la 생성정도를 ELISA방법에 의해 측정한 결과는 Table 4에서 보여주는 것과 같다. IL-la의 생성량 은 선별된 TPP 0014, TPP 6013 그리고 TPP 6015 균주보다 청 국장 특허균인 CHKJ 1339이 유의적으로 높은 것으로 조사되었다. 실험에 이용된 시료 중에서 TPP 6013균주가 원액에서는 689 ± 15.
- 고추장 시료의 채취는 처음 1개월 간은 일주일 간격으로 7, 14, 21, 28일에 시료를 채취하였고 시료당 약 50개씩의 미생물을 순수 분리하여, 균 집락 형태관찰과 위상차 현미경을 통한 미생물 형태의 관찰, Gram 염색, catalase test, oxidase test를 실시하여 1차적으로 미생물을 동정한 결과 모든 분리 미생물이 Bacillus로 주정되는 Gram 양성, catalase positive, oxidase positive 미생물인 것이 밝혀져, Table 1에서 보여주는 것과 같이 고추장 발효 0일째와 28일째 그리고 60일째의 시료로부터 분리된 미생물들은 이용하여 단백질 분해력을 측정하였다. Skim milk 를 1% 첨가한 SPC agar에 균주를 접종한 후 생성된 clear zone 의 크기를 측정하여 단백질 분해력을 조사한 결과 Table 1에서 보여주는 것과 같이 개량식 고추장에서는 약 24%의 미생물이 (146개의 미생물 중 35개) 그리고 전통식 고추장에서는 약 38% 의 미생물이(148개의 미생물 중 56개) 가장 높은 단백질 분해 활성을 보여 이들 균주들을 이용하여 계속적인 혈전용해 활성을 조사하였다.
- 같다. 고추장 시료의 채취는 처음 1개월 간은 일주일 간격으로 7, 14, 21, 28일에 시료를 채취하였고 시료당 약 50개씩의 미생물을 순수 분리하여, 균 집락 형태관찰과 위상차 현미경을 통한 미생물 형태의 관찰, Gram 염색, catalase test, oxidase test를 실시하여 1차적으로 미생물을 동정한 결과 모든 분리 미생물이 Bacillus로 주정되는 Gram 양성, catalase positive, oxidase positive 미생물인 것이 밝혀져, Table 1에서 보여주는 것과 같이 고추장 발효 0일째와 28일째 그리고 60일째의 시료로부터 분리된 미생물들은 이용하여 단백질 분해력을 측정하였다. Skim milk 를 1% 첨가한 SPC agar에 균주를 접종한 후 생성된 clear zone 의 크기를 측정하여 단백질 분해력을 조사한 결과 Table 1에서 보여주는 것과 같이 개량식 고추장에서는 약 24%의 미생물이 (146개의 미생물 중 35개) 그리고 전통식 고추장에서는 약 38% 의 미생물이(148개의 미생물 중 56개) 가장 높은 단백질 분해 활성을 보여 이들 균주들을 이용하여 계속적인 혈전용해 활성을 조사하였다.
- Table 4에서 볼 수 있는 것과 같이 TPP 6015 균주를 제외한 두 균주들은 청국장 특허균(20)과 비교하여 유의적으로 낮은 TNF-a 생성량을 나타내었다. 또한 TPP 6015 균주의 10배 희석 시료에 있어서도 특허균주보다 유의적으로 낮은 TNF-a 생 성값을 나티내었다. 이러한 결과는 함초에서 분리한 polysaccharides 를 이용한 대식세포의 TNF-a 생성량을 조사한 1m 등(28)의 결과와는 큰 차이를 보여주고 있는데, Im 등(28)의 결과에서는 시료의 희석에 의한 TNF-a 생성이 정비례적으로 감소하고 있으나, 본 실험에서는 정비례적으로 감소하고 있지 않아 이러한 결과의 차이가 시료의 차이에 의한 것인지 혹은 정량방법의 차이에 의한 것인지는 추후 확인 검증 실험이 필요하다.
- 미생물을 TSB(trypticase soy broth) 배지에 접종하여 배양한 후 배양액을 이용하여 fibrin plate 방법을 이용한 혈전용해 활성 측정 결과, 개량식 고추장의 경우 Table 3에서 보여주는 것과 같이 plasmin 20의 혈전용해능을 가진 미생물은 35개의 미생물 중 두 개(CPP 6002, CPP 6004)로 5.7%인 반면에, 전통식 고추장의 경우는 Table 2에서 보여주는 것과 같이 plasmin 20 이상의 혈전용해능을 가진 미생물은 56개의 미생물 중 16개로 28.6%의 높은 비율의 혈전용해 활성을 나타내 주었으며, 전통식 고추장 미생물의 경우 개량^ 고추장 미생물과 비교하여 대체적으로 높은 혈전용해 활성을 보여주고 있다(Table 2, 3). 이들 전통식 고추장 미생물 중 혈전용해능이 높게 측정되었던 TPP 0014, TPP 6013 그리고 TPP 6015 미생물 균주의 혈전용해 활성을 다른 미생물 균주들과 비교한 실험은 Fig.
- IL-la의 생성량 은 선별된 TPP 0014, TPP 6013 그리고 TPP 6015 균주보다 청 국장 특허균인 CHKJ 1339이 유의적으로 높은 것으로 조사되었다. 실험에 이용된 시료 중에서 TPP 6013균주가 원액에서는 689 ± 15.46pg/mL, 10배 희석액에서는 170.4± 14.59pg/mL의 IL-la의 생성량을 보여주고 있어 비교적 높은 값을 나타내었다.
- Table 5에서 볼 수 있는 것과 같.이 선별균주 TPP 0014와 TPP 6015는 Bacillus stearother- mophihis로 동정되었고, TPP 6015는 B. amyloliquefacienceS. 동정이 되었다.
- CHO- K1 세포의 경우도 시료처리 농도가 높을수록 높은 저해능을 보였으나, 3mg/mL로 시료 처리 시 모든 균에서 암세포 보다 조금 낮은 65-75% 정도의 세포 독성을 나타내었다. 이와 같은 결과는 kefir grain에서 분리한 유산균이 생산하는 다당류를 암세포주인 SNU-C4와 정상세포주인 CHO-K1에 처리하였을 때의 세포독성을 조사한 Park(30)의 연구 결과와 비교 시 분리 균주들이 생산한 다당류를 130mg/mL 농도로 처리하였을 때의 SNU-C4에 대한 세포독성이 약 60-80%로 측정되어 본 실험에서의 선발 균주 세포독성이 비교적 높은 것을 확인할 수 있었다.
- 3에서 보여주는 것과 같다. 인간 대장암 유래의 암 세포주인 SNU-C4와 정상세포인 CHO-KI 에 대한 시료처리 결과, 대 장암세포인 SNU-C4에 대하여 시료농도가 높을수록 높은 저해능 을 보여주었으며, 시료농도 3mg/mL의 경우 TPP 0014, TPP 6013, TPP 6015 그리고 대조군으로 사용한 Bacillus natto 균의 경우 모두 65-78% 이상의 높은 암세포 저해활성을 보였다. CHO- K1 세포의 경우도 시료처리 농도가 높을수록 높은 저해능을 보였으나, 3mg/mL로 시료 처리 시 모든 균에서 암세포 보다 조금 낮은 65-75% 정도의 세포 독성을 나타내었다.
후속연구
- 2 에서 보여주는 것과 같다. Fig. 2에서 볼 수 있는 것과 같이 고추장은 혈전용해 활성을 보여주지 않았으나, 혈전용해 활성이 있는 균주를 고추장에 첨가 하였을 때는 높은 혈전용해 활성을 보여 주었으며, 고추장에 균주를 첨가하였을 때의 혈전용해 활성은 균주만 이용하여 측정한 혈전용해 활성보다 오히려 높은 혈전 용해 활성을 나타내고 있음을 Fig. 2에서 볼 수가 있는데, 이와 같은 결과가 고추장과 균주가 함께 작용하여 상승효과를 나타낸 것인지는 계속적인 검증실험이 필요하리라 본다.
- 또한 TPP 6015 균주의 10배 희석 시료에 있어서도 특허균주보다 유의적으로 낮은 TNF-a 생 성값을 나티내었다. 이러한 결과는 함초에서 분리한 polysaccharides 를 이용한 대식세포의 TNF-a 생성량을 조사한 1m 등(28)의 결과와는 큰 차이를 보여주고 있는데, Im 등(28)의 결과에서는 시료의 희석에 의한 TNF-a 생성이 정비례적으로 감소하고 있으나, 본 실험에서는 정비례적으로 감소하고 있지 않아 이러한 결과의 차이가 시료의 차이에 의한 것인지 혹은 정량방법의 차이에 의한 것인지는 추후 확인 검증 실험이 필요하다. 활성화된 대식세 포로부터 생성되어 항균 및 항암작용에 영향을 미치는 interleukinla(IL-la)는 17kDa의 단백질로서 T cell의 생산을 증가시키고 B cell의 활성화 및 항체생산을 증가시키는 둥 생체 내 여러 면역 기능조절에 관여하는 면역 조절 물질 중의 하나로 알려져 있다.
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